Pankreas intravital görüntüleme penceresine sahip bir Murine Modelinde Pankreasın Stabilize Boyuna In Vivo Hücresel Düzey Görselleştirmesi
6 Mayıs 2021
Pankreasın in vivo yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi pankreas intravital görüntüleme penceresi ile kolaylaştırıldı.
Bu protokol, pankreasın stabilize ve tekrarlayan hücresel düzeyde in vivo görüntülemesini yeni bir pankreas intravital görüntüleme penceresi ile açıklar. Bu tekniğin temel avantajı, canlı bir farenin pankreasında üç hafta boyunca hücresel seviyeye kadar çözünürlükle hareketsiz, üç boyutlu görüntülemenin yapılanın mümkün olmasıdır. Cerrahi platformu hazırlayarak ve yüzeyleri % 70 etanol ile dezenfekte ederek başlayın.
Anesteziden sonra, vücut sıcaklığını izlemek için homeotermik kontrollü bir ısıtma yastığı ile bir rektal prob kullanın. Farenin sol kanadından saçları çıkarın ve alternatif olarak alkol ve iyot uygulayın, kesi bölgesinden dış yüzeye döner, asla kesi bölgesine geri dönmez ve iyotla sona erer. Ardından, farenin sol kanadında cildi ve kası keserek 1,5 santimetrelik bir kesi yapın.
Kesi kenar boşluğunda bir çanta dize dikişi gerçekleştirmek için siyah veya naylon 4-0 dikiş kullanın. Dalağını halka tokparlamaları ile dikkatlice çekin ve pankreası tanımlayın. Pencereyi farenin kanadına yerleştirerek, dalak ve pankreası pencerenin açık alanından geçirin.
Daha sonra, dalağını pencerenin açık alanına yerleştirirken pankreası yavaşça görüntüleme penceresinin plakasına yerleştirin. PANC-1 nüklit kırmızısını doğrudan pankreasa enjekte edin. Görüntüleme penceresinin kenar boşluğuna n-Butyl siyanoakrilat tutkal damlaları uygulamak için 31 kalibrelik bir kateter iğnesi kullanın ve minimum miktarda tutkal uygulanmasını sağlayın.
Görüntüleme penceresinin kenar boşluğuna hafifçe 12 milimetrelik yuvarlak bir kapak camı uygulayın. Ardından, pencerenin yanal oluğuna sığacak şekilde dikiş halkasını tutun ve üç kez bağlayın. Son olarak, fareler uyanıkken bu sıkı dikişlerin kesilmesini önlemek için kravatın maksimum proksimal bölgesini kesin.
Lazer gücü de dahil olmak üzere intravital mikroskobu açarak başlayın. Vasküler kateter takmak için, kuyruğun proksimal tarafına işaret ve üçüncü parmakla basınç uygulayın. Gerekirse kuyruğu bir lamba ile ısıtın.
Kuyruk damarını% 70 etanol spreyi ile dezenfekte edin, ardından yanal kuyruk damarına 30-gauge bir kateter yerleştirin ve PE-10 tüpündeki kanın kusmasını görselleştirin. Stabilize etmek için katetere ipek bant uygulayın. Floresan probların kombinasyonuna göre FITC dektran ve TMR dektran veya diğer floresan probları uygun şekilde enjekte edin.
Homeotermik ısıtma yastığı sistemi ile vücut sıcaklığını otomatik olarak kontrol etmek için bir rektal prob takın. Ardından intravital mikroskopi kurulumu sırasında hazırlanan pankreas görüntüleme penceresini pencere tutucusuna yerleştirin. Fareyi cerrahi platformdan görüntüleme aşamasına aktarın.
İntravital görüntüleme yapmak için pankreasın pankreası, pankreasın tüm görünümünü pankreas görüntüleme penceresinde taramak için dört kez gibi düşük bir büyütmede görüntüleme ile başlayın. İlgi alanı belirlendikten sonra, sırasıyla yaklaşık 0,5 mikrometre ve 3 mikrometre yanal ve eksenel çözünürlükte hücresel düzeyde görüntüleme yapmak için 20 kez veya 40 kez daha yüksek bir büyütme objektif lensine geçin. 3D yapıyı veya hücre geçişi gibi hücre düzeyindeki dinamikleri gözlemlemek için Z yığını veya hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.
Pankreas intravital görüntüleme penceresi ile birlikte intravital mikroskopi, tek tek adacıkları üç haftaya kadar izlemek için yüksek çözünürlüklü görüntülemenin edinilmesini sağlayan uzun süreli doku stabilitesi sağlar. Damardan enjekte edilen anti-CD31 antikorlu C57 siyah 6 N fareye yerleştirilen pencere, Alexa 647 floroforu ile konjuge edildi, geniş alan görüntülemesini kolaylaştırdı ve pankreasın 3D görüntülemesini büyüttü. Acinar hücreleri, sırasıyla otofluoresans ve anti-CD31 antikoru kullanılarak görselleştirilen bitişik vaskültürdeki pankreas dokusunun ortalama görüntülerinde tanımlanmıştır.
Geniş alan görünümünü yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile birleştiren mozaik görüntüleme yöntemi kullanılarak, mip-GFP faresinde bitişik vaskülat ile yaklaşık 40 ila 50 adacık görselleştirildi. Daha önceki bir çalışma, adacıkların bu kararlı görüntüleme yöntemi kullanılarak üç haftaya kadar izlenebileceğini göstermiştir. Kanser hücrelerini görselleştirmek için, PANC-1 nüklit kırmızı hücreleri ameliyat sırasında doğrudan fare pankreasına yerleştirildi ve yakındaki damarlar Alexa 647 ile konjuge anti-CD31 ile boyandı.
Bu protokol kullanılarak pankreas kanserinin geniş alan görüntüleri oluşturulmuştur. Bu, tümörün kenar boşluğunun tanımlamasına ve tek hücre düzeyinde yüksek çözünürlüklü 3D görüntüler elde etmeye yardımcı oldu. Bu yöntemdeki en kritik adım, pankreas görüntüleme penceresinin fareye ustaca yerleştirilmesidir.
Floresan fare hücrelerinin ve antikor problarının diğer kombinasyonları kullanılarak, yakındaki hücrelerin adacıklarla dinamik etkileşimi veya hücreleri iptal etmek tanımlanabilir. Bu yöntem, çeşitli patofizyolojik koşullarda ve pankreas kanseri in situ mikro ortamlarında adacığın değişimini araştıranlar tarafından yaygın olarak uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, yeni bir pankreatik intravital görüntüleme penceresi kullanarak pankreasın stabilize ve tekrarlayan hücresel seviyesinde in vivo görüntüleme için bir protokol sunmaktadır. Bu teknik, canlı farelerde üç hafta boyunca hücresel çözünürlükte hareketsiz, üç boyutlu görüntüleme sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- In vivo görüntüleme
Arka Plan
- In vivo görüntüleme teknikleri, organ fonksiyonlarını incelemek için kritik öneme sahiptir.
- Pankreas, metabolik süreçlerde hayati bir rol oynar.
- Geleneksel görüntüleme yöntemleri yeterli çözünürlük sağlamayabilir.
- Pankreatik intravital görüntüleme penceresi yeni bir yaklaşım sunar.
Çalışmanın Amacı
- Pankreasın yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemi geliştirmek.
- Pankreatik hücresel dinamiklerin uzun süreli gözlemini sağlamak.
- Canlı modellerde pankreas fonksiyonlarının anlaşılmasını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Cerrahi platformun hazırlanması ve dezenfeksiyonu.
- Farenin anestezi altına alınması ve sıcaklık izleme.
- Sol yan tarafta tüy alma ve cilt kesimi.
- Intravital pencere aracılığıyla görüntüleme tekniklerinin uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Üç hafta boyunca pankreatik hücrelerin başarılı görüntülemesinin sağlanması.
- Yüksek çözünürlüklü, hareketsiz üç boyutlu görüntülerin elde edilmesi.
- Pankreatik intravital görüntüleme penceresinin uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- Pankreatik hastalıkların incelenmesinde potansiyel uygulamaların gösterilmesi.
Sonuçlar
- Pankreatik intravital görüntüleme penceresi araştırmacılar için değerli bir araçtır.
- Bu yöntem, pankreas biyolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.
- Gelecekteki çalışmalar bu tekniği çeşitli uygulamalar için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Stabilized longitudinal in vivo cellular-level imaging of the murine pancreas addresses a critical gap in preclinical model fidelity for pancreatic disease research. This method enables high-resolution, motionless visualization and tracking of islets and cancer cells over several weeks, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery and translational studies. The approach enhances the ability to interrogate dynamic cellular processes and microenvironmental changes relevant to disease progression and therapeutic intervention.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of pancreatic islet and tumor cell dynamics in situ over time.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular interactions and microenvironmental changes.
- Facilitates functional target validation through longitudinal tracking of disease-relevant cell populations.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by providing robust, quantitative imaging data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo systems for downstream compound evaluation and phenotypic screening.
- Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for assay standardization.
- Enables scalable, high-content imaging workflows for screening candidate interventions.
- Supports reliable evaluation of compound effects on pancreatic microstructure and cell behavior.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant cellular and microenvironmental features.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal biomarker tracking.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on dynamic, in vivo imaging evidence.
- Enhances translational relevance by modeling pathophysiological processes in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging window method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational biomarker studies in live animal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of pancreatic cell dynamics and microenvironmental interactions.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for compound screening and assay development.
- Analytics: Delivers high-resolution, longitudinal readouts for comparative analysis of disease progression and intervention effects.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by supporting biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse pancreatic disease and intervention studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pancreatic disease models.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of pancreatic disease programs.
Implementation Considerations
- Requires surgical expertise for precise imaging window implantation.
- Demands access to advanced intravital microscopy and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis.
- Adaptation may be needed for different murine strains or disease models.
- Longitudinal imaging stability depends on technical proficiency and animal care.
