Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini Incelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonun Kullanılması
9 Haziran 2021
Burada, fare beyinciğindeki granül nöronların sinaptogenezini, doğum sonrası beyin gelişiminin zaman boyunca, bu hücreler sinaptik yapılarını rafine ettiklerinde ve kendilerini genel beyin devresine entegre etmek için sinapslar oluşturduklarında görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.
Protokol, anahtar morfolojik büyümeyi görselleştirmek için gelişimin farklı aşamalarında serebellar granül nöronları inceler. Tekniğin avantajları, hücreye özgü hedefleme, transfekte yapıların hızlı ekspresyonu ve hücre özerk etkilerinin incelenmesine izin veren hücrelerin seyrek etiketlenmesini içerir. Bir yükleme pipeti ucundan 11,2 milimetrelik bir segmenti keserek başlayın ve enjeksiyon derinliğini 1,5 milimetre ile sınırlamak için kesilen parçayı Hamilton şırıngasının ucuna ara parça olarak yerleştirin.
Ara parçayı şırınga ucuna yapıştırıcı veya parafilm ile sabitleyin. Deneysel yavrunun sagital beyin bölümlerinden tek elektroporated CGN'lerin morfolojisini incelemek için, konfokal mikroskopta yığın başına 0.5 mikrometrede Z-yığını görüntüleri alın. Kolay görüntü analizi ve 3D yeniden yapılandırma sağlamak için görüntü penceresi başına bir hücre görüntüleyin.
Basit nörit izleyici kullanarak nörit uzunluğunu ve dendritik pençe oluşumunu kör bir şekilde analiz edin. Elektroporated CGN'lerin tek kanallı Z-stack görüntülerini Fiji'ye yükleyin ve açılır menüden Eklentiler"Segmentasyon" ve Basit Nörit Tracer"Yeni 3D Görüntüleyici Oluştur'u seçin" e tıklayın. Soma hücresine bağlanan bir dendritin tabanına kaydırın ve kavşağa tıklayarak bir yol başlatın.
Hücre doldurma sinyalinin en parlak olduğu bölümleri tıklatıp izi korumak için Y tuşuna basarak yolu manuel olarak izleyin. Dendritin sonuna kadar izleyin ve F.Alternatif olarak, pençenin tabanına kadar izleyin. Daha sonra, pençeyi yapının tabanından en uzun nöritin sonuna kadar izleyin.
Pencerelerde Control tuşunu veya macOS'te ALT tuşunu basılı tutup yolu tıklayarak ikincil ve üçüncül dalları izleyin. F.İzlemelerin ölçümlerinin ayrı bir pencerede görünür olduğunu gözlemleyin tuşuna basarak yolu onaylayın. Her pençe için toplam uzunluğu elde etmek için pençe dallarının tüm boyutlarını toplayın.
Temsili analizde, enjeksiyondan 3 ila 14 gün sonra elektroporated CGN'lerin projeksiyon görüntüleri, dendrit sayısında ilerleyici bir düşüş göstermiştir. CGN'ler bir dendritik büyüme aşamasına tabi tutuldu, ardından 3 DPI'dan 7 DPI'ya rafine edildi ve bu da fazla dendritlerin% 50'sinden fazlasının budamasıyla sonuçlandı. Bu olay, her bir dendritin sonunda pençe benzeri yapıların oluşumunda kalan arborsların kademeli olarak uzaması ile çakışmaktadır ve bu gelişimsel süreçlerin eşzamanlı olarak gerçekleştiğini göstermektedir.
7 DPI ile, dendritlerin kabaca% 75'inde pençeler bulundu. Etiketli CGN'lerin her biri, toplam somato-dendritik yüzey alanını ve hacmini ölçmek için NMRS'de yeniden yapılandırıldı. CGN boyutunda gelişim boyunca anlamlı bir fark gözlenmedi.
7 DPI'da olmasına rağmen, CGN'ler 3, 5 ve 10 DPI'ya kıyasla hacimde% 20'lik önemli bir düşüş sergiledi. Prosedürdeki en önemli şey, enjeksiyondan önce beyinciği doğru bir şekilde bulmaktır. Yöntem, shRNA'ların, siRNA'ların veya Cre Rekombinaz'ın transfeksiyonu yoluyla granül nöron gelişimindeki rollerini incelemek için genleri in vivo olarak genetik olarak manipüle etmek için uyarlanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, in vivo elektroporasyon kullanarak gelişmekte olan fare serebelluminde serebellar granül nöronların (CGN'ler) morfolojik gelişimini incelemek için bir protokol sunmaktadır. Bu teknik, CGN'lerin seyrek etiketlenmesine ve genetik manipülasyonuna olanak tanıyarak, temel gelişim aşamaları boyunca dendritik büyümenin, pençe oluşumunun ve sinaptogenezin ayrıntılı analizine imkan sağlar. Yöntem, CGN olgunlaşmasını zaman içinde takip etmek için hassas enjeksiyonu, konfokal görüntülemeyi ve kantitatif morfometrik analizi birleştirir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişim Biyolojisi
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Nöronlar, beyin gelişimi sırasında önemli yapısal ve fonksiyonel değişiklikler geçirir.
- Kemirgen serebellumu, tek hücreli morfogenezin, özellikle de CGN'lerin incelenmesi için bir model sistemdir.
- CGN'ler, sinaptik girdi için kritik olan özelleşmiş dendritik pençeler oluşturur.
- Geleneksel etiketleme yöntemları genellikle hücre özgüllüğünden veya zamansal çözünürlükten yoksundur.
Çalışmanın Amacı
- Bireysel CGN'lerin in vivo morfolojik gelişimini görselleştirmek ve nicelleştirmek.
- Gelişimsel zaman noktaları boyunca dendritik büyümeyi, budanmayı ve pençe oluşumunu takip etmek.
- CGN'lerin hücreye özgü genetik manipülasyonu için bir platform sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Gelişmekte olan fare serebellumunda granül nöron öncüllerinin in vivo elektroporasyonu.
- Net morfolojik analiz için CGN'lerin seyrek etiketlenmesi.
- 3D rekonstrüksiyon için Z-stack görüntüleme ile konfokal mikroskopi.
- Fiji ve Simple Neurite Tracer kullanılarak nörit uzunluğunun ve dendritik pençe yapılarının manuel takibi ve miktar tayini.
Ana Sonuçlar
- Enjeksiyondan sonraki 3 ile 14. günler (DPI) arasındaki projeksiyon görüntüleri, CGN başına dendrit sayısında kademeli bir azalma olduğunu ortaya koymuştur.
- 3 ile 7. DPI arasında, CGN'ler dendritik budamaya uğrayarak fazla dendritlerin %50'den fazlasını elemiştir.
- Kalan dendritlerin uçlarında pençe benzeri yapılar oluşmuş ve 7. DPI itibarıyla dendritlerin yaklaşık %75'inde pençeler görülmüştür.
- CGN boyutu büyük ölçüde tutarlı kalmış olsa da, diğer zaman noktalarıyla karşılaştırıldığında 7. DPI'da hacimde %20'lik belirgin bir azalma gözlemlenmiştir.
Sonuçlar
- Protokol, CGN morfolojik gelişiminin in vivo ortamda hücreye özgü ayrıntılı analizine olanak tanır.
- Dendritik budanma ve pençe oluşumu, CGN olgunlaşması sırasında eş zamanlı gerçekleşen süreçlerdir.
- Yöntem, CGN gelişiminde gen fonksiyonunu incelemek için genetik manipülasyona uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Serebellar granül nöron (CGN) morfolojisinin ve sinaps gelişiminin kantitatif in vivo analizi, nörogelişimsel hedef doğrulamasında öngörülebilir güvenilirlik açısından kritik bir ihtiyaca cevap vermektedir. Seyrek etiketleme ve genetik manipülasyon yetenekleri, MSS keşfinin en erken aşamalarında mekanistik risk azaltmaya olanak tanır. Bu yaklaşım, hücresel morfogenezi sinaptik entegrasyonla ilişkilendirerek nörobiyoloji odaklı Ar-Ge'deki portföy kararlarını bilgilendirir ve translasyonel sürekliliği destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- CGN morfojenizi ve sinaptogenezinde gen fonksiyonunun doğrudan sorgulanmasına olanak tanır.
- İn vivo ortamda hücre-otonom etkileri izole ederek mekanistik risklerin azaltılmasını destekler.
- Hipotez odaklı hedef doğrulaması için kantitatif veriler sağlar.
- Morfolojik ve sinaptik fenotiplere dayanarak nörogelişimsel hedeflerin önceliklendirilmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Nöronal morfoloji için valide edilmiş,le tekrarlanabilir görüntüleme ve analiz iş akışları oluşturur.
- Alt akış taramaları için dendrit sayısı, pençe oluşumu ve nörit uzunluğu gibi kantitatif metrikler sağlar.
- Körleme yöntemiyle, yazılım destekli morfometrik analiz yoluyla assay standardizasyonuna olanak tanır.
- MSS hatlarındaki bileşik veya genetik taramalar için sağlam biyolojik sistemler hazırlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Kemirgen modellerinde morfolojik fenotipleri hastalıkla ilişkili sinaptik gelişimle ilişkilendirir.
- Nörogelişimsel müdahalelerin erken keşif aşamasından preklinik doğrulamasına kadar olan sürekliliği destekler.
- Sinaptik olgunlaşmanın translasyonel biyobelirteçlerini değerlendirmek için bir platform sağlar.
- Hücresel değişiklikleri fonksiyonel sinaptik sonuçlarla ilişkilendirerek ilerleme sürecindeki riskleri azaltır.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu yöntem, MSS araştırmalarında erken keşiften öncü bileşik belirleme aşamasına kadar olan süreci entegre ederek, yinelemeli hipotez testine ve genetik veya farmakolojik müdahalelerin kantitatif fenotiplemesine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Nöronal morfogenez ve sinaps oluşumunda gen fonksiyonu için sıfır hipotezi testini destekler.
- Tarama: Dendritik ve sinaptik yapı analizi için tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitik: Neurite uzunluğu, dendritik pençeler ve hücre hacminin körleme yöntemiyle, yazılım destekli ölçümünü sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hücresel fenotipleri in vivo ortamdaki hastalıkla ilişkili sinaptik gelişimle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Keşif programları genelinde çeşitli genetik manipülasyonlara ve MSS model sistemlerine uyarlanabilir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nörogelişimsel hedef doğrulamasında ve mekanistik risk azaltmada öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik için in vivo görüntülemeyi ve morfometrik analizi standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Gen pertürbasyonunu ölçülebilir nöronal fenotiplerle ilişkilendirerek devam/dur kararlarına bilgi sağlar.
- Portföy Etkisi: Güçlü in vivo verilere dayanarak CNS hedeflerinin riskle uyumlu önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Kemirgen nöroanatomisi ve hassas stereotaktik enjeksiyon teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Konfokal mikroskopiye ve gelişmiş görüntü analiz yazılımlarına (örneğin Fiji, Simple Neurite Tracer) erişim gerektirir.
- Kör analiz ve veri yorumlaması için ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Hücre-otonom çalışmalar için çeşitli genetik konstrüktlara (shRNA, siRNA, Cre Rekombinaz) uyarlanabilir.
- Sürekli tekrarlanabilir sonuçlar için enjeksiyon doğruluğu ve hücre etiketleme verimliliği kritik öneme sahiptir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Preparing the Injection Syringe for Electroporation
2:34
Results: Analysis of Granule Neuron Morphology and Size During Cerebellar Development
3:45
Conclusion
1:00
Morphological Analyses of Cerebellar Granule Neurons (CGNs): 3D Reconstruction
