MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve Yukarıdan Aşağıya Proteomik Analiz kullanılarak Escherichia coli'de Antibakteriyel Bağışıklık Proteinlerinin Tanımlanması

Protokol, antibiyotik indüksiyonu ve kütle spektrometresi kullanılarak bakteriyel proteinlerin tanımlanması için hızlı bir yöntem göstermektedir. Tekniğin ana avantajı hız ve basitliktir. Numune hazırlama karmaşık değildir.

Teknik, bakteriyel bir enfeksiyon için uygun tedaviyi daha iyi bilgilendirmek için virülans faktörleri veya antibiyotik direnci gibi herhangi bir patojenik bakterinin karakterizasyonuna kadar genişletilebilir. Başlamak için, LB agar plakasında yetişen tek kolonilerden bakteri toplamak için steril bir mikroliter döngüsü kullanın. Ve 300 mikrolitre HPLC sınıfı su içeren iki mililitrelik O-ring halka hattı vida kapağı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Daha sonra, Paslanmaz Çelik MALDI Hedefi üzerindeki numune süpernatantının 0,75 mikroliter kalıntı suyunda tüpü kısaca girdaplayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletlayın ve kurumasını bekleyin. Kurutulmuş numune noktasını%33 asetonitril, %67 su ve %0,2 trifluoroasetik asitte hazırlanan doymuş bir sinapinik asit çözeltisinin 0,75 mikrolitresi ile kaplayın ve noktanın kurumasını bekleyin. Nokta kuruduktan sonra hedefi kütle spektrometresi içine yükleyin.

Edinme yazılımını açın ve MS Doğrusal Mod Alma veya yığından şarj aralığına ve alt ve üst sınırların kendi alanlarına toplu şarjına tıklayın. MALDI hedef şablonunda analiz edilecek örnek noktaya tıklayın. Ardından sol fare düğmesini basılın ve lazer ablasyon veya iyonlaşma için örneklenecek dikdörtgen bölgeyi belirtmek için imleci örnek noktanın üzerine sürükleyin.

Satın almayı başlatmak ve her örnek nokta için 1000 lazer çekimi toplamak için fare düğmesini bırakın. İyonlar tespit edilirse, protein iyon sinyali tespit edilene kadar lazer yoğunluğu altında kayan ölçek çubuğunu ayarlayarak lazer yoğunluğunu arttırır. MS Doğrusal Mod Alımı tamamlandıktan sonra, MS/MS Yansıtma Modu Alımı'nı tıklatın.

Öncü Kitle alanına analiz edilecek öncül kütleyi girin. Ardından, öncül kütlenin düşük ve yüksek kütleli tarafı için Öncü Kütle penceresindeki daltonlara bir izolasyon genişliği girin. CID Kapalı düğmesini tıklatın.

Ardından Metastable Suppressor On düğmesini tıklatın. Gösterilen gibi kayar ölçek çubuğunu ayarlayarak lazer yoğunluğunu maksimum değerinin en az %90'ına ayarlayın. MALDI hedef şablonunda analiz edilecek örnek noktaya tıklayın, ardından sol fare düğmesini basılın ve lazer ablasyon veya iyonizasyon için örneklenecek dikdörtgen bölgeyi belirtmek için imleci örnek noktanın üzerine sürükleyin, alımı başlatmak için fare düğmesini bırakın ve gösterildiği gibi her örnek nokta için 10.000 lazer çekimi toplayın.

Protein Biomarker Arayıcı Yürütülebilir Dosyası'nı çift tıklatır ve grafik kullanıcı arabirimi penceresi görünecektir. Olgun Protein Kütlesi alanına protein biyobelirtecinin kütlesini ve Kütle Toleransı alanına kütle ölçüm hatasını girin. İsteğe bağlı olarak, protein kütlesini putatif ücretsiz parça iyon çiftinden hesaplamak için Ücretsiz b/y iyon Protein Kütle Hesaplayıcısı düğmesine tıklayın ve Protein Kütle HesaplayıcıSı Aracı'nın açılır penceresi görünecektir.

Putatif ücretsiz parça iyon çiftinin şarj oranını şarj etmek için kütleyi girin, Çift Ekle düğmesine tıklayın ve Hesap Makinesi Protein Kütlesi görünecektir. Bu değeri Olgun Protein Kütlesi alanına kopyalayın ve Protein Kütle Hesaplayıcısı araç penceresini kapatın. Kalıntı Kısıtlamasını Ayarla kutusunu tıklatın.

Uç terminal sinyal peptit uzunluğunu seçin ve kayar bir ölçek ve imleç içeren açılır pencere görünecek ve imleci istenen sinyal peptit uzunluğuna taşıyacaktır. Sinyal peptit uzunluğu seçilmezse, yazılım tarafından sınırsız bir sıra kesilmesi gerçekleştirilir. Parça İyon Koşulu altında, bir veya daha fazla kalıntı, D-E-N ve/veya P kutularına tıklayarak Polipeptid Omurga Bölünmesi için Kalıntılar'ı seçin ve ardından arama yapmak için Parça İyonları Artı Bir Girin düğmesine tıklayın ve açılır parça sayfası görünecektir.

Daha sonra Parça İyon Ekle düğmesine tıkladiğinizde, girilecek her parça iyon için bir açılan alan görünecektir. Parça iyonlarının yük oranlarına ve ilgili kütlelerine göre yük toleransı ile kütleyi girin. Ardından Kaydet ve Kapat düğmesine tıklayın.

Kaç Parça İyonunun Eşleşmesi Gerekiyor'un sağ yan kutusunda, tanımlama için eşleşmesi gereken en az parça iyon sayısını seçmek için kaydırın ve oksitlenmiş durumlarındaki sistein kalıntılarını seçin. Proteinler aramadan sonra tanımlanmazsa, aramayı azaltılmış hallerinde sisteinlerle tekrarlayın. Dosya Kurulumu altında, daha önce oluşturulmuş bakteri türünün siliko protein dizilerini içeren FASTA dosyasına göz atmak ve seçmek için FASTA dosyasını seç simgesine tıklayın.

Ardından bir çıktı klasörü seçin ve bir çıktı dosyası adı oluşturun. Dosya Girişlerinde Aramayı Çalıştır simgesini tıklatın. Arama başlatılmadan önce arama parametrelerini görüntüleyen Arama Parametrelerini Onayla başlıklı bir açılır pencere görüntülenir.

Arama parametreleri doğruysa Aramaya Başla'yı tıklatın. Parametreler yanlışsa, İptal'i tıklatın ve doğru parametreleri yeniden girin. Arama başlatıldıktan sonra parametre penceresi kapanır ve aramanın ilerlemesini ve bulunan kimlik sayısının çalışan bir çetelesini gösteren ilerleme çubuğuna sahip yeni bir açılır pencere görüntülenir.

Arama tamamlandıktan sonra, ilerleme çubuğu otomatik olarak kapatılacak ve aramanın bir özeti, bulunan protein kimliklerini görüntüleyen yeni bir açılır pencere ile birlikte grafik kullanıcı arabiriminin günlük alanında görüntülenecektir. Mevcut çalışmada, LB'de iki farklı mitomycin-C konsantrasyonu ile bakteri kültürleri yetiştirildi. Bakteri kültürünün kütle spektrumu mitomycin-C konsantrasyonu ile büyüdü.

Soğuk şok proteini C, soğuk şok proteini E ve plazmid kaynaklı, fonksiyonu bilinmeyen bir protein tanımlanmıştır. 9780'de bilinmeyen protein iyonu MS/MS tarafından analiz edildi ve öncül iyon yaklaşık 100 daltonluk bir zaman iyon seçici penceresi ile izole edildi. Kütledeki parça iyonu 9675.9'a kadar olan kütle, 9655'teki metastable protein iyonunun ayrışmasıyla dökülür.

Kolin E3 için bağışıklık proteininin dizilimi, temel kalıntı olası iyonlaşma alanlarını içerir. Arama sırasında sistein formunun azalmasıyla polipeptid omurga bölünmesinden tespit edilen parça iyonları. N-terminal methionine çeviri sonrası değişiklik olarak kaldırılır.

Bakteri kültürü yüksek mitomycin-C konsantrasyonda yetiştirildiğinde, bakteriyosinin bağışıklık proteini tanımlanmıştır. 9651'deki bilinmeyen zirve MS/MS tarafından analiz edildi ve öncü iyon eksi 75 artı 60 daltonluk daha dar ve asimetrik bir Tİs penceresi ile izole edildi. Bakteriyosinin bağışıklık proteininin dizilimi, olası iyonlaşma bölgelerinde temel kalıntılar içerir.

Arama sırasında sistein formunun azalmasıyla polipeptid omurga bölünmesinden tespit edilen parça iyonları. farklı antibiyotik konsantrasyonları ile, göreceli protein bolluğu değişebilir. Ve bunlar kütle spektrometresi kullanılarak analiz edildi.

Bakteri hücrelerini toplarken, antibiyotikler ve konsantrasyon açısından koloni morfolojisini ve bakteri üremesini gözlemleyin. Proteinleri tespit etmek için bir mikroliter hücre döngüsü gereklidir.