Name: Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Keşfedin, katı destekli membran elektrofizyolojisi kullanarak elektrojenik taşıyıcıları hedefleyen inhibitör nanobody'leri yüksek verimli tarama ve IC50 değerlerini belirleme yöntemini. Etiketli substrat gerektirmeden fonksiyonel karakterizasyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Zürih Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji Enstitüsü'nden Cedric A. J. Hutter ve Markus A. Seeger'a ve Basel Üniversitesi Biozentrum'dan Gonzalo Cebrero'ya sentetik nanobodies (siyadlar) üretimindeki işbirliği için teşekkür ederiz. Nanion Technologies'den Maria Barthmes ve Andre Bazzone'a teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF) (PP00P3_170607 ve NANION Research Grant Initiative tarafından C.P.'ye desteklendi.

<ol><li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+an+antibody+molecule%3A+structure%2C+kinetics%2C+thermodynamics%2C+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641(2017).</li>
<li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216(2020).</li>
<li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li>
<li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF%2C+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296(2017).</li>
<li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Pharmacology+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta%282%29+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li>
<li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li>
<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li>
<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li>
<li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li>
<li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317(2018).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li>
<li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li>
<li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaLi-H1%3A+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228(2016).</li>
<li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).</li>
<li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li>
<li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li>
<li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li>
<li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li>
<li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273(2018).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+derived+from+camelids+represent+versatile+biomolecules+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications.</a> Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).</li>
<li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4+nanobodies+%28VHH-based+single+variable+domains%29+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187(2015).</li>
<li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li>
<li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-based+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li>
<li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li>
<li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li>
<li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na%2B%2FH%2B+antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+LacY%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li>
<li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+of+electrogenic+sugar%2FH%2B+symport+in+MFS+sugar+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392(2016).</li>
<li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183(2020).</li>
<li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li>
<li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064(2020).</li>
<li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

Burada sunulan teknik, elektrojenik taşıyıcıları hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklere sahip nanobodları sınıflandırır. Substrat taşımacılığının değerlendirilmesi, proteolipozomların zarlarına gömülü taşıyıcı aracılığıyla yüklerin hareketinin tespit edilmesi nedeniyle mümkündür. Bir deneyin kurulumu sırasındaki kritik adımlardan bazıları, lipozomlardaki aktif proteinin yeniden uzlaştırılması, SSM yongalarında kararlı monolayerlerin hazırlanması ve bağlı nanobody moleküllerini çıkarmak için yıkama protokol...

Antikorlar, antijen bağlanmasından sorumlu iki özdeş ağır zincir ve iki ışık zincirinden oluşur. Kamelyalar sadece konvansiyonel antikorlara kıyasla kognat antijenleri için benzer benzeşim gösteren ağır zincirli antikorlara sahiptir1,2. Sadece ağır zincirli antikorların tek değişken etki alanı (VHH) tam antijen bağlama potansiyelini korur ve çok kararlı olduğu gösterilmiştir1,2. Bu izole VHH molekülleri veya "nanobodies" membran proteinleri biyokimya ile ilgili çalışmalarda konsültasyonları stabilize etmek için araçlar olarakuygulanmıştır 3,4, inhibitörler olarak5,6, stabilizasyon ajanları olarak7, ve yapı belirleme için araçlar olarak8,9,10 . Nanobodies, hedefe özgü nanobodları kodlayan B hücrelerinin önceden zenginleştirilmesi ve daha sonra B hücrelerinin izolasyonu için kamelyaların bağışıklanması ve ardından nanobody kütüphanesinin klonlanması ve faj ekranı ile seçilmesi ile üretilebilir11,12,13. Nanobodies oluşturmanın alternatif bir yolu, kütüphanelerin inşasına ve faj ekranı, ribozom ekran veya maya ekranı 14 , 15,16, 17,18,19,20ile seçime dayanan in vitro seçimyöntemlerinedayanmaktadır. Bu in vitro yöntemler büyük kütüphane boyutları gerektirir, ancak hayvan bağışıklamadan kaçınmaktan yararlanır ve nispeten düşük stabiliteye sahip proteinleri hedefleyen nanobodies seçimini tercih eder.
Nanobodilerin küçük boyutu, yüksek stabilite ve çözünürlükleri, güçlü antijen benzeşimi, düşük immünojeniklik ve nispeten kolay üretim, onları terapötiklerin gelişimi için güçlü adaylar haline getirir21,22,23. Özellikle, çoklu membran proteinlerinin aktivitesini engelleyen nanobodies klinik uygulamalar için potansiyel varlıklardır5,24,25,26. Membran taşıyıcıları söz konusu olduğunda, bir nano gövdenin inhibitör aktiviteye sahip olup olmadığını değerlendirmek için, taşınan substratların ve / veya ko-substratların tespit edilmesine izin veren bir test geliştirmek gerekir. Bu tür tahliller genellikle etiketli molekülleri veya evrensel bir uygulamadan yoksun olabilecek substrata özgü algılama yöntemlerinin tasarımını içerir. Ayrıca, inhibitör nanobodies tanımlanması genellikle bağlayıcıların çok sayıda taranır gerektirir. Bu nedenle, yüksek aktarım hızı modunda kullanılabilen ve etiketli alt tabakalara dayanmayan bir yöntem bu seçim için gereklidir.
SSM tabanlı elektrofizyoloji, membranlar (örneğin, iyon bağlama/taşıma)27,28boyunca yüklerin hareketinin algılanmasını sağlayan son derece hassas, son derece zaman çözülen bir tekniktir. Bu teknik, bu proteinlerin 29 , 30 , 31 ,32, 33 ,34,35'in göreceli düşük cirosu nedeniyle diğer elektrofizyoloji tekniklerini kullanarak çalışması zor olan elektrojenik taşıyıcıları karakterize etmek için uygulanmıştır. SSM elektrofizyolojisi etiketli substratların kullanılmasını gerektirmez, yüksek verimli tarama için uygundur ve ilgi çekici taşıyıcıyı içeren proteolipozomlar veya membran vezikülleri kullanılabilir. Burada, SSM tabanlı elektrofizyolojinin ışınlayıcı hedefli nanobodies'i inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklerle sınıflandırmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz. İlke kanıtı olarak, bakteriyel kolin taşıyıcısının lipozomlara yeniden yapılandırılmasını ve ardından SSM sensörlerindeki proteolipozomların hareketsiz hale getirilmesi için ayrıntılı adımları açıklıyoruz. Daha sonra kolin taşımacılığının SSM tabanlı elektrofizyoloji ölçümlerinin nasıl gerçekleştirildiğini ve yarı maksimal etkili konsantrasyonun nasıl belirlendiğini açıklıyoruz (EC50). Daha sonra birden fazla nanobodiyleri taramak ve kolin taşıma inhibitörlerini tanımlamak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Son olarak, seçilen inhibitör nanobodilerin yarı maksimal inhibitör konsantrasyonlarının(IC 50)nasıl belirlendiğini açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>1-oktadekanetiol çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858-25ML</td><td></td></tr><tr><td>1,2-difitanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850356C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Biyo-Boncuklar SM-2 Adsorban (Polistiren adsorban boncuklar)</td><td>BioRad</td> <td># 152-3920</td><td></td></tr><tr><td>PD 10 Tuz Giderme Kolonları</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtre 200 nm membran</td><td>Whatman Nucleopore</td><td>WHA800282</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck</td><td>33539-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>n-Dekan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8034051000</td><td></td></tr><tr><td>n-dodesil-&szlig;-D-maltosid (DDM)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850520P-25g</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr> <tr><td>(SSM kurulumu) SURFE2R N1</td><td>Nanion</td><td>----- </td><td></td></tr><tr><td>SURFE2R N1 Tek Sensör Çipleri</td><td>Nanion</td> <td># 161001</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Polar Lipid Özü</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>Yumurta PC L -&alfa; -fosfatidilkolin </td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840051C</td><td></td></tr></tbody></table>

katı destekli membran (ssm) tabanlı elektrofizyoloji ile taşıyıcı hedefli inhibitör nanobodies seçimi

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Tek etki alanı antikorları (nanobodies) proteinlerin mekanistik ve yapısal çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır ve çoğu ışınlayıcılar gibi membran proteinlerinin inhibisyonuna bağlı olan klinik tedaviler geliştirmek için araç olarak muazzam bir potansiyel oluşturmaktadır. Bununla birlikte, taşıma etkinliğinin inhibisyonunu belirlemek için kullanılan yöntemlerin çoğunun yüksek verimli rutinlerde gerçekleştirilmesi zordur ve etiketli substratların kullanılabilirliğine bağlıdır, böylece büyük nanobody kütüphanelerinin taranmasını zorlaştırır. Katı destekli membran (SSM) elektrofizyolojisi, elektrojenik taşıyıcıları karakterize etmek ve taşıma kinetiğini ve inhibisyonunu ölçmek için kullanılan yüksek verimli bir yöntemdir. Burada, elektrojenik ikincil taşıyıcıyı hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodileri seçmek ve nanobodies inhibitör sabitlerini hesaplamak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin uygulanmasını gösteriyoruz. Bu teknik özellikle etiketli substratların bulunmadığı taşıyıcıları hedefleyen inhibitör nanobodies seçmek için yararlı olabilir.

SSM tabanlı elektrofizyoloji, elektrojenik taşıyıcıların karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada sunulan protokolde, sekonder bir taşıyıcıyı (burada bakteriyel kolin symporter) hedefleyen nanobodileri inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklerine göre sınıflandırmak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu tekniğin en kullanışlı özelliklerinden biri, birden çok arabellek koşulunun yüksek verimli taranmasına izin veriyor olmasıdır. Bu özel özellik, bağlayıcıların seçi...

Nanobodies yapısal biyolojide önemli araçlardır ve tedavilerin gelişimi için büyük bir potansiyel oluşturur. Bununla birlikte, inhibitör özelliklere sahip nanobodies seçimi zor olabilir. Burada elektrojenik membran taşıyıcılarını hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların sınıflandırılması için katı destekli membran (SSM) tabanlı elektrofizyolojinin kullanımını gösteriyoruz.

Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Sunulan protokol, proteolipozomlarda yeniden inşa edilen veya membran veziküllerinde bulunan elektrojenik taşıyıcıları hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların yüksek verimli tarama ve tanımlanması için kullanılır. Transfer testlerinin tasarlanması, özellikle etiketli substratlar mevcut değilse, birden fazla durumda zor olabilir. Aynı elektrofizyoloji nanobodilerin hemen hemen her elektrojenik taşıyıcı için taşıma üzerindeki etkisinin incelenmesine izin veriyorsa, Çünkü SSM elektrofizyolojisi etiketli substratlar gerektirmez.Nanobodiler tıbbi uygulamalarda kullanımları için araştırılmıştır. Bu teknik, insanların veya insan patojenlerinin spesifik elektrojenik taşıyıcılarını hedefleyen potansiyel inhibitörlerin taranmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, 10 temiz tüp alın ve 10 mililitre katı destekli membran veya SSM tamponunu her tüpe aktarın.Etkinleştirici SSM tamponlarını hazırlamak için, beklenen yarım maksimum konsantrasyon etrafında bir dizi konsantrasyon kullanarak alt tabakayı tüplere ekleyin. SSM yazılımını başlatın ve makinenin otomatik olarak başlatılmasına izin verin. Veriler için kaydetme yolunu ayarlayın.Tamam düğmesine basarak onaylayın. İş akışı seçeneklerinde standart ilk temizleme protokolünü seçin ve çalıştır'ı tıklatın. Ardından, proteoliposome kaplı çipi sokete monte edin.Çipi kilitlemek için kolu hareket ettir. Monte edilen çipi kapakla çevreleyin. İş akışında CapCom programını seçin ve iletkenliği ve kapasitansı belirlemek için çalışmasına izin verin.İletkenliğin beş nanosiemen'in altında olduğunu ve ölçüm için kullanmadan önce kapasitansının 15 ila 35 nanofarad arasında olduğunu onaylayın. Etkinleştirme çözümlerini şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin. Devre dışı bırakma tamponunu bir rezervuara aktarın ve sağdaki rezervuar konumunda çip tutucunun yanına yerleştirin.Üç ölçüm gerçekleştiren ve 10 arabelleğin tümü için bir sonraki etkinleştirme arabelleğine taşınan bir döngüde, etkin olmayan, etkinleştirmeyen ve etkinleştirilmeyen bir çözüm sırası dizisi veya bir BAB dizisi kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun. BAB dizisi için saniyede 200 mikrolitrelik varsayılan akış hızını bir saniye, bir saniye, bir saniye akış süreleri ile kullanın ve ölçümü başlatmak için oynat'ı tıklatın. Protokolü kaydedin ve oynat düğmesine tıklayarak iş akışının çalışmasına izin verin.Daha sonra protein içermeyen lipozomlar kullanarak aynı deneyi gerçekleştirin. Ölçülen akım ile zaman arasında çizim yapmak ve etkinleştirme arabelleği ekleme aralığında en yüksek yükseklik tahmini için işlevi kullanmak için veri analizi için tercih edilen herhangi bir yazılımı kullanın. Doğrusal olmayan regresyon yoluyla konsantrasyonun yarı maksimal etkisini veya SUB50'yi belirlemek için tepe akımını substrat konsantrasyonuna karşı çizin.Aktif olmayan SSM tamponunun 50 mililitresini temiz bir tüpe aktarın. Alt tabaka kolinini beş milimolerlik son konsantrasyona ekleyin ve bunu pozitif kontrol ölçümü için kullanın. Aktif olmayan SSM tamponunun 10 mililitresini temiz bir tüpe aktarın.Beş milimolar ve nanobody 500 nanomoler son konsantrasyona substrat kolin ekleyin. Etkinleştirici çözümleri gösterildiği gibi hazırlamak için her nanobody için adımı tekrarlayın. SSM makinesini çalıştırın ve daha önce gösterildiği gibi proteolipozom kaplı çipin kapasitansını ve iletkenliğini ölçün.Aktif hale getirici çözeltiyi nanobody olmadan bir şişeye aktarın ve tamponu prob örnekleyicisine yerleştirin. Devre dışı bırakılan tamponu nanobody olmadan bir rezervuara aktarın ve prob örnekleyicisine yerleştirin. Ardından, etkinleştirici ve devre dışı bırakma çözümü ile nanobodies içeren tüm çözümler için bu işlemi tekrarlayın.BAB dizisi kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun. Nanobodiies içermeyen tamponlar kullanarak BAB dizisinin üç ölçümünü, nanobody içeren tamponlarla BAB dizisinin iki ölçümünü, nanobody ile 120 saniyelik gecikme süresi inkübasyonunu ve nano gövdeyi içeren tamponlarla BAB dizisinin üç ölçümünü gerçekleştiren bir döngü oluşturun. İş akışını kaydedin ve oynat düğmesine tıklayarak çalışmasına izin verin.Ardından, bir BAB dizisi ve geri döndürülebilir şekilde bağlanmış nano gövdeyi yıkamak için beş ölçümden oluşan bir döngü kullanarak iş akışı için yeni bir protokol oluşturun. İş akışını kaydedin ve oynat düğmesine tıklayarak çalışmasına izin verin. Ölçümlerin son tepe akımını yalnızca ilk substrat ölçümüyle karşılaştırın.Tepe akımı başlangıç değerine ulaşırsa, nano gövde başarıyla yıkanır ve ilk koşullar yeniden kurulmuş olur. Aksi takdirde, iş akışını yineleyin veya yeni bir yongaya değiştirin. Her nanobody ekran için ayrı yongalar kullanarak bu işlemi tekrarlayın veya aynı çipi kullanarak birden fazla nanobodies ile tekrarlayın.Ölçülen akım ile zamanı çizmek için veri analizi için tercih edilen yazılımları kullanın. Daha sonra yazılım, etkinleştirme arabelleği ekleme aralığında en yüksek yükseklik tahmini işlevini otomatik olarak seçer. Pik akımını ve nano gövdenin varlığını sadece devam eden substrat ölçümüne göre normalleştirin.Histogramdaki tepe akımlarını çizin ve sadece substrat ölçümlerinin tepe akımlarını, inhibitör nanobodies'i tanımlamak için nanobodies varlığında ölçülen tepe akımlarıyla karşılaştırın. Aktif olmayan SSM tamponunun 50 mililitresini temiz bir tüpe aktarın ve substrat kolinini beş milimolar son konsantrasyona ekleyin ve bunu pozitif kontrol için etkinleştirici çözüm olarak kullanın. Sekiz temiz tüpe beş mililitre aktif olmayan çözelti ekleyin, ardından beklenen IC50 aralığındaki konsantrasyonlarda tüplere substrat kolin ve inhibitör nanobody ekleyin.Sekiz tüpe 10 mililitre aktif olmayan çözelti ekleyin ve her tüpe aktif olmayan tampona karşılık gelen inhibitör nanobody ekleyin. SSM kurulumunu başlatın ve proteolipozom kaplı çipin kapasitansını ve iletkenliğini ölçün. Aktif hale getirici çözeltiyi nanobody olmadan bir şişeye aktarın ve prob örnekleyicisine yerleştirin.Daha sonra nanobody olmadan aktif olmayan tamponu bir rezervuara aktarın ve sağdaki talaş tutucunun yanındaki rezervuar konumuna yerleştirin. Nanobodies içeren aktive edici ve devre dışı bırakma çözümlerini şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin. BAB dizisi kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun.Her konsantrasyonu iki kez ölçmek, 120 saniye kuluçkaya yatırmak ve üç kez daha ölçmek için bir döngü ekleyin. Ölçülen akıma karşı zamanı çizmek ve etkinleştirme arabelleği ekleme aralığındaki en yüksek yükseklik tahmini işlevini seçmek için veri analizi için tercih edilen herhangi bir yazılımı kullanın. Doğrusal olmayan regresyon yoluyla IC50'yi belirlemek için tepe akımlarını nanobody konsantrasyonuna karşı çizin.Nanobodilerin taranması sırasında kullanılacak substrat konsantrasyonunun belirlenmesi için, EC50'yi belirlemek için elektrojenik taşıma farklı substrat konsantrasyonları altında ölçüldü. Doygunluk koşullarına karşılık gelen bir substrat konsantrasyonu, beş milimolar, seçildi ve tüm aktif tamponlarda sabit tutuldu. İnhibitör nanobodilerin elektrojenik taşıma üzerindeki etkisi, tepe akımlarının genliklerindeki azalmadan görselleştirildi.Nano gövdenin bağını boşaltmak için yıkama protokolünü çalıştırdıktan sonra, ilk tepe akımı genliğinin% 80 ila 95'inde bir iyileşme gözlendi. Devre dışı bırakmadan etkinleştirme koşullarına geçildiğinde, bu tamponlarda bulunan nanobodies tarafından önemli bir yapı akımı uygulanmadı. inhibitör özelliklere sahip nanobodies seçildikten sonra, bireysel nanobodies için IC50 değerleri belirlendi.Nanobody içeren tampon ile çip üzerindeki proteolipozomların kalibrasyonu için yeterli zaman vermek çok önemlidir. Bağlama geri döndürülebilir olduğundan, nano gövdenin hem aktif hem de devre dışı bırakma tamponlarında bulunması gerekir.

selection-transporter-targeted-inhibitory-nanobodies-solid-supported

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada Elektrojenik membran nakil karakterizasyonu için uygulamaları odaklı sağlam desteklenen membranlar dayalı bir elektrofizyolojik yöntem mevcut.

Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

Birçok terapötik uygulama vücutta hücresel engelleri arasında ilaç taşıyıcıları ve yük güvenli ve etkin taşıma gerektirir. Bu makalede, gastrointestinal (GI) epitel olarak hücresel engelleri genelinde uyuşturucu nanocarriers (NCS), taşıma hızını ve mekanizmasını değerlendirmek amacıyla kurulmuş yöntemlerden bir adaptasyon açıklar.

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Bu makalenin ilk bölümü, plazma zarlarında veziküler Na+/H+ değiştiricileri eksprese eden mutant hücre hatlarının nasıl seçileceğini gösterir. İkinci bölüm, bu değiştiricilerin iyon seçiciliğini ve kinetik parametrelerini belirlemek için kullanılan hücre içi pH ölçümlerine ve hızlı iyon alımına dayalı protokoller sağlar.

Na fonksiyonel karakterizasyonu<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Bu el yazması proton taşıma sistemlerinin etkinliğini ölçmek için proton-seçici elektrot ve yöntemleri sıkma yama uygulamaları açıklar. Bu yöntemleri teknikleri proton taşıma etkinlik, ılımlı duyarlılık, zaman çözünürlüğü ve yetersiz hücre içi ortam denetimi gibi çalışma için yaygın olarak kullanılan bazı sınırlamalarının üstesinden gelir.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

Golgi için hücre yüzeyinden proteinlerin retrograd taşıma membran homeostazı korumak için önemlidir. Burada, biyokimyasal olarak hücre yüzey Golgi taşıma rekombinant proteinlerin functionalized nanobodies HeLa hücreleri kullanarak analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Endositik alımını ve kültürlü hücrelerde Functionalized Nanobodies kullanarak Trans-Golgi ağına retrograd taşıma analizi

Biz iki adım lı enzimatik prosedür istihdam insan idrar kesesi örnekleri tek taze izole detrusor düz kas hücrelerinin hazırlanması için bir yöntem açıklar. Elde edilen canlı DSM hücreleri fizyolojik ve farmakolojik özellikleri ortaya çıkarmak için açıklanan amphotericin-B patch-clamp elektrofizyolojisi de dahil olmak üzere çeşitli tek hücre teknikleri ile incelenebilir.

9-Fenanthrol Duyarlı Katyon Akımlarının Karakterizasyonu İçin Yeni İzole Edilmiş İnsan Detrusor Düz Kas Hücrelerinin Hazırlanması ve Kullanımı

E. coli'de heterolog ekspresyon ve fransız presi kullanılarak hücrelerin lysis'inde üretilen membran vezikül preparatlarında proton-tahrikli membran taşıyıcılarının karakterizasyonu için bir yöntem tanımladık.

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Proteinlerin plazma zarından trans-Golgi ağına endositik ve retrograd taşınması, zar homeostazını korumak ve sinyalleşmeyi düzenlemek için gereklidir. Burada, HeLa hücrelerinde türetilmiş anti-GFP nanokorları kullanılarak canlı hücre mikroskobu ile transmembran kargo proteinlerinin endositik taşınmasını görüntülemek ve ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Kültürlenmiş Hücrelerde İşlevselleştirilmiş Nanokorlar Kullanılarak Endositik Taşımanın Canlı Hücre Görüntülemesi

Bu protokol, plazma zarı proteinlerinin nano ölçekli mekânsal organizasyonunu çözmek için tek antikor etiketlemesini (SAL) tanımlar. Tek molekül düzeyinde kümülatif antikor-epitop etkileşimlerini kullanarak, membran SAL (mSAL), yerel epitop dağılımlarını haritalandırırken aynı zamanda doğal hücresel ortamda antikor bağlanma davranışını yakalar.

Tek Antikor Etiketleme Kullanarak Zar Proteinlerinin Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskopisi

Keşfedin, katı destekli membran elektrofizyolojisi kullanarak elektrojenik taşıyıcıları hedefleyen inhibitör nanobody'leri yüksek verimli tarama ve IC50 değerlerini belirleme yöntemini. Etiketli substrat gerektirmeden fonksiyonel karakterizasyon sağlar.

Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi

Daha fazla video keşfet