Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi

Sunulan protokol, proteolipozomlarda yeniden inşa edilen veya membran veziküllerinde bulunan elektrojenik taşıyıcıları hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların yüksek verimli tarama ve tanımlanması için kullanılır. Transfer testlerinin tasarlanması, özellikle etiketli substratlar mevcut değilse, birden fazla durumda zor olabilir. Aynı elektrofizyoloji nanobodilerin hemen hemen her elektrojenik taşıyıcı için taşıma üzerindeki etkisinin incelenmesine izin veriyorsa, Çünkü SSM elektrofizyolojisi etiketli substratlar gerektirmez.

Nanobodiler tıbbi uygulamalarda kullanımları için araştırılmıştır. Bu teknik, insanların veya insan patojenlerinin spesifik elektrojenik taşıyıcılarını hedefleyen potansiyel inhibitörlerin taranmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, 10 temiz tüp alın ve 10 mililitre katı destekli membran veya SSM tamponunu her tüpe aktarın.

Etkinleştirici SSM tamponlarını hazırlamak için, beklenen yarım maksimum konsantrasyon etrafında bir dizi konsantrasyon kullanarak alt tabakayı tüplere ekleyin. SSM yazılımını başlatın ve makinenin otomatik olarak başlatılmasına izin verin. Veriler için kaydetme yolunu ayarlayın.

Tamam düğmesine basarak onaylayın. İş akışı seçeneklerinde standart ilk temizleme protokolünü seçin ve çalıştır'ı tıklatın. Ardından, proteoliposome kaplı çipi sokete monte edin.

Çipi kilitlemek için kolu hareket ettir. Monte edilen çipi kapakla çevreleyin. İş akışında CapCom programını seçin ve iletkenliği ve kapasitansı belirlemek için çalışmasına izin verin.

İletkenliğin beş nanosiemen'in altında olduğunu ve ölçüm için kullanmadan önce kapasitansının 15 ila 35 nanofarad arasında olduğunu onaylayın. Etkinleştirme çözümlerini şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin. Devre dışı bırakma tamponunu bir rezervuara aktarın ve sağdaki rezervuar konumunda çip tutucunun yanına yerleştirin.

Üç ölçüm gerçekleştiren ve 10 arabelleğin tümü için bir sonraki etkinleştirme arabelleğine taşınan bir döngüde, etkin olmayan, etkinleştirmeyen ve etkinleştirilmeyen bir çözüm sırası dizisi veya bir BAB dizisi kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun. BAB dizisi için saniyede 200 mikrolitrelik varsayılan akış hızını bir saniye, bir saniye, bir saniye akış süreleri ile kullanın ve ölçümü başlatmak için oynat'ı tıklatın. Protokolü kaydedin ve oynat düğmesine tıklayarak iş akışının çalışmasına izin verin.

Daha sonra protein içermeyen lipozomlar kullanarak aynı deneyi gerçekleştirin. Ölçülen akım ile zaman arasında çizim yapmak ve etkinleştirme arabelleği ekleme aralığında en yüksek yükseklik tahmini için işlevi kullanmak için veri analizi için tercih edilen herhangi bir yazılımı kullanın. Doğrusal olmayan regresyon yoluyla konsantrasyonun yarı maksimal etkisini veya SUB50'yi belirlemek için tepe akımını substrat konsantrasyonuna karşı çizin.

Aktif olmayan SSM tamponunun 50 mililitresini temiz bir tüpe aktarın. Alt tabaka kolinini beş milimolerlik son konsantrasyona ekleyin ve bunu pozitif kontrol ölçümü için kullanın. Aktif olmayan SSM tamponunun 10 mililitresini temiz bir tüpe aktarın.

Beş milimolar ve nanobody 500 nanomoler son konsantrasyona substrat kolin ekleyin. Etkinleştirici çözümleri gösterildiği gibi hazırlamak için her nanobody için adımı tekrarlayın. SSM makinesini çalıştırın ve daha önce gösterildiği gibi proteolipozom kaplı çipin kapasitansını ve iletkenliğini ölçün.

Aktif hale getirici çözeltiyi nanobody olmadan bir şişeye aktarın ve tamponu prob örnekleyicisine yerleştirin. Devre dışı bırakılan tamponu nanobody olmadan bir rezervuara aktarın ve prob örnekleyicisine yerleştirin. Ardından, etkinleştirici ve devre dışı bırakma çözümü ile nanobodies içeren tüm çözümler için bu işlemi tekrarlayın.

BAB dizisi kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun. Nanobodiies içermeyen tamponlar kullanarak BAB dizisinin üç ölçümünü, nanobody içeren tamponlarla BAB dizisinin iki ölçümünü, nanobody ile 120 saniyelik gecikme süresi inkübasyonunu ve nano gövdeyi içeren tamponlarla BAB dizisinin üç ölçümünü gerçekleştiren bir döngü oluşturun. İş akışını kaydedin ve oynat düğmesine tıklayarak çalışmasına izin verin.

Ardından, bir BAB dizisi ve geri döndürülebilir şekilde bağlanmış nano gövdeyi yıkamak için beş ölçümden oluşan bir döngü kullanarak iş akışı için yeni bir protokol oluşturun. İş akışını kaydedin ve oynat düğmesine tıklayarak çalışmasına izin verin. Ölçümlerin son tepe akımını yalnızca ilk substrat ölçümüyle karşılaştırın.

Tepe akımı başlangıç değerine ulaşırsa, nano gövde başarıyla yıkanır ve ilk koşullar yeniden kurulmuş olur. Aksi takdirde, iş akışını yineleyin veya yeni bir yongaya değiştirin. Her nanobody ekran için ayrı yongalar kullanarak bu işlemi tekrarlayın veya aynı çipi kullanarak birden fazla nanobodies ile tekrarlayın.

Ölçülen akım ile zamanı çizmek için veri analizi için tercih edilen yazılımları kullanın. Daha sonra yazılım, etkinleştirme arabelleği ekleme aralığında en yüksek yükseklik tahmini işlevini otomatik olarak seçer. Pik akımını ve nano gövdenin varlığını sadece devam eden substrat ölçümüne göre normalleştirin.

Histogramdaki tepe akımlarını çizin ve sadece substrat ölçümlerinin tepe akımlarını, inhibitör nanobodies'i tanımlamak için nanobodies varlığında ölçülen tepe akımlarıyla karşılaştırın. Aktif olmayan SSM tamponunun 50 mililitresini temiz bir tüpe aktarın ve substrat kolinini beş milimolar son konsantrasyona ekleyin ve bunu pozitif kontrol için etkinleştirici çözüm olarak kullanın. Sekiz temiz tüpe beş mililitre aktif olmayan çözelti ekleyin, ardından beklenen IC50 aralığındaki konsantrasyonlarda tüplere substrat kolin ve inhibitör nanobody ekleyin.

Sekiz tüpe 10 mililitre aktif olmayan çözelti ekleyin ve her tüpe aktif olmayan tampona karşılık gelen inhibitör nanobody ekleyin. SSM kurulumunu başlatın ve proteolipozom kaplı çipin kapasitansını ve iletkenliğini ölçün. Aktif hale getirici çözeltiyi nanobody olmadan bir şişeye aktarın ve prob örnekleyicisine yerleştirin.

Daha sonra nanobody olmadan aktif olmayan tamponu bir rezervuara aktarın ve sağdaki talaş tutucunun yanındaki rezervuar konumuna yerleştirin. Nanobodies içeren aktive edici ve devre dışı bırakma çözümlerini şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin. BAB dizisi kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun.

Her konsantrasyonu iki kez ölçmek, 120 saniye kuluçkaya yatırmak ve üç kez daha ölçmek için bir döngü ekleyin. Ölçülen akıma karşı zamanı çizmek ve etkinleştirme arabelleği ekleme aralığındaki en yüksek yükseklik tahmini işlevini seçmek için veri analizi için tercih edilen herhangi bir yazılımı kullanın. Doğrusal olmayan regresyon yoluyla IC50'yi belirlemek için tepe akımlarını nanobody konsantrasyonuna karşı çizin.

Nanobodilerin taranması sırasında kullanılacak substrat konsantrasyonunun belirlenmesi için, EC50'yi belirlemek için elektrojenik taşıma farklı substrat konsantrasyonları altında ölçüldü. Doygunluk koşullarına karşılık gelen bir substrat konsantrasyonu, beş milimolar, seçildi ve tüm aktif tamponlarda sabit tutuldu. İnhibitör nanobodilerin elektrojenik taşıma üzerindeki etkisi, tepe akımlarının genliklerindeki azalmadan görselleştirildi.

Nano gövdenin bağını boşaltmak için yıkama protokolünü çalıştırdıktan sonra, ilk tepe akımı genliğinin% 80 ila 95'inde bir iyileşme gözlendi. Devre dışı bırakmadan etkinleştirme koşullarına geçildiğinde, bu tamponlarda bulunan nanobodies tarafından önemli bir yapı akımı uygulanmadı. inhibitör özelliklere sahip nanobodies seçildikten sonra, bireysel nanobodies için IC50 değerleri belirlendi.

Nanobody içeren tampon ile çip üzerindeki proteolipozomların kalibrasyonu için yeterli zaman vermek çok önemlidir. Bağlama geri döndürülebilir olduğundan, nano gövdenin hem aktif hem de devre dışı bırakma tamponlarında bulunması gerekir.