Name: Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Öğrenin optik cımbız ve konfokal mikroskopi kullanarak RNA-protein etkileşimlerini inceleme yöntemini. Bu teknik, translasyon düzenlemesindeki bağlanma olaylarını ve kuvvet ölçümlerini gerçek zamanlı izlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Anuja Kibe ve Jun. Prof. Redmond Smyth'e makaleyi eleştirel bir şekilde inceledikleri için teşekkür ederiz. Uzman teknik yardım için Tatyana Koch'a teşekkür ederiz. Kristyna Pekarkova'ya deneysel videoların kaydediltiren yardımı için teşekkür ederiz. Laboratuvarımızdaki çalışmalar Helmholtz Derneği tarafından desteklenmekte ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) Grant Nr. 948636 (NC'ye) fon sağlamıştır.

1. Numune hazırlama
<ol><li>İlgi sırasını, sap dizileri olarak hizmet eden Lambda DNA parçalarını içeren vektöre klonlayın (Şekil 2)43,50.</li>
	<li>İlk önce PCR ile sonraki in vitro transkripsiyon için bir DNA şablonu oluşturun (Şekil 2B; reaksiyon 1). Bu PCR adımında, T7 promotörü dna molekülünün 5' ucuna eklenir32,33,43,50. PCR reaksiyonlarını Tablo 1'e göre ayarlayın. PCR'ı termosikler içinde uygun döngülerle 50 μL aliquots'ta çalıştırın.</li>
	<li>Tutamaçları iki ayrı PCR reaksiyona göre hazırlayın (Tablo 1, Şekil 2B; reaksiyon 2 ve 3). İlk olarak, PCR ile 5' tutamacını oluşturun. Ardından, 3' tutamağı oluşturun ve aynı anda 5' digoksigenin etiketli bir astar32,33,43,50 kullanarak digoxigenin ile etiketlendir.</li>
	<li>PCR'den sonra, silika spin sütunlarını kullanarak DNA'yı arındırın.</li>
	<li>T7 RNA polimeraz kullanarak in vitro transkripsiyon reaksiyonunu gerçekleştirin (Tablo 2)32,33,43,50. Reaksiyonun 37 °C'de 2-4 saat boyunca RNA'nın uzunluğuna bağlı olarak kuluçkaya yatırın. Ardından, reaksiyona I. Dayı'yı ekleyin ve DNA şablonını sindirmek için 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Silika döndürme sütunlarını kullanarak RNA'yı arındırın.</li>
	<li>5' sapının etiketleme reaksiyonu sırasında (Tablo 3), kolun 3' ucuna T4 DNA polimeraz38,50 ile biotin-16-dUTP ekleyin. Reaksiyonun oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca gerçekleştirilmesi. Daha sonra, silika spin sütunlarını kullanarak DNA'yı arındırın. NOT: 5' tutamacın 3' ucunda (Şekil 2B) etiketli olması gerektiğinden, etiketleme PCR sırasında gerçekleştirilemez.</li>
	<li></li><li><li></li><li></ol><ol><li><li><li> </li><li><li><li><li><li> </li><li><li></ol><ol><li> </li><li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li> </li><li> </li><li><li></ol><ol><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq01.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq02.jpg"> </li></ol></li><li> <ol><li></li><li> </li><li></li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, çeşitli ligandlarla RNA moleküllerinin etkileşimlerini ve dinamik davranışlarını incelemek için floresan bağlantılı optik cımbızların kullanımını gösteriyoruz. Aşağıda, mevcut tekniğin kritik adımları ve sınırlamaları tartışılmıştır.
Protokolde kritik adımlar Diğer birçok yöntemde olduğu gibi, numunenin kalitesi güvenilir veri elde etmek için çok önemlidir. Bu nedenle, mümkün olan en yüksek kalitede numuneler elde etmek için, numune hazırlama prosedürünü optimize et...

Genetik bilgilerin DNA'dan proteinlere mRNA'lar yoluyla aktarılması, hücrelerin içindeki makromoleküler etkileşimler yoluyla tüm seviyelerde hassas bir şekilde düzenlenen karmaşık bir biyokimyasal süreçtir. Çevirisel düzenleme için, RNA-protein etkileşimleri çeşitli uyaranlara ve sinyallere hızlı bir şekilde tepki vermek için kritik bir rol oynar1,2. Bazı RNA-protein etkileşimleri mRNA stabilitesini etkiler ve böylece bir RNA'nın çevirisel olarak aktif olduğu zamanı değiştirir. Diğer RNA-protein etkileşimleri stop-codon readthrough, bypass veya programlanmış ribozomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7 gibi yeniden kodlama mekanizmaları ile ilişkilidir. Son zamanlarda, hücrede ne zaman ve ne kadar yeniden kodlama olacağını dikte etmek için uyarıcı mRNA elemanları ve çeviri makineleri ile etkileşime giren bir dizi RNA bağlayıcı protein (RBP) gösterilmiştir7,8,9,10,11. Bu nedenle, RNA bağlayıcı proteinlerin çevirideki rolünü ve RNA yapısını ve stabilitesini nasıl modüle ettiklerini incelemek için, bu RNA-protein komplekslerinin etkileşim ilkelerini ve mekanik özelliklerini ayrıntılı olarak incelemek çok önemlidir.
Onlarca yıllık çalışma, hız ve doğruluk elde etmek için çeviri makinelerinin RNA ve protein bileşenleri arasındaki karmaşık iletişime dayanan çok adımlı ve çok bileşenli çeviri sürecini incelemek için temel atmıştır12,13,14. Karmaşık düzenleyici olayları anlamanın önemli bir sonraki adımı, çeviri sırasındaki kuvvetleri, zaman ölçeklerini ve yapısal belirleyicileri yüksek hassasiyetle belirlemektir12,15,16,17. RNA konformasyonel dinamiklerinin incelenmesi ve özellikle trans-etkili yardımcı faktörlerin çeviri sırasında RNA yapısı üzerinde nasıl hareket ettiği, optik cımbız veya sıfır mod dalga kılavuzları dahil olmak üzere tek moleküllü araçların ortaya çıkmasıyla daha da aydınlatılmıştır16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Optik cımbızlar (OT), transkripsiyon ve çeviri dahil olmak üzere birçok RNA'ya bağımlı dinamik süreci incelemek için uygulanan son derece hassas bir tek molekül tekniğini temsil eder26,27,28,29,30,31,32. Optik cımbız kullanımı moleküler etkileşimlerin, nükleik asit yapılarının ve termodinamik özelliklerin, kinetiğin ve enerjiklerinin ayrıntılı olarak araştırılmasına izin almıştır16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optik cımbız tahlilleri, mikroskobik nesnelerin odaklanmış bir lazer ışını ile tuzağa getirilmesine dayanır. Tipik bir OT deneyinde, ilgi molekülü iki şeffaf (genellikle polistiren) boncuk (Şekil 1A)27 arasında birbirine bağlıdır. Bu boncuklar daha sonra yaylar gibi davranan optik tuzaklar tarafından yakalanır. Böylece moleküle uygulanan kuvvet, boncukun odaklanmış lazer ışınının (tuzak merkezi) merkezinden yer değiştirmesi esas alınarak hesaplanabilir. Son zamanlarda optik cımbız konfokal mikroskopi (Şekil 1B) ile birleştirilerek floresan veya Förster rezonans enerji transferi (FRET) ölçümleri40,41,42 olarak mümkün olmuştur. Bu, eşzamanlı ölçüme ve dolayısıyla kuvvet spektroskopisi ve floresan verilerinin kesin korelasyonuna izin vererek yepyeni bir olası deney alanı açar.
Burada, çevirisel çerçevelemeyi düzenleyen protein-RNA etkileşimlerini incelemek için konfokal mikroskopi ile birlikte optik cımbız kullanarak deneyler gösteriyoruz. Amaç ve kondenser arasında, beş kanallı bir akış hücresi laminer akış ile sürekli numune uygulaması sağlar. Mikroakışkan kanallar aracılığıyla, çeşitli bileşenler doğrudan enjekte edilebilir, bu da uygulamalı zamanı azaltır ve deney boyunca çok az numune tüketimine izin verir.
İlk olarak, OT deneylerinin tasarımına yardımcı olacak temel bir kılavuz önerilmektedir ve avantajların yanı sıra çeşitli kurulumların tuzakları tartışılmaktadır. Daha sonra, örneklerin ve deneysel iş akışlarının hazırlanması açıklanır ve veri analizi için bir protokol sağlanır. Bir örneği temsil etmek için, sars-CoV-2 çerçeve değiştirme RNA elemanını (Şekil 2A) trans-etkili faktörle incelemek için RNA germe deneylerinden elde edilen sonuçları özetliyoruz, çinko-parmak antiviral proteininin (ZAP) kısa izoformunu, viral RNA'nın alternatif bir okuma çerçevesinden çevirisini değiştiren43. Ek olarak, çeviri makinelerinin prosesliğini ve hızını izlemek için yararlı olacak bu OT konfokal testinde floresan etiketli ribozomların kullanılabileceği gösterilmiştir. Burada sunulan yöntem, çevirinin çeşitli yönlerini incelemek için farklı tamponların, ligandların veya diğer hücresel bileşenlerin etkisini hızlı bir şekilde test etmek için kullanılabilir. Son olarak, yaygın deneysel tuzaklar ve bunların nasıl giderileceği tartışılır. Aşağıda, deneysel tasarımda bazı önemli noktalar özetlenmiştir.
Tasarım oluşturma Prensip olarak, OT uyumlu bir RNA yapısı oluşturmak için iki ortak yaklaşım vardır. İlk yaklaşım, tamamlayıcı DNA tutamaçlarıyla melezlenen uzun bir RNA molekülü kullanmaktadır, böylece ortada tek iplikli bir RNA dizisini kuşatan iki RNA / DNA melez bölgesinden oluşan bir yapı elde edilir (Şekil 2B). Bu yaklaşım çoğu OT RNA deneyinde 33,44,45'te kullanılır.
İkinci yaklaşım, kısa (yaklaşık 20 nt) çıkıntilı dsDNA tutamaçlarından yararlanır15,17. Bu çıkıntılar daha sonra RNA molekülü ile melezlenir. Tasarımda daha karmaşık olmasına rağmen, dsDNA tutamaklarının kullanımı DNA / RNA-hibrid sisteminin bazı sınırlamalarının üstesinden geliyor. Prensip olarak, konfokal ölçümler için daha uygun olan çok uzun tutamaklar (>10kb) bile uygulanabilir. Ek olarak, RNA molekülü, bağ stabilitesini artırmak için DNA tutamaklarına bağlanabilir.
Son etiketleme stratejisi Yapı, güçlü bir moleküler etkileşim yoluyla boncuklara bağlanmalıdır. Sapların boncuklara doğru kurcalanabilir bağlanması için yaklaşımlar mevcut olsa da, streptavidin-biotin ve digoksigenin-antikor gibi güçlü ancak yaygın olmayan etkileşimler OT deneylerinde yaygın olarak kullanılmaktadır15,33,35,45. Açıklanan protokolde, yapı biotin veya digoksigenin ile etiketlenmiştir ve boncuklar sırasıyla streptavidin veya digoksigenin'e karşı antikorlarla kaplanmıştır (Şekil 1A). Bu yaklaşım, yaklaşık 60 pN'a (bağlama başına)47'ye kadar kuvvet uygulamak için uygundur. Ayrıca, farklı 5' ve 3' etiketleme stratejilerinin kullanılması, boncuklar arasında oluşan bağın yönünün belirlenmesine izin verir17.
Floresan ölçümleri için protein etiketleme Konfokal görüntüleme için floresan etiketleme için yaygın olarak kullanılan birkaç yaklaşım vardır. Örneğin, floroforlar proteinlerde doğal olarak bulunan veya reaktif organik bir grup aracılığıyla bölgeye yönlendirilmiş mutajensis tarafından tanıtılan amino asit kalıntılarına aktif olarak bağlanabilir. Sistein ve lizin kalıntılarının etiketlenebilmesi için sırasıyla tiyol veya amin reaktif boyalar kullanılabilir. Etiketlemenin özgüllüğünü artırmak için birkaç ters çevrilebilir koruma yöntemi vardır48,49, ancak yerel proteinler genellikle birden fazla kalıntıda etiketlenir. Floroforun küçük boyutu bir avantaj sağlasa da, spesifik olmayan etiketleme protein aktivitesini etkileyebilir ve bu nedenle sinyal yoğunluğu değişebilir49. Ayrıca, etiketleme verimliliğine bağlı olarak sinyal yoğunluğu farklı deneyler arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, denemeden önce bir etkinlik denetimi yapılmalıdır.
İlgi proteini, His-tag veya strep-tag gibi bir N veya C-terminal etiketi içeriyorsa, bu etiketlerin özel etiketlemesi başka bir popüler yaklaşımı temsil eder. Ayrıca, etiket hedefli etiketleme, floroforun protein aktivitesini engelleme şansını azaltır ve çözünürlüğü artırabilir49. Bununla birlikte, etikete özgü etiketleme genellikle mono-florofor etiketli proteinler verir ve bu da tespit edilmesi zor olabilir. Spesifik etiketlemenin başka bir yolu antikorlar kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Mikroakışkanlar kurulumu OT'nin mikroakışkanlar sistemi ile kombinasyonu, farklı deneysel koşullar arasında hızlı bir geçiş sağlar. Ayrıca, akım sistemleri akış hücresinin içindeki laminar akışı korumaktan yararlanır, bu da diğer kanallardan gelen sıvıların akış yönüne göre dik yönde karıştırılmasını önler. Bu nedenle, laminar akış özellikle deneysel tasarım için avantajlıdır. Şu anda, 5 kanala kadar akış hücreleri yaygın olarak dirilmektedir (Şekil 3).

<table><tbody><tr><td><güçlü>Bakteriyel Suşlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli HB101</td><td>laboratuvar koleksiyonu</td><td>N/A</td><td>vektörlerin klonlanması</td></tr><tr><td><güçlü>Kimyasallar ve enzimler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31424</td><td>Tamponlar</td></tr><tr><td>Biotin-16-dUTP</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td>Biyotinilasyon</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>Tamponlar</td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>Oksijen scavanger sistemi</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford Labs</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından DNAse I'i</td> Tamponlar <td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>Th.Geyer</td><td>11786181</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Tamponlar</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814320001</td><td>Tamponları</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>Oksijen scavanger sistemi</td></tr><tr><td>Glikoz-oksidaz</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>Oksijen scavanger sistemi</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>HN78.3</td><td>Tamponlar</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td>Tamponlar</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>Gibson montajı, klonlama</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Merck</td><td>529552-1KG</td><td>Tamponlar</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz</td><td>Takara Bio Clontech</td><td>R050A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Pirofosfotaz, termostabil, inorganik</td><td>NEB</td><td>M0296L</td><td>in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>RNaz İnhibitörü</td><td>Molox</td><td>1000379515</td><td>Tamponları</td></tr><tr><td>rNTPS</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>R0481</td><td>in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>Sodyum tiyosülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6672-500G</td><td>Çamaşır suyu deaktivasyonu</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>konfokal ölçümler</td></tr><tr><td>T4 DNA Polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>Biyotinilasyon</td></tr><tr><td>T5 eksonükleaz</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>Gibson düzeneği, klonlama</td></tr><tr><td>T7 RNA polimeraz</td><td>Şirket içinde üretilen</td><td>N/A</td><td>in vitro transkripsiyon</td></tr><tr><td>Taq DNA polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Taq ligaz</td><td>Biozym</td><td>L6060L</td><td>Gibson düzeneği, klonlama</td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td>Tamponlar</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monolit Protein Etiketleme Kiti RED-NHS 2.Nesil (Amin Reaktif)</td> <td>Nanotemper</td><td>MO-L011</td><td>Ribozom etiketleme için kullanılır</td></tr><tr><td>Purefrex 2.0</td><td>GeneFrontier</td><td>PF201-0.25-EX</td><td>Etiketleme için kullanılan Ribozomlar</td></tr><tr><td><güçlü > Oligonükleotidler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5' kolu T7 ileri</td><td>Microsynth</td><td>özel sipariş</td><td>5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', PCR 1'de OT in vitro transkripsiyon şablonu oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>3' kolu ters</td><td>Microsynth</td><td>özel sipariş</td><td>5' -&nbsp; GTCAAAGTGCGCCGTTATCC - 3', PCR 1'de OT in vitro transkripsiyon şablonu oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>5' tutamak ileri</td><td>Microsynth</td><td>özel sipariş</td><td>5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3', PCR 2'de 5' tutamak oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>5' tutamak ters</td><td>Microsynth</td><td>özel sipariş</td><td>5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', PCR 2'de 5' tanıtıcı oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>3' tutamak ileri</td><td>Microsynth</td><td>özel sipariş</td><td>5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', PCR 3'te 3' tutamak oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>3' tutamak ters 5' digoxigenin</td><td>Microsynth</td><td>özel sipariş</td><td>5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3' ile etiketlenmiş, PCR 3'de 3' tutamak oluşturmak için kullanılır 3</td></tr><tr><td><güçlü>DNA vektörleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMZ_OT</td><td>şirket içinde üretilmiştir</td><td>N/A</td><td>"Kardiyovirüs 2A proteininin yapısal çalışmaları, RNA tanıma ve translasyonel kontrol için moleküler temeli ortaya koymaktadır" bölümünde daha fazla açıklama Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Çalışkan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td></tr><tr><td>Yazılım ve Algoritmalar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atom</td><td>https://atom.io/packages/ide-python</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Bluelake</td><td>Lumicks</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad</td><td>https://www.graphpad.com/</td> <td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>InkScape 0.92.3</td><td>https://inkscape.org/</td> <td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PATATES</td><td></td> https://github.com/lpekarek/POTATO.git <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RNA yapısı</td><td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td><td>N/A</td> Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Diğer</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Kaplı Polistiren Parçacıkları, 1.5-1.9 & mikro; m, 5 ml, %1.0 w/v</td><td>Spherotech</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoksigenin Kaplı Polistiren Partikülleri, 2.0-2.4 & mikro; m, 2 ml, %0,1 w/v</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>Şırıngalar</td><td>VWR</td><td>TERUMO SS+03L1</td><td></td></tr><tr><td>Devices</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-trap</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Konfokal mikroskopi ile birleştirilmiş optik cımbız</td></tr></tbody></table>

Çeviri yönetmeliğinde rna-protein etkileşimlerini İncelemek için optik cımbız

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA, işlevleri için gerekli olan ve böylece hücredeki çeşitli süreçleri etkileyebilen çeşitli yapısal kıvrımları benimsemiştir. Ek olarak, bir RNA'nın yapısı ve işlevi proteinler, metabolitler veya diğer RNA'lar gibi çeşitli trans-etkili faktörler tarafından modüle edilebilir. Örneğin, karek değiştirme RNA molekülleri, ribozomları alternatif bir açık okuma çerçevesine yönlendiren ve böylece gen anahtarları olarak hareket eden kodlama bölgelerinde bulunan düzenleyici RNA'lardır. Ayrıca proteinlere veya diğer trans faktörlere bağlanmasından sonra farklı kıvrımları benimseyebilirler. RNA bağlayıcı proteinlerin çevirideki rolünü ve RNA yapısını ve stabilitesini nasıl modüle ettiklerini incelemek için, bu RNA-protein komplekslerinin etkileşim ve mekanik özelliklerini aynı anda incelemek çok önemlidir. Bu çalışma, RNA-protein komplekslerinin konformasyonsal ve termodinamik manzarasını yüksek çözünürlükte keşfetmek için tek moleküllü floresan bağlantılı optik cımbızın nasıl kullanılacağını göstermektedir. Örnek olarak, SARS-CoV-2 programlı ribozomal çerçeve değiştirme elemanının çinko-parmak antiviral proteininin trans-etkili faktör kısa izoformu ile etkileşimi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ek olarak, floresan etiketli ribozomlar konfokal ünite kullanılarak izlendi ve bu da sonuçta çeviri uzamasının incelenmesini sağlayacaktı. Floresan bağlantılı OT tahlili, çeviriyi düzenleyen çeşitli RNA-protein komplekslerini veya trans-etkili faktörleri araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir ve RNA tabanlı gen düzenleme çalışmalarını kolaylaştırabilir.

Bu bölümde ağırlıklı olarak floresan optik cımbız ile RNA-protein/ligand etkileşimlerinin ölçümlerine odaklanılmalıdır. Genel RNA optik cımbız deneylerinin ve buna karşılık gelen temsili sonuçların açıklaması için bkz. RNA/DNA-protein etkileşimlerinin daha ayrıntılı tartışılması için ayrıca bkz.
Prensip olar...

Bu protokol, optik cımbız kullanarak RNA-protein etkileşimlerini incelemek için eksiksiz bir deneysel iş akışı sunar. Optik cımbızın konfokal mikroskopi ile kombinasyonu da dahil olmak üzere çeşitli olası deneysel kurulumlar özetlenmiştir.

Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Aşağıdaki yöntem makalesinin genel amacı, konfokal mikroskopi ile birleştirilmiş optik cımbız kullanarak proteinlerle veya diğer faktörlerle RNA etkileşimlerini incelemek için yararlı bir protokol göstermektir. Son on yılda, tek makromoleküllerin özelliklerini araştırmak için çeşitli sofistike teknikler geliştirilmiştir. Bu tekniklerden biri de tek molekülli optik cımbızdır.Yeni floresan destekli optik cımbızla, sadece RNA moleküllerinin açılmak için gerekli kuvvetlerin yanı sıra çeviri sırasındaki bağlama olayları ayrıntılı olarak izlenebilir. Burada, RNA moleküllerinin çeviriyi düzenleyen faktörlerle ve işlemeden gerildiği ölçümlere odaklanıyoruz. Ayrıca, etiketli ribozomlar kullanılarak çeviriyi izlemek için tekniğin nasıl uygulanabileceğini de göstermektedir.Protokol, grubumdaki iki yüksek lisans öğrencisi Lukas Pekarek ve Stefan Park tarafından gösterilecek. Bu videoda, optik cımbız deneyinin kurulumu ve yürütülmesinde size rehberlik edeceğiz. Ayrıca basit veri analizi iş akışını da özetliriz.Bu tekniğin avantajı basit ve sağlam olmasıdır. Bir molekül iki boncuk arasında bağlanır, lazer ışınlarının odağına bağlanır ve yer değiştirme üzerine değişim ve kuvvet, kuvvet rampası deneylerinde tam olarak ölçülebilir. Bir bağın içindeki ikincil yapılar, molekülün iç enerjiye bağlı olarak belirli bir kuvvette ortaya çıkıyor.Birden fazla yapı arasındaki bu dinamik geçiş, sabit kuvvet ölçümleri ile daha fazla araştırılabilir. Ayrıca, floresan görüntülemenin paralel kullanımı, bağlama olaylarını gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için kullanılabilir. Bir bağın belirgin bir kuvvet mesafesi profili, stabilitesini etkileyen potansiyel işlem faktörlerinin bağlanmasından sonra değişebilir.İlk olarak, ilgi çekici RNA bir DNA vektörüne klonlandırılmalıdır. Bu dizinin yukarı ve aşağı akışı, boncuklar arasında son DNA-RNA yapısını bağlamak için ek parçalar, tutamaklar gereklidir. Plazmidde başarılı klonlama ve amplifikasyondan sonra üç farklı PCR reaksiyonu gerçekleştirilir.Her PCR reaksiyon için, reaktifleri protokoldeki tablo bire göre karıştırın. PCR'ı uygun bir termal çevrimde 50 mikroliter aliquots'ta çalıştırın. İlki, sonraki in-vitro transkripsiyon için T7 promotörü ile tüm yapının çift iplikli DNA'sı ile sonuçlanır.İkinci PCR beş asal tutamak üretir. Oysa son reaksiyon üç asal tutamakla sonuçlanır. Kullanılan boncuklara göre hem 5 asal hem de 3 asal tutamak etiketlendirilmelidir.Üç asal tutamak PCR sırasında ters astar etiketli bir digoksitin kullanılarak etiketlenir ve beş asal tutamak biyotinilasyon yoluyla ekstra bir adımda etiket edilmelidir. Beş asal sapın üç asal biyotinilasyonu T 40 ve bir polimeraz kullanılarak gerçekleştirilir. Reaksiyon oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca gerçekleştirilir.Daha sonra, T7 polimeraz kullanarak in-vitro transkripsiyonu gerçekleştirin. RNA'nın uzunluğuna bağlı olarak reaksiyonun 37 derecesini iki ila dört saat boyunca kuluçkaya yatırın. Son bir adımda, tutamaklar, çift iplikli tutamaklar arasındaki tek iplikli ilgi alanı ile son DNA-RNA yapısını elde etmek için in-vitro transkripsiyondan RNA ile tavlanır.İstenilen RNA-DNA melezini tavlamak için sapları ve RNA'yı tavlama tamponunda karıştırın. Isı, tavlama karışımı 10 dakika boyunca 85 dereceye kadar ve ardından numuneyi yavaşça dört dereceye kadar soğutun. Tavlanmış numuneyi üç azı dişi sodyum asetat hacminin 1/10'u ve üç hacimli buz soğuk etanol ile karıştırın ve en az bir saat boyunca eksi 80 derece kuluçkaya yatırın.Numuneleri 15.000 xg'de 30 dakika boyunca dört derecede santrifüj edin. Süpernatant atın ve peletin vakum altında kurutun. Yeniden kullanılan peletlerin küçük aliquotları sıvı nitrojen içinde dondurulur ve kullanılana kadar eksi 80 derecede tutulur.İlk önce çamaşır suyunu şırınnalardan çıkarın ve bir mL RNase içermeyen su doldurun. 50 mikroliter 0,5 molar sodyum tiyosülfat ekleyin ve sistemi tek çubukla yıkayın. Sistemdeki hava kabarcıklarını önlemek için mikroakışkan sistemin asla kuru olmadığına dikkat edin.Daha sonra, kalan sodyum tiyosülfat çözeltisini atın ve şırıngları yenileriyle değiştirin. Daha sonra en az 0,5 mL RNase içermeyen su ile tekrar yıkayın. Makinenin optik sistemini kurmak için hedefe iki damla daldırma yağı koyun.Akış hücresini yerine yerleştirin ve sıvı akış hücresine dokunana kadar hedefi yükseltin. Daha sonra akış hücresinin üzerine iki damla daldırma yağı koyun. Şimdi tuzak direksiyon ünitesini ve bindirme lazerini açın.Amaç, makinenin tanı kameralarının Z bulucu aracı kullanılarak ayarlanır. Mikro vida döndürülerek, Z ekseni ikinci ve üçüncü yansıma arasındaki odanın ortasına ayarlanır. Kırılma halkalarının en büyük olduğu yer.Tanı kameralarını ay moduna geçirin ve bindirme lazerini yaklaşık% 50'ye düşürün, ardından kondenseri 20'ye düşürün ve konumunu yaklaşık 10 ışık bandı görecek şekilde ayarlayın. Ölçüm odasının beş kanalı vardır ve deneyden önce farklı kurulum olanakları göz önünde bulundurulmalıdır. Basit bir kuvvet rampası deneyi için boncuk-tampon boncukları uygun bir kanal düzenlemesidir.Floresan ribozomlar veya işlem faktörleri gibi dördüncü bileşikle yapılan ölçümler için boncuk-boncuk tampon faktörü daha iyi bir düzenlemedir, ancak boncuk yakalamayı zorlaştırır. Tavlanmış yapının bir aliquot'ı üç mikroliter AD boncuk süspansiyonu, bir mikroliter RNaz inhibitörü ve 10 ila 20 dakika boyunca oda sıcaklığında test tamponunun sekiz mikroliteri ile inkübe edilir. Daha sonra numune 500 mikroliter test tamponunda seyreltilir ve ilgili kanala konur.İkinci tür boncuklar için, 0,8 mikroliter tahlil boncukları bir mL tahlil tamponu ile karıştırılır ve ilgili kanala uygulanır. Kanallar açılır ve düşük basınçla yıkanır. Şimdi bindirme lazerini aç.Boncukları yakalamak için lazerler birbirinden ayrılır ve bir AD boncuk tuzak bire yakalanır. Daha sonra sahne SA boncuk kanalına taşınır ve bir boncuk ikinci tuzağa yakalanar. Boncukları kaybetmemek veya aynı tuzakta ikincisini yakalamak için aşama arabellek kanalına taşınır ve tüm kanallar kapatılır.Tamponda, bir bindirme kalibrasyonu gerçekleştirilir. Yakalanan boncuklar sonraki ölçümler için görsel şablonlar olarak ayarlanmalıdır. Ve benzerlik puanı, karşılaştırılabilmeyi garanti etmek için ölçümler arasında% 90'ın üzerinde tutulmalıdır.Son olarak, boncuklar birbirine yakınlaştırılır ve tek bir bağ yakalamaya başlayabilir. Bu, boncukları birkaç saniyeliğine yakın bir şekilde hareket ettirerek ve ardından boncukları yavaşça tekrar terk ederek yapılır. Bir bağ oluşumu, iki boncuk birbirinden uzaklaştıktan sonra ölçülen kuvvetin artmasına neden olur.Bağlamaların sayısı ve kalitesi, aşırı uzanma platosu bulunarak kontrol edilebilir ve yörüngeyi serbestçe birleşmiş zincir veya solucan benzeri zincir modeli ile karşılaştırabilir. Geniş plato, tek bir bağ için 50 ila 60 piconewton arasında olmalıdır. Floresan ölçümlerini gerçekleştirmek için konfokal lazerleri açın ve ünite ve optik cımbız makinesinde foton sayımını açın.Daha sonra, istenen dalga boyunun ve yazılım arayüzünün uyarlama lazerini açın ve florofora bağlı olarak lazerin gücünü% 5 veya daha yüksek olarak ayarlayın. Artık yazılımın görüntü veya kimograf fonksiyonları kullanılarak görüntüleme başlatılabilir. İyi odaklanmış görüntüler elde etmek için, konfokal mikroskop ve optik tuzakların odak düzleminin hizalı olduğundan emin olun.Bu amaçla mavi lazer kanalındaki polistiren boncukların otoflüoresansı kullanılabilir. Boncukların otofluoresansı en yüksek çapa ulaşana kadar optik tuzakların odak düzlemi ile yukarı ve aşağı hareket edin. Bu pozisyonda, bağlı molekülde gerçekleşen floresan sinyalleri tespit edilebilir.Her iki işlev için de uygun ilgi alanlarını seçmek önemlidir. Ölçüm boyunca tampon bileşimi, boncukların farklı kanallara taşınması veya mikroakışkan sistemde sağlanan tamponun değiştirilmesiyle kolayca değiştirilebilir. Fotobleaching önlemek için, ölçüm değilken her zaman excitation lazer kapatın.Cihazdan gelen ham veri çıkışı genellikle çok fazla gürültü içerir. Bu nedenle, dağınık verileri daha fazla analiz etmek için, önce bunları önceden işlemek gerekir. İlk adım, numuneyi aşağı çekmek ve verileri düşük geçişli Butterworth filtresiyle filtrelemektir, iyi sonuçlar elde edilmiştir.Kuvvet rampası deneyleri için, açılan olayların ilk mesafe eğrisinin ilgili katlanmış ve açılmamış bölgelerinde işaretlenmiş olması gerekir solucan benzeri zincir veya serbestçe eklemlenmiş zincir modelleri kullanılarak takılabilir. Sabit kuvvet verileri için, zaman üzerindeki mesafe çizilebilir ve belirli bir kuvvetteki baskın uygunluğu ölçmek için bir histogram oluşturmak yararlıdır. Burada, filtre parametrelerinin farklı katlama durumlarını ayırt etmek için çok önemli olduğu gösterilmiştir.Bu teknikle neler başarılabilir daha iyi anlamak için bazı temsili sonuçlar gösterilmiştir. Bir kuvvet rampası deneyinden standart bir kuvvet mesafesi eğrisi böyle görünür. Bu durumda SARS-coronavirus-2 kare değiştirme elemanını inceledik.15 piconewton civarında birden fazla adımda açılma gözlemledik. Yön tersine çevrildiğinde ve boncuklar tekrar yaklaştığında, bağ biraz daha düşük kuvvette geri katlanır. Çinko parmak antiviral protein ZAP varlığında aynı RNA'yı ölçtürürken, benzer bir açılma patörü gözlendi.Ancak RNA'nın ikincil yapısı yeniden kata çıkmadı. Bu, protein bağlamanın RNA kinetiği üzerinde ne kadar büyük bir etkisi olabileceğini göstermek için iyi bir örnektir. Sürekli kuvvet verilerine bakıldığında, ortaya çıkan kinetikler daha fazla araştırılabilir.Zaman içinde mesafe farklı kuvvetler için çizilir ve sağda farklı gözlemlenen durumların histogramı eklenir. 10 piconewton'da, RNA tamamen katlanmış durumdadır. 11.5 piconewton'da eyaletler arasında geçiş yapılır ve 13 piconewton'da RNA kalıcı olarak açılmamış bir durumdadır.Bununla birlikte, SARS-coronavirus-2 kare kaydırma elemanı ZAP ile birlikte ölçüldüğünde, RNA 11 piconewton'da tamamen açılmış durumdaydı ve hatta 10 piconewton'da katlanmış bir duruma doğru çok az geçiş gösterdi. Bu, ZAP'ın tek bir iplikli çerçeve kaydırma elemanına bağlandığını ve ikincil bir yapının oluşumunu engellediğini gösterir. Son olarak, konfokal mikroskopi ile birleştirilmiş bazı optik cımbız verilerine bakacağız.Bu deneyde, çift iplikli nükleik asitleri etiketleyen bir floresan boya kullanıldı, özellikle artan kuvvetle değil. Kimograf, boncuklar birbirinden uzaklaştıkça floresan yoğunluğunun arttığını ve bağ çok fazla gerildikten ve koptuğunda tamamen kaybolduğunu göstermektedir. Son rakamda floresan etiketli ribozomlar kanal 4'e eklendi.Bu deneyde RNA bağına özgü ribozom bağlanması gözlenmiştir. Umarız bu video size optik cımbızlar ve bu inanılmaz tekniğin neler yapabileceği hakkında bir fikir vermiştir.

optical-tweezers-to-study-rna-protein-interactions-translation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, mRNA'daki adenilat-üridilat açısından zengin element (ARE) dizileri ile etkileşime giren RNA bağlayıcı proteinleri (RBP'ler) tanımlamak için bir in vitro RNA aşağı çekme testini göstermektedir. Bir hücre lizatından gelen hedef RBP'ler, RNA-protein kompleksleri oluşturmak için bir RNA probu ile karıştırılır. Kompleksler, RNA probunun destiyobiyotin etiketinin streptavidin etiketli bir manyetik boncuğa afinitesi kullanılarak afinite saflaştırması yoluyla izole edilir.

Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Optik cımbız, tek tek molekülleri 5' ve 3' uçlarından gererek RNA katlanmasını incelemek için kullanılmıştır. Burada, cımbızlama için RNA moleküllerini sentezlemek, aletin kalibrasyonu ve tek molekülleri manipüle etmek için yöntemler için yaygın prosedürler açıklanmaktadır.

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Vitro becerisini ölçmek için Toeprinting amaçları için formu çeviri başlatma kompleksleri ile ribozomlara koşulları çeşitli altında RNA transkripsiyonu. Bu iletişim kuralı toeprinting memeli RNA için bir yöntem açıklanır ve kap-bağımlı ve IRES uygulamalı çeviri çalışma için kullanılabilir.

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Endogenously kurulan mRNA-protein kompleksleri kurtarılması için bir tandem RNA izolasyon yordam (seyahat) açıklanmıştır. Özellikle, çapraz vivo içindeRNA-protein kompleksleri vardır, poliadenile RNA'ların özleri ile oligo(dT) boncuk etkilenmezsiniz ve belirli mRNA'ların değiştirilmiş RNA antianlamlı oligonucleotides ile yakalanır. MRNA'ların için bağlı proteinler immunoblot analizi ile tespit edilir.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

Bu yöntemle, RNA bağlayıcı proteinlerin (RBPs) bağlayıcı benzeşimini, bakteriyel hücrelerde basit, canlı ve muhabir bir tahlil kullanarak bilat ve bileksiz bağlayıcı sitelere göre ölçeceğiz. Tahlil bir muhabir geni baskının dayanmaktadır.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

Çift DNA cetvel tahlil ribozom translocation sırasında mRNA konumunu belirlemek için geliştirilmiştir, hangi oluşmuş DNA-mRNA dubliklerin ayrışma güçleri dayanır. Tek nükle çözünürlüğü ve mRNA 'nın her iki ucunda ulaşmanın yeteneği ile, ribozom translokasyon ve prob diğer nüklik asit yerleşimleri için mekanik öngörüler sağlayabilir.

Çift DNA cetvelleri tek Nükledotid çözünürlüğe sahip Ribosome translocation mekanizmasını Incelemek için

Tek moleküllü floresan enerji transferi ribozomal protein sentezi sırasında tRNA dinamiklerini izleyen bir yöntemdir. Bireysel ribozomları izleyerek, mekanizmalara ışık tutan inhomogeneöz popülasyonlar tanımlanır. Bu yöntem, diğer birçok karmaşık biyosistemdeki dinamik işlev ilişkilerini ortaya çıkarmak için genel olarak biyolojik konformasyon değişikliklerini izlemek için kullanılabilir. Tek molekül yöntemleri, ortalama etki nedeniyle geleneksel topluluk yöntemleriyle erişilemeyen oransız...

Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

Burada, insan hücrelerinden toplam protein ekstraktını, biyotinile RNA ile kaplanmış streptavidin boncuklarını ve kütle spektrometri analizini kullanarak, spesifik RNA dizilerinin protein interaktörlerini ortaya çıkarmak, ölçmek ve doğrulamak için optimize edilmiş bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Öğrenin optik cımbız ve konfokal mikroskopi kullanarak RNA-protein etkileşimlerini inceleme yöntemini. Bu teknik, translasyon düzenlemesindeki bağlanma olaylarını ve kuvvet ölçümlerini gerçek zamanlı izlemenizi sağlar.

Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız

Daha fazla video keşfet