1-Cyano-4-Dimetilamiopyridine Tetrafluoroborate (CDAP) kullanılarak Çözünür Polisakkaritlerin Aktivasyonu ve Konjugasyonu

Polisakkaritler proteine bağlı olmadıkça zayıf immünojeniktir ve proteinlere türetme veya konjugasyon için aktive edilmesi gerekir. Bu yöntemde CDAP kumlama reaktifi olarak kullanılır. CDAP, polisakkarit hidroksilleri türetmek veya aşılarda veya tanısal reaktiflerde kullanılmak üzere proteinlere bağlanmak üzere aktive eder.

CDAP büyük ölçüde siyanojen bromürün yerini polisakkarit kumlama reaktifi olarak almıştır. CDAP kullanımı daha basit, daha verimlidir ve siyanojen bromürden daha düşük bir pH'da kullanılabilir. Reaktifi aktive etmek çok daha iyi.

CDAP, vicinal hidroksil gerektiren indirgeyici aminasyonun aksine, çoğu polisakkaritle kullanılabilir. Kimya, proteinlere hem doğrudan hem de dolaylı olarak konjuge etmek için kullanılabilir ve tanısal reaktifler yapmak için kullanılabilir. CDAP aktivasyon reaksiyoni, başlangıçta açıklandığı gibi, çok hızlı ve kontrol etmek zordu.

Burada sağlanan protokol, kimyanın gerçekleştirilmesini çok daha kolay ve çok daha tekrarlanabilir hale getirir. Deneye başlamadan önce, karıştırırken damla yönünde 200 mikrolitre dimetilaminopyridin stok çözeltisi ekleyerek polisakkarit çözeltisinin pH'ını 9'a ayarlayın. Aktivasyonun tüm süreci boyunca reaksiyonun buzlu su banyosunda soğutulmasına devam edin.

Karıştırırken 100 mikrolitre CDAP'yi polisakkarit çözeltisine aktararak cyano-dimetilaminopyridine-tetrafluoroborate veya CDAP aktivasyonu ile devam edin. Zamanlayıcıyı başlatın ve tüm etkinleştirme sırasında pH değişimini 15 dakika boyunca izleyin. 0,1 molar sodyum hidroksitten oluşan 10 mikroliter artışı ekleyerek hedef pH'daki reaksiyonun korunmasını sağlayın.

En uygun aktivasyon süresine ulaşıldığında, aktif polisakkaride aynı anda iki mililitre 0,5 molar adipic dihidrazit ekleyin. pH'ın hidroksit fonksiyonelleştirme için gerekli aralıkta olup olmadığını kontrol edin. Reaksiyon karışımının en az bir saat boyunca sürekli karıştırılmasının ardından, reaksiyon karışımını dört santigrat dereceye aktarın.

Üründen ADH konsantrasyonu azaltmak için, diyaliz cihazını kullanarak ham türetilmiş polisakkarit çözeltisini dialyze edin. Türetilmiş polisakkaritleri diyalizden kurtarın ve hidrazürü polisakkarit oranına hesaplamak için polisakkaritlerin ve hidrazürün konsantrasyonunu belirleyin. Standart olarak kullanılmak üzere mililitre değiştirilmemiş polisakkarit çözeltisi başına bir miligram hazırlayın.

Isıtma bloğunu, sabit bir homojen sıcaklığa ulaşmak için en az bir saat boyunca 140 santigrat dereceye ısıtın. Asit dökülmesi durumunda ısıtma bloğunun altında ve çevresinde koruyucu bir ped kullanın. Üç taraflı olarak etiketli 13'e 100 borosilikat test tüpüne mililitre karbonhidrat standardı başına bir miligramlık değişen hacimler ekleyin ve istenen standart konsantrasyonları elde etmek için hacmi su ile 100 mikrolitreye kadar yapın.

Benzer şekilde, üç örnek tüpe beş mikrogram türetilmiş polisakkarit içeren bir hacim ekleyerek numune tahlilleri ayarlayın. Her tüpe mililitre resorcinol başına 100 mikrolitre taze hazırlanmış altı miligram ekleyin. Tekrar bir pipetter kullanarak, her tüpe hazırlanan% 75 sülfürik asitin 300 mikrolitresini ekleyin, tüpleri kuvvetli bir şekilde girdaplayın, tüpü uzağa yönlendirin, ardından tüm tüpleri sıralı olarak sabit bir hızda bir ısıtıcı bloğuna yerleştirin ve hemen zamanlayıcıyı üç dakika ayarlayın.

Üç dakika içinde tüpleri aynı sırayla çıkarın ve doğrudan buzlu su banyosundaki bir rafa yerleştirin. Buz gibi tüpleri çıkararak oda sıcaklığına beş dakika boyunca dengede olmalarını bekleyin. 10 milimetre yol uzunluğunda bir cuvette kullanarak 430 nanometrede UV-Vis spektrofotometreslerindeki tüm tüplerin emiciliğini okuyun.

Test reaksiyonları ayarlamak için, etiketli standart tüpleri artan konsantrasyon sırasına göre tüp rafında sıralayın ve düzenleyin. Kalibre edilmiş bir mikropipette kullanarak, ilgili her tüpe 100 mikrolitre standart ekleyin. Sıfır standart için, numune tamponunun 100 mikrolitresini kullanın.

Benzer şekilde, numune tüplerini hazırlayın ve düzenleyin. Daha sonra kalibre edilmiş 1.000 mikrolitre mikropipette kullanarak, tüm test tüplerine 875 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Test reaksiyonuna başlamak için, beş dakika içinde önceden belirlenmiş sırada her test tüpüne 25 mikrolitre%1 trinitrobenzen sülfikonik asit ekleyin.

Test tüplerini yüksek hızda iki saniye boyunca vorteks edin, sıvının tüp açıklığından yarım inç yüksekliğe kadar döndüğünden emin olun. Test başlangıç saatini kaydedin ve zamanlayıcıyı iki saat olarak ayarlayın. Daha sonra test tüpü rafını iki saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta yerleştirin.

Zaman bittiğinde, tüpleri girdap ve veri toplamaya devam edin. ADH dektranı resorcinol sülfürik asit tahlili kullanılarak dektran için test edildi. Şeker standardı olarak glikoz kullanan tipik bir standart tüp çizildi.

Türetilmiş polisakkarit veya dektrandaki hidrazit içeriği TNBS tahlili kullanılarak belirlendi. Derivatizasyon seviyesi, farklı ortalama moleküler ağırlıklardaki polimerler arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için 100 kilodalton dektran başına hidrit olarak hesaplandı. Burada açıklanan protokolün belirli bir polisakkarit için uyarlanmış olması gerekebilir.

CDAP kimyası, çok çeşitli konjugasyon reaktifleri ile kullanılmak üzere polisakkaritleri işlevselleştirmek için kullanılabilir. Örneğin, ELISA'larda kullanılmak üzere polisakkaritleri biyotinillatlamak için kullanılabilir. Proteinler doğrudan CDAP ile aktive polisakkaritlere bağlanabilir, ancak bu genellikle belirli bir polisakkarit için biraz optimizasyon gerektirir.

Konjugasyon verimi% 75'in üzerinde olabilir CDAP kimyasının kullanımı, örneğin Hindistan Serum Enstitüsü tarafından yapılanlar gibi düşük maliyetli konjuge aşıları etkinleştirdi.