Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Bu protokolde açıklanan lipid bilayer membranlarının yapımı, membranların farmasötik ajanlar, çevresel toksik maddeler ve hatta biyolojik bileşiklerle etkileşimleri hakkında önemli bilgiler elde etmek için kullanılabilir. Bu teknikler, değişen sıvı karmaşıklığındaki membranları imal etmek ve membranların içine bileşik geçirgenliği, emilimi ve gömmeyi değerlendirmek için kullanılabilir. Başlamak için, rehidrasyondan sonra mililitre başına 2,5 miligramlık son bir vezikül konsantrasyonu elde etmek için uygun hacimde lipid stok çözeltisini temiz bir cam aşağılığa ekleyin.

Azot gazı akışı kullanarak lipid çözeltisinden kloroformu çıkarın. Kloroformun tamamen çıkarılmasını sağlamak için kurutulmuş lipit filmini en az dört saat boyunca vakuma bağlayın. Mililitre başına 2,5 miligramlık son veziklin konsantrasyonu ve yaklaşık 15 ila 30 saniye boyunca girdap elde etmek için kurutulmuş lipid filmini gerekli miktarda Tris sodyum klorür tamponu ile yeniden sulandırın.

Vezikli süspansiyonu yaklaşık 30 dakika donana kadar kuru buzlu bir kaba aktarın. Numune tamamen dondurulduktan sonra, süspansiyonu 30 ila 40 santigrat derecelik bir su banyosunda çözün. Çözülmüş veziklin süspansiyonu girdap.

Bir mililitre veya daha az vezne yapmak için mini bir ekstrüder elde edin. Bir filtre desteğini ultra saf suyla önceden ıslatın, ardından O halkasının içindeki membran destek yüzeyi üzerine yerleştirin. İkinci iç membran desteği için tekrarlayın.

Ekstrüder dış kasasına bir iç membran desteği yerleştirin. Bir adet 100 nanometre polikarbonat membranın doğrudan filtre desteğinin üzerine iç membran desteğine yerleştirin. İkinci iç membran desteğini, polikarbonat membrana bakan O halkası ve filtre destek tarafı ile ekstrüder dış kasaya yerleştirin.

Politetrafloroetilen rulmanı tutucu düğümüne takın ve ekstrüder dış kasa ile kapatarak vidalayın. Ekstrüderi ısıtma bloğuna kırpın. Lipid vesicle süspansiyonunu şırıngalardan birine yükleyin ve şırıngayı ekstrüder ısı bloğuna yerleştirin ve iğneyi ekstrüderin bir ucuna tam olarak yerleştirin.

İkinci boş şırınnayı karşı tarafa yerleştirin ve ısı bloğundaki kol klipslerini kullanarak her iki şırınnayı da kilitleyin. Veziklin süspansiyonu yavaşça boş şırıngama ve ardından orijinal şırıngama geri itin. Polikarbonat membrandan toplam 21 geçiş için 20 kez daha tekrarlayın.

Lipid veziküllerini depolama için temiz bir cam aşağılık içine aktarın. Beş ila 50 mililitre veziklin ekstrüde etmek için, büyük delikli ekran desteğini, ortalanmış diski, drenaj disklerini ve polikarbonat membranını ekstrüder alt desteğindeki boşluğa yerleştirerek büyük ekstrüderi monte edin. Dört vidayı kullanarak ekstrüder üst ve alt desteklerini bağlayın ve sıkın.

Ekstrüder ünitesini tabana ovarak ve sabitlemek için bir anahtarla sıkarak numune silindirine takın. Numune silindirini ultra saf suyla doldurun ve numuneyi numune silindirine eklemeden önce suyu ekstrüder ünitesinden geçirin. Lipid vesicle süspansiyonu numune silindirine ekleyin ve üstünü kapalı vidaleyin.

Numune ekstrüder ünitesinden temiz bir cam aşağılık içine saniyede yaklaşık iki ila üç damla oranında damlamaya başlayana kadar basıncı yavaşça artırın. Tüm numune ekstrüde edildikten sonra, azot kaynağını kapatın ve basınç tahliye vanasını yavaşça açarak numune silindirindeki basıncı serbest bırakın. Lipid vesicles'ı örnek silindire geri dökün ve toplam 10 ekstrüzyon için önceki adımı dokuz kez daha tekrarlayın.

Veziklin süspansiyonu uygun cuvette içine yükleyin ve dinamik ışık saçılma aletine takın, numune ayrıntılarını girin ve ilgili yazılımı kullanarak ölçümü gerçekleştirin. Zeta hücresini numune odasına yerleştirin, elektrotların temas etmesini sağlayın ve numune tutucu kapağını kapatın. İlişkili yazılımda, örnek ayrıntıları girin ve ölçümleri toplayın.

Silika kodlu kuvars kristal sensörini akış modülüne yerleştirin, kristal üzerindeki T şeklinin modüldeki T şekliyle hizalanmasını sağlayın ve akış modülini vidalayın. Birden fazla hazneli enstrümanlarda, paralel olarak ek iki katmanlı oluşturulabilir. Giriş ve çıkış borularını akış modülüne ve pompaya bağlayın.

Boruyu tutma korumalarına yerleştirin ve analizör sisteminin kapağını kapatın. Harcanan çözeltileri toplamak için pompanın çıkışına bir atık konteyneri yerleştirin. Temizliği yapmak için önce pompayı açın ve akış hızını dakikada 400 mikrolitreye ayarlayın.

Giriş borularını ultra saf suya yerleştirin ve modülden beş ila 10 mililitre akar. Boruyu SDS'ye geçirin ve modülden beş ila 10 mililitre akın. Boruyu tekrar ultra saf suya geçirin ve modülden 10 ila 20 mililitre akış.

Son olarak, kalan bir çözelti toplanmadan modülün içinden hava akışı. Sensörü akış modülünden çıkarın ve sensörü ultra saf suyla durulayın. Sensörü ve akış modülünü azot gazı akışıyla sürün ve elektronun her zaman herhangi bir sıvı içermemesini sağlamak.

Kimyasal duman kaputunda, silika kaplı kuvars kristal sensörunu ultraviyole veya ozon temizleme cihazına yerleştirin. Cihazı açın ve en az iki dakika tedaviye izin verin. Sensörleri dikkatlice çıkarın ve akış modülüne geri döndürün.

İlişkili yazılımı bağlamak ve sıcaklığı destekleyici lipid bilayer oluşturmak için istenen değere ayarlamak için analizör aracını açın. Sıcaklığın istenen girişe sabitlenmesine izin verin. Ölçümü yapılandırın ve ölçüme başlamadan önce tüm sensör rezonans frekanslarını ve üç, beş, yedi, dokuz, 11 ve 13'ün aşırı tonları için dağılmasını bulun.

Tris sodyum klorürün modülden beş ila 10 dakika akmasına izin vererek taban frekansı değişiminin veya Delta F ve dağılım değişiminin veya sıvıdaki Delta D değerlerinin sabit kalmasını sağlayın. Pompayı durdurun, giriş borularını Tris sodyum klorür çözeltisinden çıkarın ve lipid veziklin çözeltisine dikkatlice yerleştirin. Giriş tüpünden herhangi bir hava kabarcığını çıkarmak için beş saniye boyunca geri akış ve ardından ileri akışa devam edin.

Temel sıfırlamak için yazılımdaki ölçümü yeniden başlatın. Veri toplama yazılımında bilayer oluşumu gerçek zamanlı olarak gözlenene kadar lipid vesikles akışı. Daha sonra lipid veziklin giriş borularını Tris sodyum klorür tamponu olarak değiştirmek için bu adımı tekrarlayın.

0,45 mikro metre gözenek boyutuna sahip gözenekli polivinylidene difluorid 96 kuyulu çok ekranlı filtre plakası olan donör bölmesine lipid çözeltisinin beş mikrolitresini ekleyin. Filtre plakasını hemen 300 mikrolitre fosfat tamponlu salin içeren bir taşıma alıcı plakası olan alıcı bölmesine batırın. Taşıma donör bölmesine 200 mikrolitre fosfat tamponlu salin ekleyin.

Pompayı durdurma ve giriş borularını lipid veziklit çözeltisine dönüştürme ve bilayer oluşumunu gözlemlemenin önceki adımlarını izleyin, ardından giriş borularını alfa sarmal veya AH peptit çözeltisine değiştirin. Yeni çözelti ilavesinden frekans değişimi ve dağılma değişimi gözlenene kadar çözeltiyi akış modülüne sokun. Pompayı durdurun ve AH peptidinin veziklilerle 10 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin.

Giriş borularını Tris sodyum klorüre geçirin ve AH peptidi yırtılmış veziklikten çıkarmak için akışı başlatın ve bu da bir lipid bilayerinin başarılı bir şekilde oluşmasına yol açtı. İlk olarak, molekül çözücüyü akışa alın, ardından giriş borularını en az beş dakika boyunca ilgi molekülü ve akış içeren çözeltiye geçirin. İstenirse, akışı durdurun ve istenen molekülü içeren sıvının ikili ile kuluçkaya yatmasına izin verin.

Giriş borularını sadece molekül çözücüye değiştirin. En az beş dakika akın, ardından giriş borularını Tris sodyum klorüre geçirin ve en az beş dakika akar. Yazılımda ölçümü durdurun, dosyayı kaydedin ve pompayı durdurun.

Tek lipid askıya alınmış bir bilayer veya çok lipid asılı bir bilayer için önceki adımları takip ederek, PBS'yi donör filtre plakası bölmesinden çıkarın ve test çözeltisinin 200 mikrolitresi ile değiştirin. Hemen 300 mikrolitre PBS ile yeni bir taşıma alıcı plakasına batırın. 25 santigrat derecede iki saat boyunca hafif sallanma ile inkübasyondan sonra, donör ve alıcı bölmelerinden çözeltinin 150 mikrolitresini toplayın.

Bu molekülün özelliklerine göre uygun bir yöntem kullanarak her iki örnekteki molekül konsantrasyonu ölçülün. Uni-lipid yumurta PC veziklin büyüklüğü, polidispersiti ve Zeta potansiyeli ve iki multi lipid vesicle bileşimi karşılaştırıldı. Yumurta PC vezikülleri ve multi lipid bir veziküllerin boyut dağılımı neredeyse aynıydı.

Hem yumurta hem de PC multi-lipid bir veziklin negatif olarak şarj edilirken, multi-lipid iki vesicles pozitif olarak şarj edildi. Tek lipid yumurta PC veziklinler, frekans değişiminin azalması ve dağılma değişimindeki artış ve ardından spontan yırtılma ile gösterildiği gibi yüzeye kolayca emilir. Yüzeye emilen çok lipidli veziklinler, ancak veziklinleri yırtmak için AH peptid eklenmesini gerektirir ve bu da lipid bilayer oluşumuna neden olan.

Desteklenen lipid bilayerleri ile, ilgi çekici bir bileşik tanıtılmadan önce ve sonra frekans değişimi ve dağılma değişimi analiz edilebilir. Örneğin, DEHP ve çevresel toksik elementin desteklenen uni ile etkileşimleri ve katmanlar tarafından çok katmanlı olarak araştırılmıştır. Her iki lipid bilayer tipte de benzer deHP emilimi düzeyleri gözlendi.

Bununla birlikte, yumurta PC bilayer için görülen daha büyük bir dağılım değişikliği olan bilayerler arasında çoklu lipid bir bilayer ile karşılaştırıldığında dağılım değişiminde farklılıklar gözlenmiştir. Hem tek hem de çok lipidli bir bilayer için az geçirgenlik gözlendi. Bu prosedürden sonra, farmasötiklerden çevresel toksik edicilere kadar çeşitli bileşiklerle moleküler etkileşimlerin hücreden arındırılmış olarak taranmasını sağlamak için çeşitli hücre taklit edici lipid bilayerleri geliştirilebilir.