Name: Alerji Tanısı için Bazofil Aktivasyon Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Öğrenin bazofil aktivasyon testi ile IgE aracılı alerjik reaksiyonları akış sitometrisi kullanarak nasıl değerlendireceğinizi. İlaç, gıda ve solunum alerjenlerinin tanısında güvenli bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Claudia Corazza'ya paha biçilmez İngilizce dil desteği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, MINECO Sağlık Enstitüsü "Carlos III" (ISCIII) tarafından desteklenmiştir (ERDF tarafından ortaklaşa finanse edilen hibe: "Una manera de hacer Europa"; Hibe No. PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 ve RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Endülüs Bölge Sağlık Bakanlığı (Hibe No. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID, bir Klinik Araştırmacıdır (B-0001-2017) ve AA, her ikisi de Endülüs Bölge Sağlık Bakanlığı tarafından desteklenen bir Kıdemli Doktora Sonrası Sözleşmeye (RH-0099-2020) sahiptir (ESF tarafından ortaklaşa finanse edilmektedir: "Andalucía se mueve con Europa").

Protokol performansı Helsinki Deklarasyonu'na göre yürütülmüş ve yerel Etik Komitesi (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, İspanya) tarafından onaylanmıştır. Tüm denekler araştırma çalışması hakkında sözlü olarak bilgilendirildi ve ilgili bilgilendirilmiş onam formunu imzaladılar.
NOT: Mevcut protokol, yazarların günlük olarak kullandıkları BAT prosedürünü detaylandırmaktadır. Bununla birlikte, bu standartlaştırılmış bir yöntem değildir ve diğer yazarlar tarafından yayınlanan prosedürlerle farklılıklar vardır. Ana protokol modifikasyonları, IL-3'ün stimülasyon tamponunda kullanımı, uyaranla inkübasyon süresi, bazofil degranülasyonunu durdurma yöntemi ve akış sitometrisi stratejileri ile ilgilidir. Ayrıca, BAT için piyasada bulunan farklı kitler, üretici tarafından önerilen özel protokolleri içerir.
1. Numune hazırlama
<ol><li>9 mL heparinize tüplerde periferik kan toplayın ve deneysel protokol için gerekli olana kadar numuneyi bir rotorda oda sıcaklığında (RT) tutun.</li>
	<li>Negatif kontroller (2 tüp), pozitif kontroller (2 tüp) ve farklı alerjen/ilaç konsantrasyonları (test edilen her alerjen/ilaç konsantrasyonu başına 1 tüp) için 5 mL sitometre tüplerini etiketleyin. Tüpleri, tüplerin kaymadan mükemmel şekilde oturduğu bir rafa yerleştirin.</li>
	<li>%2 (v/v) HEPES, 78 mg/L NaCl, 3.7 mg/L KCl, 7.8 mg/L CaCl2, 3.3 mg/L MgCl2, 1 g/L HSA içeren çift damıtılmış suda stimülasyon tamponu hazırlayın. PH'ı 7,4'e ayarlayın ve 2 ng / mL'de IL-3 ekleyin. Genellikle 100 mL hazırlayın ve -20 ° C'de dondurulmak üzere 2.5 mL alikotlara bölün.</li>
	<li>PBS-Tween-20'de% 0.05 (v / v) (PBS-T) pozitif kontroller hazırlayın: Bazofillerin kalitesini doğrulamak için pozitif kontrol 1, N-Formilmetiyonil-lösil-fenilalanin (fMLP) (4 μM); Pozitif kontrol 2, IgE aracılı pozitif kontrol olarak Anti-IgE (0.05 mg/mL).</li>
	<li>Alerjeni/ilacı PBS-T'de istenen nihai konsantrasyonun 2 katında hazırlayın. NOT: Kullanılacak optimal alerjen/ilaç konsantrasyonları daha önce çok çeşitli konsantrasyonlar kullanılarak, doz-yanıt eğrileri ve aynı protokol adımları139'u izleyen sitotoksisite çalışmaları ile belirlenmelidir.</li>
</ol>2. Boyama karışımı hazırlama
<ol><li>Florokrom ile etiketlenmiş monoklonal antikorları, üreticinin önerdiği antikor konsantrasyonunu takiben veya önceki antikor titrasyonunu takiben stimülasyon tamponuna ekleyin. Bu protokolde her antikorun 1 μL'sini ekliyoruz (bazofil tanımlaması için CCR3-APC ve CD203c-PE; Bazofil aktivasyonu için CD63-FITC)20 μL stimülasyon tamponu başına 140 . NOT: Boyama karışımı preparatını ışıktan koruyun.</li>
	<li>Her tüpe 23 μL boyama karışımı ekleyin.</li>
</ol>3. Kan stimülasyonu
<ol><li>1 ve 2 numaralı tüplere 100 μL PBS-T (negatif kontrol), 3 numaralı tüpe 100 μL fMLP, 4 numaralı tüpe 100 μL anti-IgE ve aşağıdaki tüplere farklı alerjen/ilaç konsantrasyonlarının 100 μL'sini ekleyin. Ön ısıtma reaktiflerine orta ajitasyonlu termostatik bir banyoda 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Hemolizi önlemek için her tüpe nazikçe 100 μL kan ekleyin. Yavaşça vorteks tüpleri ve orta ajitasyonlu termostatik bir banyoda 37 ° C'de 25 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Degranülasyonu durdurun, tüpleri en az 5 dakika boyunca 4 ° C'de tutun. NOT: Protokol burada 4 °C'de gerekirse 30-45 dakika duraklatılabilir141.142.143.</li>
</ol>4. Eritrositlerin lize edilmesi
<ol><li>Eritrositleri lize etmek için her tüpe 2 mL 1x lizing tamponu ekleyin. Her tüpü vorteks edin ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Bu adımda, tamponda bulunan fiksatif ajanlar (formaldehit) nedeniyle hücreler sabitlenir.</li>
	<li>5 dakika boyunca 4 °C'de 300 x g'de santrifüj. Süper natantı boşaltın, rafı bir lavaboya çevirin. Hücreler tüplerin dibinde kalır.</li>
	<li>Hücreleri yıkamak için her tüpe 3 mL PBS-T ekleyin. Her tüpü vorteks.</li>
	<li>5 dakika boyunca 4 °C'de 300 x g'de santrifüj. Süper natantı boşaltın, rafı bir lavaboya çevirin. NOT: Numuneleri 4 °C'de tutun, akış sitometresi elde edilene kadar ışıktan koruyun.</li>
</ol>5. Akış sitometrisi edinimi
<ol><li>Akış sitometresi ile örnekler alın (örneğin, BD FACSCalibur Akış Sitometresi). Akış sitometresini bilgisayar yazılımına bağlayın ve sitometrenin hazır olmasını bekleyin. Şablonu ve enstrüman ayarlarını yükleyin (Tablo 1).</li>
	<li>Örnek alımını başlatın.</li>
	<li>Aktif bazofillerin seçimi için aşağıdaki sitometre stratejilerini kullanın139.<ol><li>Lenfositleri Yan Saçılma (SSC) - İleri Saçılma (FSC) grafiğinden kapılayın.</li>
		<li>Lenfosit popülasyonundan bazofilleri CCR3 + CD203c + hücreleri olarak kapılayın. Tüp başına en az 500 bazofil elde edin.</li>
		<li>CD63'ü etkinleştirme işaretçisi olarak kullanarak etkinleştirmeyi analiz etmek için bir CCR3 - CD63 grafiği gösterin. Negatif kontrol tüplerini kullanarak CD63 negatif eşiğini yaklaşık %2,5'e ayarlayın.</li>
		<li>Tüm örnekleri alın.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

BAT, ilaçlar, yiyecekler veya inhalanlar gibi farklı tetikleyicilerin neden olduğu reaksiyonların yanı sıra bazı kronik ürtiker formlarında da yararlı olduğu gösterilen IgE aracılı alerjik reaksiyonların değerlendirilmesi için tamamlayıcı bir in vitro tanı testidir. Genel olarak, i) alerjen / ilaç ST'de yanlış pozitif sonuçlar üretiyorsa, BAT performansı dikkate alınmalıdır; ii) alerjen/ilacın ST veya sIgE ölçümü için kullanılamaması; iii) klinik öykü ile ST veya sIgE tayini arasında uyumsuzluk olması; iv) sempt...

IgE aracılı alerji tanısı klinik öykü, deri testleri (ST'ler), serum spesifik IgE'nin (sIgE) miktarının belirlenmesi ve eğer gerekli ve belirtilmişse kontrollü meydan okuma testlerine (SKK) dayanır 1,2,3,4,5,6. Bununla birlikte, klinik öykü güvenilmez olabilir, çünkü doğru bilgi eksikliği olabilir ve ST'ler ve SKH'ler, yaşamı tehdit eden ciddi reaksiyonlar yaşayan deneklerde kontrendike olabilecek risksiz prosedürler değildir 1,2,3,4,5,6 . Bu sorunlar, doğrulanmış ve ticari floro-enzim immünoassayları ile sIgE tayininin sadece birkaç alerjen ve ilaç için mevcut olduğu gerçeğiyle birlikte, bazofil aktivasyon testi (BAT) gibi diğer in vitro fonksiyonel testlerin önemli rolünü vurgulamıştır.
Bazofiller, alerjen / ilaç maruziyetinden sonra hücre yüzeyinde yüksek afiniteli reseptörlere (FcεRI) bağlı bitişik sIgE'nin çapraz bağlanması üzerine aktive olan IgE aracılı alerjik reaksiyonlarda rol oynayan anahtar efektör hücrelerdir. Bazofil aktivasyonu hücre degranülasyonunu ve intrasitoplazmatik sekresyon granüllerinde bulunan önceden oluşturulmuş ve yeni sentezlenmiş inflamatuar mediatörlerin salınımını tetikler 7,8,9. BAT, bir uyaran (alerjen veya ilaç) varlığında bazofil aktivasyonunu taklit etmeye çalışan ve akış sitometrisi 7,10 ile bazofil aktivasyon belirteçlerinin ekspresyonundaki değişiklikleri belirleyen in vitro bir yöntemdir. Bazofilleri (IgE +, CCR3 +, CRTH2 +, CD203c +) tanımlamak ve florokrom etiketli antikorların kombinasyonlarını kullanarak hücre aktivasyonunu ölçmek (esas olarak CD63 ve CD203c'nin yukarı regülasyonu) için farklı stratejiler vardır 7,10. CD63, klinik olarak doğrulanmış en iyi aktivasyon belirteci 11,12,13,14, histamin içeren salgı granüllerine tutturulmuş bir membran proteinidir ve hücre aktivasyonu ve granüllerin membranla füzyonundan sonra, bazofil yüzeyinde eksprese edilir 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c, bazofiller üzerinde yapısal olarak eksprese edilen ve FcεRI stimülasyonundan sonra yukarı regüle edilen ve BAT 15,22,23,24,25'te güvenilir sonuçlar gösteren bir yüzey belirtecidir. Ayrıca, CD6326 ile birlikte ifade ediyor gibi görünüyor.
Son yıllarda, BAT'ın ilaçlar, yiyecekler veya inhalanlar gibi farklı tetikleyicilerin neden olduğu IgE aracılı alerjik reaksiyonların yanı sıra aşağıda açıklandığı gibi bazı kronik ürtiker formlarının teşhisinde yararlı olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu tekniğin tanı algoritmalarındaki konumu oldukça değişkendir ve iyi belirlenmemiştir.
İlaç aşırı duyarlılığı BAT, seçilmiş ilaçlar ve hastalar için, özellikle de ST'nin tanısal değerinin çoğu ilaç için iyi belirlenmemesi nedeniyle ciddi reaksiyonlar yaşayanlar için, sınırlı sayıda ilaç için doğrulanmış ve standartlaştırılmış oldukları için tamamlayıcı bir test olarak yararlı olduğunu göstermiştir 27,28,29,30. Ek olarak, sIgE'nin nicelleştirilmesi, ST27,28,29,30,31,32'den daha düşük hassasiyete sahip sınırlı sayıda ilaç için kullanılabilir. Bu nedenle, ilaç aşırı duyarlılığının teşhisi genellikle hayatı tehdit eden ciddi reaksiyonlar yaşayan deneklerde kontrendike olabilen ilaç provokasyontestine dayanır 33.
Betalaktamlar (BL'ler) 20,34,35,36,37,38,39, nöromüsküler bloke edici ajanlar (NMBA'lar)19,22,40,41,42 gibi farklı ilaçlara anında aşırı duyarlılık reaksiyonları bildiren seçilmiş hastalarda BAT kullanımı için umut verici sonuçlar bildirilmiştir. 43,44,45, florokinolonlar (FQ'lar)46,47,48,49, pirazolonlar 50,51,52, radyokontrast madde (RCM)53,54,55,56 ve platin bileşikleri 57,58,59 . BAT'ın sırasıyla %51.7-66.9 ve %89.2-97.8 arasında bir duyarlılık ve özgüllüğe sahip olduğu bildirilmiştir; pozitif ve negatif prediktif değerlerin ise sırasıyla %93,4 ile %66,3 arasında değiştiğive 27,31 olarak tanımlandığı tanımlanmıştır. Ayrıca, platin bileşikleri ile duyarsızlaştırma sırasında çığır açan reaksiyonlar için öngörücü bir biyobelirteç olarak BAT önerilmiştir, çünkü CD203c ekspresyonu, ilaç duyarsızlaştırma sırasında advers reaksiyon riski yüksek olan hastalarda CD63'e kıyasla artmıştır57.
BAT'ın sadece reaksiyon bazofil degranülasyonunu içerdiğinde ilaç aşırı duyarlılığında yararlı olduğu unutulmamalıdır; bu nedenle, siklooksijenaz 142'nin enzimatik inhibisyonundan kaynaklanan reaksiyonlarda yararlı değildir.
Gıda alerjisi BAT, gıda alerjisi için potansiyel bir tanı aracı olarak ortaya çıkmıştır, çünkü tüm alerjen ekstraktına veya tek alerjenlere serum sIgE'nin belirlenmesi genellikle belirsizdir ve tanıyı doğrulamak için oral gıda zorluğu gerektirir, bu da ilaç aşırı duyarlılığına benzer şekilde, pahalı ve risksiz bir prosedürdür60. Birçok çalışma, sütü 61,62, yumurta61,63, buğday 64,65,66,67,68, yer fıstığı63,69,70,71,72, fındık 73,74,75,76 ile ilgili sonuçları göstermiştir. ,77, kabuklu deniz ürünleri78, şeftali 79,80,81, elma21, kereviz ve havuç82,83.
Gıda allerjisi tanısında BAT'ın serumdaki ST ve sIgE'ye göre temel katma değeri, daha yüksek özgüllük ve benzer duyarlılık göstermesidir. Bu nedenle, BAT, klinik olarak alerjik hastaları hem yüksek özgüllüğe (% 75-100) hem de duyarlılığa (% 77-98) 63,69,84 sahip hassas, ancak toleranslı deneklerden ayırt etmek için yararlı bir araçtır. Duyarlılık ve özgüllük değerleri alerjene ve fenotipler (örneğin, oral alerji sendromuna karşı anafilaksi), yaş ve coğrafya ile ilişkili duyarlılaşma paternleri gibi diğer faktörlere bağlıdır63,85.
Tek alerjen bileşenleri kullanan BAT, bazı gıda alerjenleri için tanısal doğruluğu potansiyel olarak artırabilir61,80. Tohum depolama proteinlerini kullanan çalışmalar vardır (örneğin, yer fıstığından Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 ve Ara h 6)86; lipid transfer proteinleri (örneğin, şeftaliden Pru p 3 ve yer fıstığından Ara h 9)80,86; ve Bet v 1 homologları (örneğin, yer fıstığından Ara h 8)87. Diğer potansiyel faydalar, polen-gıda alerjisi sendromu21,87,88, kırmızı ete alerji 89 veya gıdaya bağımlı egzersize bağlı anafilaksi66 vakalarında suçlu alerjenin tanımlanması ile ilgilidir.
İlginçtir ki, BAT, alerjik reaksiyonların şiddeti ve eşiği hakkında bilgi sağlayabilir, çünkü daha şiddetli reaksiyonları olan hastalar, yer fıstığı ve sütü alerjisi olan hastalar üzerinde yapılan çalışmalarda gözlemlendiği gibi, daha büyük oranda aktif bazofil gösterir 84,90,91; ve eser miktarda alerjene tepki gösteren hastalar daha büyük bir bazofil duyarlılığı gösterir 84,90,92. Bu veriler, BAT'ın daha yakın takip ve daha yoğunlaştırılmış eğitim gerektiren yüksek riskli alerjik hastaları tanımlamak için yararlı olabileceğini düşündürmektedir93. Ayrıca, BAT'ın, gıdanın ne zaman güvenli bir şekilde (yeniden) tanıtılabileceğini belirlemeye yardımcı olmak için gıda zorluğu tepkileri 70,91,92,94 ve reaktivite eşikleri 90,95'i tahmin edebileceği bildirilmiştir 84. Bununla birlikte, bu bulgular bazı çalışmalarda63,96 tartışmalı ve daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Öte yandan, BAT, doğal olarak veya immünomodülatör tedaviler altında, gıda alerjisinin zaman içinde çözünürlüğünü izlemek için kullanılmıştır; bu, şimdiye kadar sadece oral gıda mücadelesi ile değerlendirilmiştir, ilişkili riskler ve maliyetler 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Ayrıca, omalizumab ile tedavi sırasında bazofil aktivasyonu azaldığından omalizumab'ın gıda alerjisindeki etkisini izlemek için de kullanılmıştır, ancak tedavinin kesilmesinden sonra artar109.
İnhalan alerji BAT, inhalan alerjide nadiren faydalıdır, çünkü tanı rutin olarak sIgE nicelleştirmesi ve ST ile belirlenebilir. Bununla birlikte, lokal alerjik rinit vakalarında (pozitif burun provokasyon testleri ile saptanamayan sIgE seviyeleri ve negatif ST'ler), BAT vakaların% 50'sinde tanıya izin vermiştir110. Ayrıca, bazofil duyarlılığı ile nazal/bronşiyal provokasyon testlerine yanıt ile astım şiddeti ve omalizumab111,112 ile tedavinin etkinliği arasında bir korelasyon olduğu bildirilmiştir.
BAT ayrıca, ev tozu akarı ve polenler için alerjen immünoterapisini izlemek için de kullanılmıştır, çünkü bazofil duyarlılığı immünoterapi sırasında azalır, muhtemelen bloke edici IgG antikorlarının 113,114,115,116,117 paraziti nedeniyle.
Hymenopterazehir alerjisi Hymenoptera venom alerjisinin tanısı rutin olarak ST ve serum sIgE'ye dayanmaktadır. BAT, yüksek duyarlılık (%85-100) ve özgüllük (%83-100) göstermiş olup, belirsiz sonuçlar veren olgularda veya düşündürücü klinik venom alerjisi öyküsü olan ancak saptanamayan sIgE ve negatif ST118,119 olan hastalarda yararlı olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, BAT'ın bu reaksiyonlar için şiddeti öngörmediği görülmektedir120,121.
Hastaların% 60'ına kadarı hem yaban arısı hem de arı zehirine sIgE sergiler ve baskın alerjenin tanımlanması yeterli immünoterapi tedavisi için çok önemlidir. Bu vakalarda, BAT'ın baskın alerjen119,122,123,124'ün tanımlanmasında yararlı olduğu bildirilmiştir. Arı ve yaban arısı zehirlerinin majör alerjenlerine karşı sIgE, çift pozitifliği olan hastalarda BAT'ın her iki zehire de faydasını azaltabilse de, sIgE tayinlerinde123 esas olarak olumsuz sonuçları olan kişilerde yararlı bilgiler sağlar.
Bazı çalışmalar, BAT'ın zehir immünoterapisinin birikme aşamasında yan etkiler için prediktif bir biyobelirteç olarak yararlı olabileceğini düşündürmektedir, çünkü bu tedavi seçeneğinin bazofil duyarlılığını azalttığı bildirilmiştir. Bununla birlikte, reaktivite azalmaz ve bu BAT faydası günümüzde tartışmalı 13,120,125,126,127,128,129,130'dur.
Ürtiker ve anjiyoödem Kronik ürtiker hastalarının bir alt kümesi, otoalerjenlere karşı IgE otoantikorları ve mast hücre yüzeyinde bulunan FcεRI veya IgE-FcεRI komplekslerini hedef alan IgG otoantikorları nedeniyle otoinmüsen patofizyolojisine sahiptir131.132. Klinik pratikte, bu tip kronik ürtikerin tanısı, kazara enfeksiyon riski taşıyan pozitif otolog serum ST'ye dayanmaktadır. BAT, kronik ürtiker şüphesi olan hastaların tanı ve izlenmesi için in vitro bir test olarak önerilmiştir. Bazofillerin yüzeyindeki CD63 ve CD203c ekspresyonunun, kronik ürtiker hastalarından serumlarla stimülasyonu takiben arttığı ve aktif otoantikorların 133.134.135.136.137 olduğunu gösterdiği bildirilmiştir. Son zamanlarda, BAT pozitif hastaların sıklıkla ürtiker aktivite skoru ile değerlendirilen en aktif hastalık durumunu yaşadıkları ve BAT138 negatif olanlara kıyasla üçüncü basamak tedavilerle (siklosporin A veya omalizumab) birlikte daha yüksek dozlarda antihistaminikler gerektirdikleri bildirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>5 mL Yuvarlak Alt Polistiren Test Tüpü, Kapaksız, Steril</td><td>Olmayan Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-insan CD193 (CCR3) Antikor</td><td>BioLegend</td><td>310708</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Akış Sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-insan CD63 Antikor</td><td>BioLegend</td><td>353006</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Lizleme Çözeltisi 10x konsantre</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>N-Formil-Met-Leu-Phe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-insan CD203c (E-NPP3) Antikor</td><td>BioLegend</td><td>324606</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Fare Anti-İnsan IgE</td><td>BD Biosciences</td><td>555857</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IL-3</td><td>R& D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>Kılıf Sıvısı</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>TÜP 9 mL LH Lityum Heparin</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455084</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

alerji tanısı için bazofil aktivasyon testi

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

Bazofil aktivasyon testi (BAT), gıdaya, böcek zehirine, ilaçlara ve bazı kronik ürtiker formlarına karşı IgE aracılı alerjik reaksiyonların değerlendirilmesinde klinik öykü, deri testi (ST) ve spesifik IgE (sIgE) tayinine ek olarak kullanılabilen tamamlayıcı bir in vitro tanı testidir. Bununla birlikte, bu tekniğin tanı algoritmalarındaki rolü oldukça değişkendir ve iyi belirlenmemiştir.
BAT, aktivasyon belirteçlerinin (CD63, CD203c gibi) akış sitometrisi ile ölçülmesi yoluyla alerjen/ilaç çapraz bağlanan IgE aktivasyonuna bazofil yanıtının belirlenmesine dayanır. Bu test, özellikle hayatı tehdit eden ciddi reaksiyonlar yaşayan deneklerde, alerji tanısını doğrulamak için kontrollü meydan okuma testlerinden kaçınmak için yararlı ve tamamlayıcı bir araç olabilir. Genel olarak, i) alerjen / ilaç ST'de yanlış pozitif sonuçlar üretiyorsa; ii) ST veya sIgE tayini için kullanılacak herhangi bir alerjen/ilaç kaynağının bulunmaması; iii) hasta öyküsü ile ST veya sIgE tayini arasında uyumsuzluk olması; iv) semptomlar ST'nin sistemik yanıtla sonuçlanabileceğini düşündürmektedir; v) Suçlu alerjeni / ilacı doğrulamak için bir CCT'yi düşünmeden önce. Testin ana sınırlamaları, özellikle ilaç alerjisinde optimal olmayan duyarlılık, numune ekstraksiyonundan sonra testin 24 saatten fazla yapılmaması ve laboratuvarlar arasında prosedürler, konsantrasyonlar ve hücre belirteçleri açısından standardizasyon eksikliği ile ilgilidir.

Alerjenler veya ilaçlarla yapılan BAT, IgE'ye bağımlı aşırı duyarlılık reaksiyonlarının araştırılmasına izin verir. En iyi sonuçları elde etmek için bazofil reaktivitesi en az iki optimal konsantrasyonda ölçülmelidir34 ve aktivasyon, CD63'ün hücre yüzeyinde yukarı regülasyonu ile görselleştirilir. Alerjenler söz konusu olduğunda, ayrıca, bazofil reaktivitesini doğrulamak için, bazofil duyarlılığı, çoklu azalan alerjen konsantrasyonlarında reaktivite ölçülerek analiz edilmelidir11...

Bazofil aktivasyon testi, akım sitometrisi ile aktivasyon belirteçlerinin ölçülmesi yoluyla spesifik bir uyaran varlığında bazofil aktivasyonunun saptanmasına dayanan IgE aracılı alerjik reaksiyonların değerlendirilmesi için tamamlayıcı bir in vitro tanı testidir.

Alerji Tanısı için Bazofil Aktivasyon Testi

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

Bazofil aktivasyon testi, ilaçlar, yiyecekler veya inhalanlar tarafından indüklenen reaksiyonlar için ve bazı kronik ürtiker formlarında yararlı olduğu gösterilen IgE aracılı alerjik reaksiyonların değerlendirilmesi için ücretsiz bir in vitro tanı testidir. Bu test, akım sitometrisi ile aktivasyon belirteçlerinin ölçülmesi yoluyla bir alerjene veya ilaç çapraz bağlanan IgE aktivasyonuna bazofil yanıtının belirlenmesine dayanmaktadır. Bazofil aktivasyon testi, özellikle ciddi yaşamı tehdit eden reaksiyonlar yaşayan deneklerde, alerji tanısını doğrulamak için kontrollü meydan okuma testlerinden kaçınmak için yararlı ve ücretsiz bir araç olabilir.Dahası, bu test, sadece birkaç ilaç ve alerjen için mevcut olan diğer in vitro yöntemlere kıyasla herhangi bir ilaca veya alerjene karşı yanıtı analiz edebilme avantajına sahiptir. Testin ana sınırlamaları, özellikle ilaç alerjisinde, optimal olmayan duyarlılıkla ilgilidir. Testin numune ekstraksiyonundan en fazla 24 saat sonra yapılması gerekliliği ve laboratuvarlar ile teşhis algoritmaları arasında standardizasyon eksikliği.Dokuz mililitrelik heparinize tüplerde periferik kan toplayarak başlayın ve numuneleri deneysel protokol için gerekli olana kadar oda sıcaklığında tutmak için bir rotora yerleştirin. Negatif kontrol ve pozitif kontrol için her biri beş mililitrelik sitometre tüplerini etiketleyin. Ayrıca, test edilen farklı alerjen veya ilaç konsantrasyonları için her birini bir tüp olarak etiketleyin.Daha sonra tüpleri bir rafa yerleştirin, böylece tüpler kaymadan mükemmel şekilde oturur. İlk pozitif kontrol için,% 0.05 PBS-T'de dört mikromolar N-Formilmetiyonil-lösil-fenilalanin veya fMLP çözeltisi hazırlayın Bazofillerin kalitesini doğrulamak için. İkinci pozitif kontrol için, PBS-T kullanarak mililitre başına 0.05 miligram anti-IgE çözeltisi hazırlayın.Stimülasyon tamponunun 20 mikrolitresi başına CCR3-APC, CD203c-PE ve CD63-FITC antikorlarının her birine bir mikrolitre ekleyerek boyama karışımını hazırlayın. Daha sonra her tüpe bu boyama karışımından 23 mikrolitre ekleyin. Negatif kontrol tüplerine 100 mikrolitre PBS-T ekleyin.Pozitif kontrol tüplerinden birine 100 mikrolitre fMLP ekleyin ve tüplerin geri kalanına diğerine 100 mikrolitre anti-IgE E ekleyin. Farklı alerjen veya ilaç konsantrasyonlarından 100 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hemolizi önlemek için her tüpe nazikçe 100 mikrolitre kan ekleyin.Daha sonra tüpleri yavaşça vorteksleyin ve termostatik banyoda orta ajitasyonla 37 santigrat derecede 25 dakika boyunca inkübe edin. Degranülasyonu durdurmak için tüpleri en az beş dakika boyunca dört santigrat derecede tutun. Her tüpe, eritrositleri lize etmek için iki mililitre lize tamponu ekleyin.Her tüpü vorteks edin ve daha sonra tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Tüpleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede 300 g'da santrifüj yapın. Ardından, hücreler tüplerin dibinde kalırken süpernatantı boşaltmak için rafı lavaboya çevirin.Hücreleri yıkamak ve tüpleri vortekse etmek için her tüpe üç mililitre PBS-T ekleyin. Aynı parametre kümesini kullanarak ikinci bir santrifüjleme turu gerçekleştirin ve rafı lavaboya ters çevirerek süpernatantı boşaltın. Daha sonra numuneleri akış sitometrisine kadar ışıktan korunan dört santigrat derecede tutun.Akış sitometresini bilgisayar yazılımına bağlayın ve sitometre hazır olana kadar bekleyin. Şablon ve enstrüman ayarlarını metin makalesinde açıklandığı şekilde yükleyin. Örnek alma işlemini başlatın.Aktif bazofilleri seçmek için, önce lenfositleri Yan Saçılma-İleri Saçılma grafiğinden kapılayın. Daha sonra lenfosit popülasyonundan bazofilleri CCR3 + CD203c + hücreleri olarak kapılar ve tüp başına en az 500 bazofil elde edin. CD63 eşiğini negatif kontrol tüplerini kullanarak yaklaşık% 2,5'e ayarlayın ve örnekleri analiz edin.IgE'ye bağımlı aşırı duyarlılık reaksiyonları, alerjenler ve ilaçlar kullanılarak bazofil aktivasyon testi veya BAT yapılarak araştırıldı. Bazofil duyarlılığı,% 50 bazofil veya EC50'nin yanıtını indükleyen alerjik konsantrasyonun belirlenmesine yardımcı olan çoklu azalan alerjen konsantrasyonlarındaki reaktivitenin ölçülmesiyle analiz edildi. İlk olarak, lenfositler yan saçılma-ileri saçılma grafiğinden kapılandırıldı.Daha sonra bazofiller lenfosit popülasyonundan CCR3 + CD203c + hücreleri olarak kapatıldı. Daha sonra, CD63'ü iki ilaç ve bir alerjenin farklı konsantrasyonları için bir aktivasyon belirteci olarak kullanarak bazofil aktivasyonunu analiz etmek için bir CCR3-CD63 grafiği kullanıldı. Test taze tam kan ile yapılır ve kan alımından en fazla 24 saat sonra yapılmalıdır.Testte kullanılan uyaran herhangi bir yardımcı madde içermemeli ve ilaçların kimyasal özellikleri göz önünde bulundurulmalıdır. IgE aracılı alerjik reaksiyonların teşhisi için diğer ek in vitro yöntemler veya sIgE tayini veya histamin salınım testi.

basophil-activation-test-for-allergy-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bazofil aktivasyon testi, IgE bağımlı alerji tespiti için güçlü bir...

İlaç Aşırı duyarlılık IgE aracılığı ile Mekanizmalarının Araştırılması bazofil Etkinleştirme Test

Alerjik astım Deneysel fare modelleri hastalığı patogenezinde okuyan ve yeni ilaçlar geliştirmek için yeni olanaklar sunar. Bu modeller de alerjik immün yanıt, hava yolu inflamasyonu ve pulmoner patofizyolojisi yöneten ölçüm faktörleri için uygundur.

Alerjen Bağlı Astım murin Modeli

Bu videoda, bazofil degranülasyonunu indüklemek için bir antijenin alerjik potansiyelini değerlendirmek için bir in vitro yöntemi açıklıyoruz. β-hekzosaminidaz, kimyasal aracı salınımının bir indeksi olarak kullanılır ve β-heksosaminidazın enzim aktivitesi, florojenik bir substrat kullanılarak ölçülür.

İnsanlaştırılmış Mediatör Enzim Salınım Testi: İn Vitro Bazofil Degranülasyon Yanıtını İzleyerek Test Antijeninin Alerjik Potansiyelini Taramak İçin İmmünokimyasal Bir Yöntem

Bu videoda, akış sitometrisi kullanarak bir test alerjeninin varlığında bazofil aktivasyonunu değerlendirmek için testi gösteriyoruz.

Flow Sitometri Kullanarak Bir Test Alerjeni Varlığında Bazofil Aktivasyonunun Analiz Edilmesi

Bu videoda, mikroakışkan kartuş tabanlı kemilüminesans sistemi kullanılarak seruma özgü immünoglobulin E'yi tespit etmek için bir protokol gösterilmektedir. Serum IgE'leri, kartuşun reaksiyon bölgesinde hareketsiz hale getirilen farklı alerjenlerle etkileşime girer ve bunlar daha sonra peroksidaz konjuge anti-IgE antikorları ve bir kemilüminesan substrat ile tespit edilir ve çoklu alerjene özgü IgE'lerin aynı anda saptanmasına izin verir.

Alerjene özgü immünoglobulin E için mikroakışkan kartuş tabanlı bir tespit sistemi

Burada, flow sitometri alerjen yüklü parçacıklar ölçmek için bir protokol mevcut. Ortam partiküler madde parçacıkları adsorbe alerjenlerin taşıyıcıları olarak hareket edebilir. Bu akış sitometrisi, bir yöntem olup çok çapı 0.5 um, bu alerjene yüklü parçacıkları ölçmek için kullanılabilir&gt; askıda katı madde karakterize etmek için kullanılan burada gösterir.

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Bu çalışma, Güney Çin'den allerjik rinit ve / veya astımlı bir hasta grubunda ot polen allerjenlerine duyarlılığı araştırmak için bileşen çözümü yaklaşımını kullanan bir protokolü açıklamaktadır.

Allerjik Rinit ve / veya Astımı olan Çinlilerin Çimen Poleni Allerjenleri Üzerine Bir Çalışma İçin Bileşen ile Çözümlenmiş Bir Teşhis Yaklaşımı

Bu kağıt bir mikrosıvısal kartuş tabanlı Kemiluminesan sistemi ve kullanışlılığı değerlendirilmesi ile serum özel immünglobulin E Anti tanılar algılamak için bir protokol sunar.

Biochip mikrosıvısal teknolojisi uygulama algılamak Serum alerjen özgü immünglobulin e (sIgE)

Burada, tipik olarak tip 1 alerjik reaksiyonlarda gözlenen efektör hücrelerin degranülasyonunu simüle etmek için insan IgE reseptörü ile transfected bir sıçan bazofilik lösemi hücre hattı kullanarak mediatör salınım testini sunuyoruz. Bu yöntem, alerjenlerin biyolojik aktivitesini son derece hassas, tekrarlanabilir ve uyarlanabilir bir şekilde araştırır.

Alerjen Gücü için Okuma Olarak İnsanlaştırılmış Arabulucu Sürümü Tahlil

Bir alerjen maruziyet odası (AEC) tesisinde bir meydan okuma yürütmek için bir protokol sunulmaktadır. AEC'lerin, alerjik semptomların indüklenmesi için güvenli ve etkili araçlar olduğu veya stabil partikül konsantrasyonlarını ve çevresel koşulları sürdürme yetenekleri nedeniyle alerjen immünoterapisinin etkinlik testinde bir son nokta olduğu kanıtlanmıştır.

Alerjik Rinitli Hastaların Alerjen Maruziyet Odası Kullanılarak Semptom Değerlendirmesi

Öğrenin bazofil aktivasyon testi ile IgE aracılı alerjik reaksiyonları akış sitometrisi kullanarak nasıl değerlendireceğinizi. İlaç, gıda ve solunum alerjenlerinin tanısında güvenli bir alternatif sunar.

Alerji Tanısı için Bazofil Aktivasyon Testi

Daha fazla video keşfet