Alerji Tanısı için Bazofil Aktivasyon Testi

Bazofil aktivasyon testi, ilaçlar, yiyecekler veya inhalanlar tarafından indüklenen reaksiyonlar için ve bazı kronik ürtiker formlarında yararlı olduğu gösterilen IgE aracılı alerjik reaksiyonların değerlendirilmesi için ücretsiz bir in vitro tanı testidir. Bu test, akım sitometrisi ile aktivasyon belirteçlerinin ölçülmesi yoluyla bir alerjene veya ilaç çapraz bağlanan IgE aktivasyonuna bazofil yanıtının belirlenmesine dayanmaktadır. Bazofil aktivasyon testi, özellikle ciddi yaşamı tehdit eden reaksiyonlar yaşayan deneklerde, alerji tanısını doğrulamak için kontrollü meydan okuma testlerinden kaçınmak için yararlı ve ücretsiz bir araç olabilir.

Dahası, bu test, sadece birkaç ilaç ve alerjen için mevcut olan diğer in vitro yöntemlere kıyasla herhangi bir ilaca veya alerjene karşı yanıtı analiz edebilme avantajına sahiptir. Testin ana sınırlamaları, özellikle ilaç alerjisinde, optimal olmayan duyarlılıkla ilgilidir. Testin numune ekstraksiyonundan en fazla 24 saat sonra yapılması gerekliliği ve laboratuvarlar ile teşhis algoritmaları arasında standardizasyon eksikliği.

Dokuz mililitrelik heparinize tüplerde periferik kan toplayarak başlayın ve numuneleri deneysel protokol için gerekli olana kadar oda sıcaklığında tutmak için bir rotora yerleştirin. Negatif kontrol ve pozitif kontrol için her biri beş mililitrelik sitometre tüplerini etiketleyin. Ayrıca, test edilen farklı alerjen veya ilaç konsantrasyonları için her birini bir tüp olarak etiketleyin.

Daha sonra tüpleri bir rafa yerleştirin, böylece tüpler kaymadan mükemmel şekilde oturur. İlk pozitif kontrol için,% 0.05 PBS-T'de dört mikromolar N-Formilmetiyonil-lösil-fenilalanin veya fMLP çözeltisi hazırlayın Bazofillerin kalitesini doğrulamak için. İkinci pozitif kontrol için, PBS-T kullanarak mililitre başına 0.05 miligram anti-IgE çözeltisi hazırlayın.

Stimülasyon tamponunun 20 mikrolitresi başına CCR3-APC, CD203c-PE ve CD63-FITC antikorlarının her birine bir mikrolitre ekleyerek boyama karışımını hazırlayın. Daha sonra her tüpe bu boyama karışımından 23 mikrolitre ekleyin. Negatif kontrol tüplerine 100 mikrolitre PBS-T ekleyin.

Pozitif kontrol tüplerinden birine 100 mikrolitre fMLP ekleyin ve tüplerin geri kalanına diğerine 100 mikrolitre anti-IgE E ekleyin. Farklı alerjen veya ilaç konsantrasyonlarından 100 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hemolizi önlemek için her tüpe nazikçe 100 mikrolitre kan ekleyin.

Daha sonra tüpleri yavaşça vorteksleyin ve termostatik banyoda orta ajitasyonla 37 santigrat derecede 25 dakika boyunca inkübe edin. Degranülasyonu durdurmak için tüpleri en az beş dakika boyunca dört santigrat derecede tutun. Her tüpe, eritrositleri lize etmek için iki mililitre lize tamponu ekleyin.

Her tüpü vorteks edin ve daha sonra tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Tüpleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede 300 g'da santrifüj yapın. Ardından, hücreler tüplerin dibinde kalırken süpernatantı boşaltmak için rafı lavaboya çevirin.

Hücreleri yıkamak ve tüpleri vortekse etmek için her tüpe üç mililitre PBS-T ekleyin. Aynı parametre kümesini kullanarak ikinci bir santrifüjleme turu gerçekleştirin ve rafı lavaboya ters çevirerek süpernatantı boşaltın. Daha sonra numuneleri akış sitometrisine kadar ışıktan korunan dört santigrat derecede tutun.

Akış sitometresini bilgisayar yazılımına bağlayın ve sitometre hazır olana kadar bekleyin. Şablon ve enstrüman ayarlarını metin makalesinde açıklandığı şekilde yükleyin. Örnek alma işlemini başlatın.

Aktif bazofilleri seçmek için, önce lenfositleri Yan Saçılma-İleri Saçılma grafiğinden kapılayın. Daha sonra lenfosit popülasyonundan bazofilleri CCR3 + CD203c + hücreleri olarak kapılar ve tüp başına en az 500 bazofil elde edin. CD63 eşiğini negatif kontrol tüplerini kullanarak yaklaşık% 2,5'e ayarlayın ve örnekleri analiz edin.

IgE'ye bağımlı aşırı duyarlılık reaksiyonları, alerjenler ve ilaçlar kullanılarak bazofil aktivasyon testi veya BAT yapılarak araştırıldı. Bazofil duyarlılığı,% 50 bazofil veya EC50'nin yanıtını indükleyen alerjik konsantrasyonun belirlenmesine yardımcı olan çoklu azalan alerjen konsantrasyonlarındaki reaktivitenin ölçülmesiyle analiz edildi. İlk olarak, lenfositler yan saçılma-ileri saçılma grafiğinden kapılandırıldı.

Daha sonra bazofiller lenfosit popülasyonundan CCR3 + CD203c + hücreleri olarak kapatıldı. Daha sonra, CD63'ü iki ilaç ve bir alerjenin farklı konsantrasyonları için bir aktivasyon belirteci olarak kullanarak bazofil aktivasyonunu analiz etmek için bir CCR3-CD63 grafiği kullanıldı. Test taze tam kan ile yapılır ve kan alımından en fazla 24 saat sonra yapılmalıdır.

Testte kullanılan uyaran herhangi bir yardımcı madde içermemeli ve ilaçların kimyasal özellikleri göz önünde bulundurulmalıdır. IgE aracılı alerjik reaksiyonların teşhisi için diğer ek in vitro yöntemler veya sIgE tayini veya histamin salınım testi.