Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Bu protokol, bilim adamlarının transkripsiyon faktörü komplekslerinin sayısını farklı kesme stres koşulları altında nicel olarak karşılaştırmalarını sağlar ve vasküler biyolojideki araştırmalar için faydalı olacaktır. Bu protokolün ana avantajı, ilgili kontroller de dahil olmak üzere çeşitli antikor çiftlerinin aynı anda araştırılmasına izin veren mikroakışkan akış kanallarının kullanımıdır. Başlamak için, PBS'de hazırlanan %0,1'lik porcine cilt jelatinini 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca kanallara ekleyerek altı kanallı slaydı kaplayın.

Kanalları jelatin çözeltisinden boşaltın ve önceden kodlanmış altı kanallı slaytlardaki Huvecs tohumunu 2,5 çarpı 10 yoğunlukta M199 tam ortasının 30 mikrolitresinde mililitre başına altıncı hücrelere boşaltın. Hücrelerin nemlendirilmiş inkübatörde 37 santigrat derecede bir saat yapışmasına izin verin. Rezervuarların her birine önceden uyarılmış 60 mikrolitre M199 komple ortam ekleyin.

Hücreleri 24 saat sonra orta değiştirme ile nemli bir inkübatörde iki gün boyunca 37 santigrat derecede kültürlendirin. Silikon boruyu akışkan ünitelere monte edin, rezervuarları önceden uyarılmış M199 komple ortamı ile en az 10 mililitre ile doldurun. Akışkan üniteleri boru ile pompa sistemine bağlayın ve ortamın dengesini sağlamak ve kalan havayı çıkarmak için hücreler olmadan ön çalıştırmayı gerçekleştirin.

Seri bağlantı borusunu kullanarak altı kanallı slayttaki tek kanalları bağlayın. Slayttaki ilk ve son kanalı akışkanlar ünitesine monte edilen tüplere bağlayın. Hücrelerin yüksek düzeyde saf strese maruz kalması için, adaptasyon aşamaları ile akıllıca saf stres adımını artırın ve adımları 30 dakikada santimetrekare başına beş dynes artışlarla ayarlayın.

Sıvı kesme stresine maruz kalmadan sonra slaytları pompalardan ayırmak, inkübatörde orta dökülmeyi önlemek ve akış slaytlarını buz üzerinde aktarmak için boru üzerindeki kümeleri kullanın. Boruyu rezervuarlardan ayırırken, hava kabarcıklarını kanala hapsetmekten kaçınmak için rezervuarın diğer tarafını kapatmak için parmağı kullanın. Akış kaydırağını buz üzerinde tutarak, ortamı rezervuarlardan dikkatlice epire edin, ancak hücrelerin bulunduğu kanaldan değil.

Numuneleri bir rezervuara PBS ekleyerek 90 mikrolitre soğuk steril PBS ile yıkayın ve diğer rezervuardan dikkatlice emiş yapın, ardından tüm kanallar için tekrarlayın. PBS'nin eklendiği aynı rezervuara 90 mikrolitre tamponlanmış %4 PFA çözeltisi ekleyerek hücreleri sabitlayın ve gösterildiği gibi sıvıyı diğer rezervuardan emişlendirin. Hücreleri altı kanalda da sabitladıktan sonra, numuneleri buzdan oda sıcaklığına aktarın ve 20 dakika kuluçkaya yatırın.

Bir rezervuara PBS ekleyerek ve tüm kanallarda diğer rezervuardan dikkatlice sopire ederek, kanalları kurutmamaya dikkat ederek hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. PBS'de hazırlanan 90 mikrolitre ortam 15 milimolar amonyum klorürü rezervuarlardan birine ekleyerek PFA'ya erişimi söndür. Diğer rezervuardan aspire edin ve hücreleri 10 dakika kuluçkaya bırakın.

Boş rezervuarda PBS olarak hazırlanan %0,3 Triton X 100'ün 90 mikrolitresini ekleyerek hücrelerin dengesini bozun. Her kanal için diğer rezervuardan aspire edin ve 10 dakika kuluçkaya yaslayın, daha sonra daha önce gösterildiği gibi PBS ile üç kez yıkanır. Bir rezervuara 90 mikrolitre steril PLA blokaj çözeltisi.

Her kanal için diğer taraftan aspire edin ve nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yaslanın. PLA antikor seyreltici ve girdap primer antikorları ekleyin. Engelleme çözeltisini rezervuarlardan ve kanallardan dikkatlice emiş edin.

Çözeltiyi eklerken slaydı yatırarak birincil antikor çözeltisinin 30 mikrolitresini hemen boş kanala ekleyin. Tüm kanallar için tekrarlayın ve bir gece boyunca nemlendirilmiş odada dört santigrat derecede veya bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Pla antikor seyrelticisinde eksi tavşan ve artı fare PLA problarını bir ila beş arasında seyreltin.

90 mikrolitre yıkama tamponu A ekleyerek ve gösterildiği gibi aspire ederek tüm kanalları iki kez yıkayın. Yıkama tamponunu aspire ettikten sonra, 30 mikrolitre PLA prob çözeltisi ekleyin ve nemlendirilmiş haznede kuluçkaya yatın. Ligasyon tamponunu D iyonize suda bir ila beş arasında seyreltin ve seyreltilmiş ligasyon tamponunda lygus enzimini bir ila 40 arasında seyreltin.

Yıkama tamponu A'yı yıkadıktan ve tamamen aspire ettikten sonra, kaydırağı yatırırken boş kanallara 30 mikrolitre ligasyon çözeltisi ekleyin ve nemlendirilmiş odada kuluçkaya yatırın. Amplifikasyon tamponunu deiyonize suda bir ila beş seyreltin, ardından polimeraz enzimini buz üzerindeki seyreltilmiş amplifikasyon tamponunda bir ila 80 arasında seyreltin. Yıkama tamponu A'yı yıkadıktan ve tamamen aspire ettikten sonra, kaydırağı yatırırken boş kanallara 30 mikrolitre amplifikasyon çözeltisi ekleyin ve nemli bölmede kuluçkaya yatırın.

Dapi'yi B yıkama tamponunda 1 ila 500 arasında seyreltin ve tüm kanalları bir kez yıkayın, B yıkama tamponu içeren 90 mikrolitre DAPI ekleyerek ve çekirdeği buharda buharlamak için gösterildiği gibi emişli. Ardından tüm kanalları DAPI olmadan B yıkama tamponu ile bir kez yıkayın. Yıkama tamponu B'yi deiyonize suda bir ila 10 arasında seyreltin ve tüm kanalları 90 mikrolitre seyreltilmiş yıkama tamponu B ile bir kez yıkayın.B yıkama tamponunu epire ettikten sonra, hemen bir rezervuara sıvı montaj ortamının iki ila üç damlasını ekleyin ve montaj ortamını tüm kanallara dağıtmak için slaydı eğin.

Örnekleri görüntülemeye kadar nemli bir ortamda dört santigrat derecede saklayın. Huvecs yüksek ve düşük strese maruz kaldı. Düşük kesme stresi sitozol ve çekirdeklerde SMAD protein etkileşimlerini artırdı.

Tek antikor kontrolleri çok az sinyale hayır göstererek deneyin başarısını kanıtladı. Artan antikor konsantrasyonu hücre başına daha fazla PLA olayı ile sonuçlandı, ancak yüksek ve düşük strese maruz kalan hücreler arasındaki PLA sinyallerindeki fark azaldı. Blokaj ve antikor seyreltme için kendi kendine yapılan tamponlar ticari tamponlar için alternatif olarak kullanılabilir.

Pla olaylarının ticari ve kendi kendine yapılan seyreltici ve bloke edici çözümler için ölçülmesi, sitosolik ve nükleer alanlarda aynı PLA sinyallerinin desenini göstermiştir. Bununla birlikte, hücre başına toplam PLA olayı sayısı ticari çözümlerle daha yüksekti. SMAD İki/Üç, SMAD Dört antikorunun bir kombinasyonu, SMAD Four antikorunun immünofluoresans deneyleri için uygun olmadığı yerlerde kullanıldı.

Deneysel ve kontrol durumunda PLA olaylarında bir fark yoktu, bu da PLA olaylarını tespit etmek için doğru antikor kombinasyonunun seçilmesinin önemini gösteriyordu. Açıklanan protokol, SMAD'lerden farklı transkripsiyon faktörü komplekslerinin etkileşimlerini tespit etmek için uyarlanabilir ve bu nedenle atero eğilimli ve atero koruyucu koşullarda gen düzenlemesini anlamaya yardımcı olur.