Name: Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Öğrenin, farklı sıvı kesme stres koşulları altında endotelyal hücrelerdeki SMAD komplekslerini yakınlık ligasyon tahlili ile görselleştirin ve nicelleştirin. Bu yöntem damar biyolojisi araştırmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Maria Reichenbach ve Dr. Christian Hiepen'e akış sistemine verdikleri destek için, Eleanor Fox ve Yunyun Xiao'ya ise makaleyi eleştirel bir şekilde okudukları için teşekkür ederiz. P-L.M. uluslararası Max Planck Araştırma Okulu IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC) tarafından finanse edildi. PK, DFG-SFB1444 tarafından fon aldı. Şekil 1 BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

1. Hücre kültürü ve sıvı kesme stresine maruz kalma
NOT: SMAD'lerin SS kaynaklı etkileşimini incelemek için örnek olarak insan göbek damarı EBC'leri (HUVEC) kullanılmıştır. Aşağıda açıklanan iletişim kuralı her SS duyarlı hücre türüne uygulanabilir.
<ol><li>37 °C'de 30 dakika boyunca PBS'de % 0,1 porcine cilt jelatin ile 6 kanallı kaydırağı kapleyin.</li>
	<li>30 μL M199 tam ortamda mL başına 2,5 x 106 hücre yoğunluğunda önceden kaplanmış 6 kanallı slaytlarda tohum HUVEC'leri. NOT: Akış slaydındaki hücrelerin nasıl tohumlanılacağı hakkında daha fazla bilgi için bkz.</li>
	<li>Hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 1 saat boyunca yapışmasına izin verin.</li>
	<li>Rezervuarların her birine 60 μL önceden ısıtılmış M199 tam orta ekleyin.</li>
	<li>Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de günde bir kez hafif bir orta değişimle 2 gün boyunca kültür.<ol>
<li>Rezervuarları tamamen aspire edin, rezervuarlardan birine önceden ısıtılmış 120 μL tam orta ekleyin ve diğer taraftan epire edin.</li>
		<li>Her iki rezervuara da 60 μL önceden ısıtılmış M199 tam orta ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış kurulumını başvuru25'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi birleştirin ve başlatın.<ol>
<li>Akışkan ünitelere boru monte edin. Burada sırasıyla 1 dyn/cm2 ve 30 dyn/cm2 kesme stresi uygulamak için 0,8 mm ve 1,6 mm çapında silikon borular kullanılmaktadır. NOT: Değişiklikler ortaya çıkan kesme stresini etkileyebileceğinden, malzeme ve boru uzunluğu sabit kalmalıdır. Genel olarak, ortaya çıkan kesme stresi bilindiği ve pompa sabit bir laminar akış oluşturduğu sürece pompa sistemlerinin ve boruların diğer kombinasyonları kullanılabilir.</li>
		<li>Rezervuarları uygun miktarda önceden ısıtılmış M199 tam orta (minimum 10 mL) ile doldurun.</li>
		<li>Akışkan üniteleri boru ile pompa sistemine bağlayın ve ortamı aşındırmak ve kalan havayı çıkarmak için hücresiz bir ön çalıştırma gerçekleştirin25.</li>
		<li>Seri bağlantı borusunu kullanarak 6 kanallı slayttaki tek kanalları seri olarak birbirine bağlayın. Slayttaki ilk ve son kanal 1.6.1'de monte edilen boruya bağlanır (şema için Şekil 1A'ya bakın). Hücrelere ciddi şekilde zarar verebileceği için sisteme herhangi bir hava sokmamaya dikkat edin. Seri bağlantı hakkında daha fazla bilgiyi reference26'da bulabilirsiniz.</li>
		<li>Hücrelerin yüksek düzeyde kesme stresine (>20 dyn/cm2) maruz kalması için bir rampa fazı kullanın, yani adaptasyon aşamaları ile kesme stresini adım adım artırın. Adımlar, 30 dakikada 5 dyn/cm2'lik artışlarla ayarlanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fiksasyon
<ol><li>Sıvı SS maruziyetinden sonra pompalardan kaydırakları ayırın. İnkübatördeki orta dökülmeyi önlemek için, ayırma yaparken boru üzerinde kelepçeler kullanın.</li>
	<li>Kalan boru sırayla ayrılırken, akış slaytlarını hemen buz üzerinde aktarın. Boruyu rezervuarlardan çıkarırken, kanaldaki hava kabarcıklarını hapsetmeyi önlemek için diğer taraftaki rezervuar bir parmakla kapalı tutulmalıdır. Bu, sabitleme adımlarını engelleyebilir.</li>
	<li>Hücreleri buzda tutarak, ortamı rezervuarlardan dikkatlice epire edin, ancak hücrelerin bulunduğu kanaldan değil. Daha sonra, numuneleri soğuk steril PBS (4 °C) ile kanal hacminin üç katı (90 μL) ile yıkayın. Bir rezervuara PBS ekleyin ve diğer rezervuardan dikkatlice aspire edin. Bu adımı slayt başına 6 kanalın her birinde yineleyin. NOT: Tüm yıkama ve kuluçka adımları için ilgili çözelti rezervuarlardan birine eklenir ve bu da kanalda çözüm değişimine yol açar. Çözeltilerin kanaldaki tam olarak değiştirilmesine izin vermek için, fazla çözelti daha sonra diğer rezervuardan emilir. Kanaldaki hücrelerin üstündeki çözelti çıkarılmaz. Hücreler herhangi bir zamanda kurumamalıdır. Bu nedenle, slaytlara herhangi bir hava kabarcığı takılmadan dikkatlice yıkamak önemlidir.</li>
	<li>PBS'nin önceden eklendiği aynı rezervuara 90 μL tamponlanmış% 4 PFA çözeltisi ekleyerek hücreleri sabitlayın ve benzer şekilde sıvıyı diğer rezervuardan epire edin. Bu adımı her slayttaki her kanalda yineleyin. PFA çözeltisinin eklenmesinden sonra, numuneleri buzdan oda sıcaklığına (RT) aktarın ve 20 dakika kuluçkaya yatırın. DİkKAT: PFA toksiktir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Eldiven kullanın ve duman kaputunun altında çalışın.</li>
	<li>Hücreleri bir rezervuara ekleyerek ve diğer rezervuardan dikkatlice soluyarak PBS (RT) ile 3x yıkayın. Kanalın kurumamasını sağlamak için sadece rezervuarları boşaltın. Slayt başına 6 kanalın her biri için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Rezervuarlardan birine PBS'de 90 μL ortam 50 mM amonyum klorür ekleyerek PFA fiksasyonunu söndür. Diğer rezervuardan fazla çözeltiyi aspire edin. Slayttaki her kanal için yineleyin. Rt'de örnekleri 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>2.5. adımda açıklandığı gibi yıkayın. NOT: Bu noktada, numuneler bir gecede 4 °C'de saklanabilir veya protokole hemen blokaj ve primer antikor inkübasyonu ile devam edilebilir (bkz. adım 3).</li>
</ol>3. Blokaj ve primer antikor inkübasyonu
<ol><li>Hücrelerin dengesini sağlamak için, boşaltılmış bir rezervuarda PBS'ye% 0.3 Triton-X-100'ün 90 μL'sini ekleyin ve her kanal için diğer rezervuardan aspire edin. RT'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>2.5. adımda açıklandığı gibi yıkayın.</li>
	<li>Bir kanalın bir rezervuarında 90 μL steril PLA engelleme çözeltisi ekleyin ve diğer taraftan aspire edin. Her kanal için bu adımı yineleyin. Nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 1 saat boyunca blok.<ol>
<li>Nemlendirilmiş bir oda yapmak için, balmumu filmi ile kapatılmış ıslak dokulu 10 cm'lik bir tabak kullanın ve kabı inkübatöre yerleştirin. Alternatif olarak, nemli bir atmosfer sağlayan diğer nem odası formatları kullanılabilir. NOT: Alternatif olarak, kendi kendine yapılan engelleme çözeltisi kullanılabilir (örneğin, PBS'de% 3 (w / v) BSA, steril filtreli).</li>
	</ol>
</li>
	<li>PLA antikor seyrelticisinde primer antikorları (1:100) hazırlayın. Kanal başına 30 μL çözelti hazırlayın. Hem primer antikorları aynı anda hem de girdabı ekleyin. NOT: Alternatif olarak, kendi kendine yapılan antikor seyreltici kullanılabilir (örneğin, PBS'de% 1 (w/ v) BSA). Burada kullanılan antikorlar SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 ve fosfo-SMAD1/5-SMAD4 kombinasyonlarıdır. Detaylı bilgiye Malzeme Tablosundan ulaşabilirsiniz.</li>
	<li>Birincil antikorların uygulanmasından önce, blokaj çözeltisini rezervuarlardan ve ayrıca kanaldan dikkatlice epire edin. Birincil antikor çözeltisinin pipet 30 μL'si, çözeltiyi eklerken kanalı yatırarak hemen boş kanala girer. NOT: Blokaj çözeltisinin çıkarılmasını ve hücrelerin arada kurumamasını sağlamak için kanal kanal antikor çözeltisinin eklenmesini gerçekleştirin.</li>
	<li>Numuneleri birincil antikorlarla birlikte 4 °C'de nemlendirilmiş odalarda bir gecede kuluçkaya yatırın. NOT: Kuluçka, aynı gün aşağıdaki adımlarla devam ederek devam ederse, oda sıcaklığında 1 saat boyunca da yapılabilir.</li>
</ol>4. PLA prob inkübasyonu
NOT: Bölüm 4.1-7.3'teki tüm adımlar için, A ve B yıkama tamponları 4 °C'de saklanır ve kullanımdan önce RT'ye ısıtılması gerekir.
<ol><li>PLA problarını (+)-fare ve (-)-tavşanı PLA antikor seyreltici (veya% 1 BSA) çözeltisinde 1:5'e seyreltin. Kanal başına 30 μL hazırlayın.</li>
	<li>Rt'de 90 μL yıkama tamponu A kullanarak numuneleri 5 dakika boyunca 2x yıkayın, rezervuarlardan birine ekleyerek ve diğer rezervuardan dikkatlice emiş yaparak. Slayt başına 6 kanalın her biri için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Yıkama tamponu A'yı dikkatlice epire edin ve adım 3.5'teki birincil antikorların eklenmesine benzer şekilde 30 μL PLA prob çözeltisi ekleyin (adım 4.1'de hazırlanmıştır).</li>
	<li>Örnekleri nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>5. Ligasyon
<ol><li>4,2'de açıklandığı gibi, RT'de 90 μL yıkama tamponu A kullanarak numuneleri 5 dakika boyunca 2x yıkayın.</li>
	<li>Deiyonize suda ligasyon tamponunun 1:5 seyreltilmesini hazırlayın. Ligaz enzimini 1:40'a (buzda) seyreltmek için bu tamponu kullanın. Kanal başına 30 μL kullanın.</li>
	<li>Yıkama tamponu A'yı tamamen epire edin ve ligasyon çözeltisini 3,5'te açıklandığı gibi ekleyin.</li>
	<li>Örnekleri nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.</li>
</ol>6. Amplifikasyon
<ol><li>4,2'de açıklandığı gibi RT'de 90 μL yıkama tamponu A kullanarak numuneleri 2 dakika boyunca 2x yıkayın.</li>
	<li>Amplifikasyon tamponunu deiyonize suda 1:5 seyrelterek hazırlayın ve polimeraz enzimini 1:80'e (buz üzerinde) seyreltmek için kullanın. Işıktan kork. Kanal başına 30 μL hazırlayın.</li>
	<li>Yıkama tamponu A'yı tamamen epire edin ve hazırlanan amplifikasyon çözeltisini 3,5'te açıklandığı gibi hemen boş kanala ekleyin. Örnekleri nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 100 dakika kuluçkaya yatır.</li>
</ol>7. Montaj
<ol><li>RT'de 4,2'de açıklandığı gibi 90 μL Yıkama TamponU B kullanarak numuneleri 10 dakika boyunca 2x yıkayın. Çekirdekleri lekeleyecek ilk yıkamaya 1 mg/mL stok çözeltisinden (deiyonize suda) DAPI (1:500) ekleyin. Kanalı kurutmayın.</li>
	<li>Yıkama tamponu B'yi deiyonize suda seyreltin (1:10) ve 4.2'de açıklandığı gibi 90 μL 0.1x tampon B çözeltisi ile 1x yıkayın.</li>
	<li>Yıkama tamponu B'yi tamamen epire edin ve hemen bir rezervuara 2-3 damla sıvı montaj ortamı ekleyin. Slaydı yatırarak kanalda dağıtın. Numuneleri görüntülemeye kadar nemli bir ortamda 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>8. Görüntü alımı
<ol><li>Floresan mikroskobu kullanarak görüntüler elde edin. Floresan PLA problarına uyan ilgili filtrelerin mevcut olduğundan emin olun. NOT: Elde edilen PLA lekeleri daha tanımlandığı için mümkünse konfokal mikroskop kullanmak faydalıdır. Bu aynı zamanda daha fazla görüntü işleme ve veri analizini de destekler.</li>
</ol>9. ImageJ/FIJI kullanarak görüntü analizi ve niceleme
<ol><li>Dışa aktarılan görüntüleri (.tiff) ImageJ27 gibi bir görüntü işleme programıyla işleyin. NOT: Bu çalışmada kullanılan ve hücresel, nükleer ve tüm PLA olaylarının (hücre başına) otomatik sayımı için gerekli olan tüm komut dosyaları gitHub deposunda bulunabilir: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Uygun herhangi bir program veya araç kullanarak istatistiksel analiz yapın.</li>
</ol>

<ol><li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+BMP+receptors%3A+Specificity%2C+activation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+and+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li>
<li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+and+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li>
<li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF%CE%B2+responses+and+altered+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557(2019).</li>
<li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ActivinA+induced+SMAD1%2F5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+%28FOP%29+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li>
<li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li>
<li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+receptor-like+kinase+%28ALK%291+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta%2FALK5+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li>
<li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1%2F5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li>
<li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1%2F5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756(2018).</li>
<li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-%CE%B2%2Fbone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry+%3A+The+Official+Journal+of+The+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li>
<li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyazono%2C+K+%22Smad+Signal+Transduction%3A+Smads+in+Proliferation%2C+Differentiation+and+Disease%22">Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease</a>. Dijke, P. T., Heldin, C. -H. , Springer Netherlands. Dordrecht. 277-293 (2006).</li>
<li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989(2018).</li>
<li>Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+in+vascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li>
<li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+TGF-%CE%B2%2FBMP+signaling+in+vascular+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li>
<li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loeys-Dietz+syndrome%3A+a+primer+for+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+in+Medicine+%3A+An+Official+Journal+of+the+American+College+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li>
<li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li>
<li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Smad+2%2F3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980(2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1%2F5+and+proliferation+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-specific+activation+of+Smad1%2F5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li>
<li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+TGF-%CE%B2+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis%3A+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li>
<li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+Ligation+Assay+%28PLA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58(2018).</li>
<li>Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012).</li>
<li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019).</li>
<li>ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ibidi%22">ibidi</a>. , (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP%2FTAZ+on+BMP%2FTGF-%CE%B2+induced+osteogenic+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051(2021).</li>
<li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It+takes+two+to+tango%3A+Endothelial+TGF%CE%B2%2FBMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965(2020).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Burada açıklanan PLA tabanlı protokol, nicel ve mekansal çözünürlükle kesme stresine maruz kalan VC'lerde iki proteinin (örneğin doğrudan etkileşimlerinin) yakınlığını belirlemenin etkili bir yolunu sunar. Birden fazla paralel kanallı akış slaytları kullanılarak, aynı mekanik koşullar altında hücrelerde aynı anda birkaç farklı protein etkileşimi incelenebilir. Buna karşılık, özel yapım akış odası sistemleri genellikle bir cam kapak parçası etrafında inşa edilen tek bir kanaldan yararlanarak slayt ve pompa başına gerekli ...

Dönüşen büyüme faktörleri beta (TGFβ) süper ailenin proteinleri, TGFβs, kemik morfogenetik proteinleri (BMP'ler) ve Activins1,2 dahil olmak üzere çeşitli üyelere sahip pleiotropik sitokinlerdir. Ligand bağlama, fosforilasyona ve böylece sitosolik düzenleyici SMAD'nin (R-SMAD) aktivasyonuna yol açan reseptör oligomerlerinin oluşumuna neden olandır. Ligandların alt ailesine bağlı olarak, farklı R-SMAD'ler etkinleştirilir1,2. TGFβs ve Activins esas olarak SMAD2/3 fosforilasyonuna neden olurken, BMP'ler SMAD1/5/8 fosforilasyona neden olur. Bununla birlikte, BMP'lerin ve TGFβs/Activins'in de ilgili diğer alt ailenin R-SMAD'lerini etkinleştirdiğine dair kanıtlar vardır, 'yanal sinyal'3,4,5,6,7,8 olarak adlandırılan bir süreçte ve her iki SMAD1/5 ve SMAD2/3, üyeden oluşan karışık SMAD kompleksleri vardır. . İki aktif R-SMAD daha sonra ortak mediatör SMAD4 ile trimerik kompleksler oluşturur. Bu transkripsiyon faktörü kompleksleri daha sonra çekirdeğe yerle bir olabilir ve hedef genlerin transkripsiyonunu düzenleyebilir. SMAD'ler çeşitli transkripsiyonal ko-aktivatörler ve yardımcı baskılayıcılarla etkileşime girebilir ve bu da hedef genleri düzenleme olanaklarının çeşitlendirilmesine yol açabilir10. SMAD sinyalinin deregülasyonunun çeşitli hastalıklarda ciddi etkileri vardır. Buna paralel olarak dengesiz TGFβ/BMP sinyali pulmoner arter hipertansiyonu, kalıtsal hemorajik telanjiektazi veya ateroskleroz3,11,12,13,14 gibi ciddi damar patolojilerine yol açabilir.
Endotel hücreleri (VC' ler) kan damarlarının en iç tabakasını oluşturur ve bu nedenle kanın viskoz akışı tarafından uygulanan sürtünme kuvveti olan kesme stresine (SS) maruz kalır. İlginçtir ki, vaskülatın yüksek düzeyde üniforma, laminar SS'ye maruz kalan kısımlarında bulunan VC'ler homeostatik ve sessiz bir durumda tutulur. Buna karşılık, düşük, homojen olmayan SS deneyimine sahip VC'ler, örneğin bifurkasyonlarda veya aort kemerinin daha az eğriliğinde, proliferatiftir ve enflamatuar yolları aktive eder15. Buna karşılık, işlevsiz EC siteleri ateroskleroz geliştirmeye eğilimlidir. İlginçtir ki, bu ateropron alanlarındaki VC'ler anormal derecede yüksek aktif SMAD2/3 ve SMAD1/516,17,18 seviyeleri gösterir. Bu bağlamda, gelişmiş TGFβ/BMP sinyalinin aterosklerotik lezyonların gelişiminde erken bir olay olduğu saptanmıştır19 ve BMP sinyaline müdahalenin damar iltihabını, aterom oluşumunu ve ilişkili kireçlenmeyi belirgin şekilde azalttığı bulunmuştur20.
Yakınlık Ligasyon Tahlil (PLA), protein-protein etkileşimlerini yerinde incelemek için kullanılan biyokimyasal bir tekniktir21,22. Hedef proteinleri birbirine bağlayabilen farklı türlerdeki antikorların özgüllüğüne dayanır ve endojen protein etkileşimlerinin tek hücre düzeyinde son derece spesifik olarak tespit edilmesine izin verir. Burada, primer antikorların tespite izin vermek için 40 nm'den daha az bir mesafede hedef epitoplarına bağlanmaları gerekir23. Bu nedenle PLA, endojen protein etkileşimlerini tespit etmek için birkaç milyon hücreye ihtiyaç duyulan geleneksel eş-immüno-immün premünipitasyon yaklaşımları üzerinde büyük ölçüde faydalıdır. PLA'da, DNA parçalarına (Artı ve Eksi problar olarak added) yaygın olarak bağlanan türe özgü ikincil antikorlar, birincil antikorları bağlar ve ilgi proteinleri etkileşime girerse, Artı ve Eksi probları yakın mesafededir. DNA aşağıdaki adımda liglenir ve dairesel DNA'nın yuvarlanan daire amplifikasyonu mümkün olur. Amplifikasyon sırasında, floresan olarak etiketlenmiş tamamlayıcı oligonükleotidler sentezlenmiş DNA'ya bağlanır ve bu protein etkileşimlerinin geleneksel floresan mikroskopi ile görselleştirilmesini sağlar.
Burada açıklanan protokol, bilim adamlarının PLA kullanarak ateroprotektif ve ateropron SS koşullarındaki aktif SMAD transkripsiyon komplekslerinin sayısını nicel olarak karşılaştırmalarını sağlar. SS, tanımlanmış seviyelerde laminar tek yönlü akış üretebilen ve akış hızlarının adım adım artmasına izin veren programlanabilir bir pnömatik pompa sistemi ile üretilir. Bu yöntem, SMAD4 ile SMAD1/5 veya SMAD2/3 arasındaki etkileşimlerin yanı sıra karışık R-SMAD komplekslerinin algılanmasını sağlar. SMAD'lerin transkripsiyonal yardımcı düzenleyicilerle etkileşimlerini analiz etmek veya SMAD'ler dışındaki transkripsiyon faktörü komplekslerine kolayca genişletilebilir. Şekil 1 aşağıda sunulan protokolün ana adımlarını göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Şekil 1: Açıklanan protokolün şematik gösterimi. (A) 6 kanallı kaydıraklarda tohumlanan hücreler pnömatik pompa sistemi ile kesme stresine maruz kalır. (B) Sabit hücreler PLA deneyi veya kontrol koşulları için kullanılır. (C) PLA deneylerinin görüntüleri floresan mikroskop ile elde edilir ve ImageJ analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>&mikro;-Slayt VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>6 kanallı slayt</td></tr><tr><td>Amonyum Klorür</td><td>Carl Roth</td><td>K298.1</td><td>Söndürme</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Carl Roth</td><td>8076.4</td><td>Engelleme</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>D9542</td><td>Leke DNA/Çekirdek</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Duolink In Yerinde Tespit Reaktifleri Green</td><td>Sigma Aldrich / Merck</td><td>DUO92014</td><td>Ligaz, ligasyon tamponu, polimeraz ve amplifikasyon tamponu içeren PLA kiti (yeşil etiketli oligonükleotidler ile)</td></tr><tr><td>Duolink Yerinde PLA Probu Anti-Fare EKSİ Sigma</td><td>Aldrich / Merck</td><td>DUO92004</td><td>EKSİ probu</td></tr><tr><td>Duolink Yerinde PLA Probu Anti-Tavşan PLUS</td><td>Sigma Aldrich / Merck</td><td>DUO92002</td><td>PLUS probu</td></tr><tr><td>Duolink Yerinde Yıkama Tamponları, Floresan</td><td>Sigma Aldrich / Merck</td><td>DUO82049</td><td>PLA yıkama tamponları A ve B</td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Takviyesi</td> Orta için <td>Corning</td><td></td><td>takviyesi (EKGS)</td></tr> <tr><td>Orta için fetal buzağı Serumu</td><td></td><td></td><td>takviyesi</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Görüntü Analizi yazılımı</td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi %4 tamponlu</td><td>KLINIPATH/VWR</td><td>VWRK4186. BO1</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Tam orta</td><td></td><td></td><td>M199 bazal orta +% 20 FCS +% 1 P / S + 2 nM L-Glu +&nbsp; 25 &mikro; g/mL Hep +&nbsp; &nbsp; 50 ve mikro; g/mL EKGS</td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin, Tip A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>Akış kanallarının kaplanması için PBS'de %0,1 kullanın</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.7</td><td>Grafikler ve istatistiksel hesaplamalar için kullanılan</td><td>GarphPad</td><td></td> İstatistik Programı</tr><tr><td>Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>orta (Hep)</td></tr> <tr><td>HUVEC'ler</td><td></td><td></td> <td>için takviye</td></tr><tr><td>ibidi Montaj Ortamı</td><td>ibidi</td><td>50001</td><td>Sıvı montaj ortamı</td></tr><tr><td>ibidi Pompa Sistemi</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>pnömatik pompa</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica</td><td></td><td>konfokal mikroskop</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>orta (L-Glu)</td></tr><tr><td>Orta 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2154</td><td>Temel ortam</td> için takviye</tr><tr><td>fare anti-SMAD1</td><td>Antikoru Abcam</td><td>ab53745</td><td>PLA</td></tr><tr><td>fare anti-SMAD2/3 Antikoru</td><td>BD Bioscience</td><td>610843</td><td>için uygun değildir CST 9515</td></tr><tr><td>fare anti-SMAD4 Antikoru</td> ile kombinasyon halinde PLA için uygun değildir <td>Sanata Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-7966</td><td>PLA</td></tr><tr><td>Penisilin 10.000U/ml /Streptomisin 10mg/ml</td><td>için uygundur PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>ortam için takviye (P/ S)</td></tr> <tr><td>Perfüzyon Seti BEYAZ</td><td>ibidi</td><td>10963</td><td>1 dyn/cm2</td></tr><tr><td>Perfüzyon Seti için kullanılan borular SARI ve YEŞİL ibidi</td><td></td><td>10964</td><td>30 dyn/cm2</td></tr><tr><td>tavşan anti-fosfo SMAD1/5 Antikor</td><td>Hücre Sinyal Teknolojileri</td><td>9516</td><td>PLA</td></tr><tr><td>tavşan anti-SMAD2/3 için uygun XP Antikor</td><td>Hücre Sinyal Teknolojileri</td><td>8685</td><td>Uygun PLA</td></tr><tr><td>tavşan anti-SMAD4 Antikor</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>9515</td><td>BD ile kombinasyon halinde PLA için uygun değildir 610843&micro</td></tr><tr><td>;-Slides</td><td>ibidi</td><td>10830</td><td>seri bağlantı tüpleri</td>için Seri Konektör</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>6683.1</td><td>Geçirgenlik</td></tr></tbody></table>

yakınlık-ligasyon-tahlil kullanarak farklı sıvı kesme stres koşulları altında tgfβ/bmp/smad sinyalinin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Büyüme Faktörü β (TGFβ)/Kemik Morfogenetik Protein (BMP) sinyalinin dönüştürülmesi, vaskülür sisteminin gelişimi ve homeostazı sırasında sıkı bir şekilde düzenlenir ve dengelenir Bu nedenle, bu sinyal yolundaki deregülasyon pulmoner arter hipertansiyonu, kalıtsal hemorajik telanjiektazi ve ateroskleroz gibi ciddi vasküler patolojilerle sonuçlanır. Kan damarlarının en iç tabakası olarak endotel hücreleri (VC' ler) sürekli olarak sıvı kesme stresine (SS) maruz kalır. Anormal sıvı SS paternlerinin, diğer uyaranlarla birlikte aterogenez indükleyen TGFβ/BMP sinyalini arttırdığı gösterilmiştir. Bununla ilgili olarak, ateroprotektif, yüksek laminar SS bu sinyali azaltırken, ateroprotektif, düşük laminar SS'nin TGFβ/ BMP sinyalini artırdığı bulunmuştur. Bu yolların aktivasyonunu verimli bir şekilde analiz etmek için, piyasada bulunan bir pnömatik pompa sistemi ve yakınlık ligasyon tahlilini (PLA) kullanarak düşük laminar SS ve yüksek laminar SS koşulları altında transkripsiyon faktörü komplekslerinin oluşumunu araştırmak için bir iş akışı tasarladık.
Aktif TGFβ/BMP-sinyalizasyon, iki düzenleyici SMAD'den (R-SMAD) oluşan trimerik SMAD komplekslerinin oluşumunu gerektirir; SMAD2/3 ve SMAD1/5/8 sırasıyla TGFβ ve BMP sinyalizasyon için) ortak bir arabulucu SMAD (ortak SMAD; SMAD4). Trimerik SMAD kompleksinin farklı alt birimlerini, yani R-SMAD/co-SMAD veya R-SMAD/R-SMAD'ı hedefleyen PLA kullanılarak, aktif SMAD transkripsiyon faktörü komplekslerinin oluşumu floresan mikroskopisi kullanılarak nicel ve mekansal olarak ölçülebilir.
Seri olarak bağlanabilen 6 küçük paralel kanallı akış slaytlarının kullanımı, transkripsiyon faktörü karmaşık oluşumunun araştırılmasına ve gerekli kontrollerin dahil edilmesine olanak tanır. 
Burada açıklanan iş akışı, farklı sıvı SS koşullarında SMAD'lerin diğer transkripsiyon faktörlerine veya SMAD'ler dışındaki transkripsiyon faktörü komplekslerine yakınlığını hedefleyen çalışmalar için kolayca uyarlanabilir. Burada sunulan iş akışı, VC'lerde sıvı SS kaynaklı TGFβ/BMP sinyalini hem nicel hem de mekansal olarak incelemenin hızlı ve etkili bir yolunu göstermektedir.

Daha önce farklı SMAD proteinlerinin etkileşimlerini tespit etmek için PLA kullandık3 ve SMAD fosforilasyonundaki kesme stresi kaynaklı değişiklikleri analiz ettik28.
Burada her iki yöntem de yukarıda açıklanan protokol ile birleştirildi. HUVEC'ler 1 dyn/cm2 ve 30 dyn/cm2 kesme stresine maruz kaldı ve SMAD transkripsiyon faktörlerinin etkileşimleri için analiz edildi. Yüksek kesme stresi (30 dyn/cm2) ile karşılaşt...

Burada, patolojik ve fizyolojik sıvı kesme stres koşullarına maruz kalan endotel hücrelerinde yakınlık ligasyon testini (PLA) kullanarak birden fazla SMAD kompleksini aynı anda görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol oluşturuyoruz.

Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Bu protokol, bilim adamlarının transkripsiyon faktörü komplekslerinin sayısını farklı kesme stres koşulları altında nicel olarak karşılaştırmalarını sağlar ve vasküler biyolojideki araştırmalar için faydalı olacaktır. Bu protokolün ana avantajı, ilgili kontroller de dahil olmak üzere çeşitli antikor çiftlerinin aynı anda araştırılmasına izin veren mikroakışkan akış kanallarının kullanımıdır. Başlamak için, PBS'de hazırlanan %0,1'lik porcine cilt jelatinini 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca kanallara ekleyerek altı kanallı slaydı kaplayın.Kanalları jelatin çözeltisinden boşaltın ve önceden kodlanmış altı kanallı slaytlardaki Huvecs tohumunu 2,5 çarpı 10 yoğunlukta M199 tam ortasının 30 mikrolitresinde mililitre başına altıncı hücrelere boşaltın. Hücrelerin nemlendirilmiş inkübatörde 37 santigrat derecede bir saat yapışmasına izin verin. Rezervuarların her birine önceden uyarılmış 60 mikrolitre M199 komple ortam ekleyin.Hücreleri 24 saat sonra orta değiştirme ile nemli bir inkübatörde iki gün boyunca 37 santigrat derecede kültürlendirin. Silikon boruyu akışkan ünitelere monte edin, rezervuarları önceden uyarılmış M199 komple ortamı ile en az 10 mililitre ile doldurun. Akışkan üniteleri boru ile pompa sistemine bağlayın ve ortamın dengesini sağlamak ve kalan havayı çıkarmak için hücreler olmadan ön çalıştırmayı gerçekleştirin.Seri bağlantı borusunu kullanarak altı kanallı slayttaki tek kanalları bağlayın. Slayttaki ilk ve son kanalı akışkanlar ünitesine monte edilen tüplere bağlayın. Hücrelerin yüksek düzeyde saf strese maruz kalması için, adaptasyon aşamaları ile akıllıca saf stres adımını artırın ve adımları 30 dakikada santimetrekare başına beş dynes artışlarla ayarlayın.Sıvı kesme stresine maruz kalmadan sonra slaytları pompalardan ayırmak, inkübatörde orta dökülmeyi önlemek ve akış slaytlarını buz üzerinde aktarmak için boru üzerindeki kümeleri kullanın. Boruyu rezervuarlardan ayırırken, hava kabarcıklarını kanala hapsetmekten kaçınmak için rezervuarın diğer tarafını kapatmak için parmağı kullanın. Akış kaydırağını buz üzerinde tutarak, ortamı rezervuarlardan dikkatlice epire edin, ancak hücrelerin bulunduğu kanaldan değil.Numuneleri bir rezervuara PBS ekleyerek 90 mikrolitre soğuk steril PBS ile yıkayın ve diğer rezervuardan dikkatlice emiş yapın, ardından tüm kanallar için tekrarlayın. PBS'nin eklendiği aynı rezervuara 90 mikrolitre tamponlanmış %4 PFA çözeltisi ekleyerek hücreleri sabitlayın ve gösterildiği gibi sıvıyı diğer rezervuardan emişlendirin. Hücreleri altı kanalda da sabitladıktan sonra, numuneleri buzdan oda sıcaklığına aktarın ve 20 dakika kuluçkaya yatırın.Bir rezervuara PBS ekleyerek ve tüm kanallarda diğer rezervuardan dikkatlice sopire ederek, kanalları kurutmamaya dikkat ederek hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. PBS'de hazırlanan 90 mikrolitre ortam 15 milimolar amonyum klorürü rezervuarlardan birine ekleyerek PFA'ya erişimi söndür. Diğer rezervuardan aspire edin ve hücreleri 10 dakika kuluçkaya bırakın.Boş rezervuarda PBS olarak hazırlanan %0,3 Triton X 100'ün 90 mikrolitresini ekleyerek hücrelerin dengesini bozun. Her kanal için diğer rezervuardan aspire edin ve 10 dakika kuluçkaya yaslayın, daha sonra daha önce gösterildiği gibi PBS ile üç kez yıkanır. Bir rezervuara 90 mikrolitre steril PLA blokaj çözeltisi.Her kanal için diğer taraftan aspire edin ve nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yaslanın. PLA antikor seyreltici ve girdap primer antikorları ekleyin. Engelleme çözeltisini rezervuarlardan ve kanallardan dikkatlice emiş edin.Çözeltiyi eklerken slaydı yatırarak birincil antikor çözeltisinin 30 mikrolitresini hemen boş kanala ekleyin. Tüm kanallar için tekrarlayın ve bir gece boyunca nemlendirilmiş odada dört santigrat derecede veya bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Pla antikor seyrelticisinde eksi tavşan ve artı fare PLA problarını bir ila beş arasında seyreltin.90 mikrolitre yıkama tamponu A ekleyerek ve gösterildiği gibi aspire ederek tüm kanalları iki kez yıkayın. Yıkama tamponunu aspire ettikten sonra, 30 mikrolitre PLA prob çözeltisi ekleyin ve nemlendirilmiş haznede kuluçkaya yatın. Ligasyon tamponunu D iyonize suda bir ila beş arasında seyreltin ve seyreltilmiş ligasyon tamponunda lygus enzimini bir ila 40 arasında seyreltin.Yıkama tamponu A'yı yıkadıktan ve tamamen aspire ettikten sonra, kaydırağı yatırırken boş kanallara 30 mikrolitre ligasyon çözeltisi ekleyin ve nemlendirilmiş odada kuluçkaya yatırın. Amplifikasyon tamponunu deiyonize suda bir ila beş seyreltin, ardından polimeraz enzimini buz üzerindeki seyreltilmiş amplifikasyon tamponunda bir ila 80 arasında seyreltin. Yıkama tamponu A'yı yıkadıktan ve tamamen aspire ettikten sonra, kaydırağı yatırırken boş kanallara 30 mikrolitre amplifikasyon çözeltisi ekleyin ve nemli bölmede kuluçkaya yatırın.Dapi'yi B yıkama tamponunda 1 ila 500 arasında seyreltin ve tüm kanalları bir kez yıkayın, B yıkama tamponu içeren 90 mikrolitre DAPI ekleyerek ve çekirdeği buharda buharlamak için gösterildiği gibi emişli. Ardından tüm kanalları DAPI olmadan B yıkama tamponu ile bir kez yıkayın. Yıkama tamponu B'yi deiyonize suda bir ila 10 arasında seyreltin ve tüm kanalları 90 mikrolitre seyreltilmiş yıkama tamponu B ile bir kez yıkayın.B yıkama tamponunu epire ettikten sonra, hemen bir rezervuara sıvı montaj ortamının iki ila üç damlasını ekleyin ve montaj ortamını tüm kanallara dağıtmak için slaydı eğin.Örnekleri görüntülemeye kadar nemli bir ortamda dört santigrat derecede saklayın. Huvecs yüksek ve düşük strese maruz kaldı. Düşük kesme stresi sitozol ve çekirdeklerde SMAD protein etkileşimlerini artırdı.Tek antikor kontrolleri çok az sinyale hayır göstererek deneyin başarısını kanıtladı. Artan antikor konsantrasyonu hücre başına daha fazla PLA olayı ile sonuçlandı, ancak yüksek ve düşük strese maruz kalan hücreler arasındaki PLA sinyallerindeki fark azaldı. Blokaj ve antikor seyreltme için kendi kendine yapılan tamponlar ticari tamponlar için alternatif olarak kullanılabilir.Pla olaylarının ticari ve kendi kendine yapılan seyreltici ve bloke edici çözümler için ölçülmesi, sitosolik ve nükleer alanlarda aynı PLA sinyallerinin desenini göstermiştir. Bununla birlikte, hücre başına toplam PLA olayı sayısı ticari çözümlerle daha yüksekti. SMAD İki/Üç, SMAD Dört antikorunun bir kombinasyonu, SMAD Four antikorunun immünofluoresans deneyleri için uygun olmadığı yerlerde kullanıldı.Deneysel ve kontrol durumunda PLA olaylarında bir fark yoktu, bu da PLA olaylarını tespit etmek için doğru antikor kombinasyonunun seçilmesinin önemini gösteriyordu. Açıklanan protokol, SMAD'lerden farklı transkripsiyon faktörü komplekslerinin etkileşimlerini tespit etmek için uyarlanabilir ve bu nedenle atero eğilimli ve atero koruyucu koşullarda gen düzenlemesini anlamaya yardımcı olur.

visualization-quantification-tgfbmpsmad-signaling-under-different

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada kemik morfogenetik protein (BMP) sabit hücreler sinyal görselleştirmek için antikor kombinasyonu ile yakınlık ligasyon Assay (PLA), nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu teknik bize BMP4 uyarımı altında efektör-kompleksleri aktif endojen BMP nükleer birikimi takip etmek ve zaman içinde bunların seviyelerini ölçmek için izin verdi.

Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

Kantitatif büyüme faktörü (TGF)-β indüklenen 3 boyutlu kolajen jel işgali dönüştürme ölçmek için bir test tarif edilir. Bu testte, meme kanseri gelişiminin farklı aşamaları temsil hücre hatlarının MCF10A serisi, yararlanır. Bu yöntem, diğer hücre hatları ile birlikte kullanılmak üzere ve diğer potansiyel aktivatörleri veya işgali inhibitörleri araştırmak için kullanılmış olabilir kabul edilebilir.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Fotolitografi tarafından kazınmış ve PDMS imal Mikroakışkan akışı odaları EC disfonksiyonu ve inflamasyon ile ilişkili fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için uygulanır. Temsili bir deneyde, diferansiyel kayma gerilmesi yeteneği sitokin aktive AK monolayers için monositik hücre adezyon modüle gösterilmiştir.

On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Hücresel sinyal yolları içinde EndMT ilgili soruşturma için yararlı olan endotel mezenkimal geçiş (EndMT), vitro indüksiyon için bir protokol açıklanmıştır. Bu deneysel modelinde, TGF-β MS-1 endotel hücreleri ile tedavi tarafından EndMT indüklenen.

Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi

Burada, TGF-β/Smad3 sinyal faaliyet bir adenovirus muhabir sistemi kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu sistem gerçek zamanlı olarak transkripsiyon etkinlikleri izler ve her iki tek hücreleri vitro ve canlı hayvan uygulanabilirmodelleri.

Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak

Biz silikon kauçuk (PDMS) ile imal yüksek verim çekiş kuvveti tahlil sunuyoruz. Bu roman tahlil çeşitli biyolojik ve Biyomedikal süreçler ve hastalıklar sırasında hücre kontrazlığı fiziksel değişiklikler okumak için uygundur. Bu yöntemin yardımcı programını, epitelyal-mesenkimal geçiş sırasında bir TGF-β bağımlılık artışına göre ölçerek gösteriyoruz.

PDMS kullanarak yüksek verim çekiş kuvveti mikroskobu dönüşüm büyüme faktörü-β epitelyal-mezenkimal geçiş üzerinde doz bağımlı etkileri ortaya çıkarır

Bu protokolün amacı, kesme stresi ve döngüsel esnemenin birleşmesini sağlayan bir biyoreaktör kullanarak, malzeme güdümlü doku yenilenmesini araştırmak için tübüler elektrospun iskelelerinde insan makrofajları ve miyofibroblastların dinamik bir ortak kültürünü yürütmektir.

Akış ve Esneme Altında Biyomalzemelerin Enflamatuar ve Rejeneratif Kapasitesini Değerlendirmek için Çok İşaretli Bir Biyoreaktör

Bu sinyalleme yolunda yer alan protein ve gen ekspresyonlarını inceleyerek TGF-β sinyallerini ve TGF-β kaynaklı EMT'yi araştırmak için sistematik bir iş akışı tanımlıyoruz. Yöntemler arasında Batı şişkinliği, luciferaz muhabiri tahlili, qPCR ve immünoresans lekeleme saydır.

Meme Kanseri ve Normal Hücrelerde TGF-β Sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı Epitel-mezenkimal Geçişin Incelenmesi

Kemik iliği vasküler nişinin in vitro bir modeli, mezenkimal ve endotel hücrelerinin önceden dökülmüş 3D PEG hidrojelleri üzerine tohumlanmasıyla oluşturulur. Nişlerin endotel ağları, ECM bileşenleri ve ALP aktivitesi kullanılan büyüme faktörüne bağlı olarak değişir. Platform, gelişmiş kanser modelleri için kullanılabilir.

Bir görüntüleme mikroplakasında önceden dökülmüş poli (etilen glikol) (PEG) hidrojeller kullanılarak vaskülarize osteojenik kemik iliği nişinin basit bir şekilde kurulması

Öğrenin, farklı sıvı kesme stres koşulları altında endotelyal hücrelerdeki SMAD komplekslerini yakınlık ligasyon tahlili ile görselleştirin ve nicelleştirin. Bu yöntem damar biyolojisi araştırmaları için değerlidir.

Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi (Video) | JoVE Journal

Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Daha fazla video keşfet