Farelerde Kalsiyum Geçici Araştırma için Objektif Lens ile Önceden Sabitlenmiş Bir Taban Kaplaması ve Miniskop Kullanımı

Bu miniskop, taban plakası prosedürü sırasında diş çimentosu ile büzülme problemini azaltabilir ve iki uzunlukta konfigürasyonda floresan sinyallerinin miniskop kayıtlarının başarı oranını artırabilir. Bazlama sırasında floresan geçici gözlenemiyorsa, kalsiyum göstergesinin ekspresyonunu ve bir röle lensinin beyin dilimi üzerindeki yerini kontrol edin. Bir milimetre çapında 20 gauge intravenöz kateterin iç iğnesini stereotaksik kola monte ederek başlayın.

Kateteri ventral mısır ammonis 1'e hedef bölgeye indirin. Daha sonra, mikroenjeksiyon iğnesini dakikada 100 ila 200 mikrometre hızla ventral kornu ammonis 1'e indirin ve viral vektörün 200 nanolitresini hedef bölgeye dakikada 25 nanolitre hızla infüze edin. Virüsün 10 dakika boyunca yayılmasına izin verdikten sonra, mikroenjeksiyon iğnesini dakikada 100 ila 200 mikrometre hızında çekin.

Röle lensini dezenfekte ettikten sonra, lensi implantasyona kadar soğuk pirojensiz salin içine batırın. Isı büzülme borulu bir mikro bulldog kelepçesi kullanarak, röle lensini tutun ve dakikada 100 ila 200 mikrometre hızında hedef bölgenin üzerine yerleştirin. Ardından, lensi diş çimentosu ile stabilize edin.

Bir miniskop ayarlamak için, objektif lensi alta sabitleyin ve taban plakasını miniskop üzerine monte edin. Taban plakasının dışına 10 santimetre parafin film sarın. Yeniden kullanılabilir yapışkan kil kullanarak, miniskobu stereotaksik kol probu ile tutun.

Objektif lensi röle lensinin üstüne, lensler arasında mümkün olduğunca az boşluk bırakacak şekilde hizalayın. Taban plakasının konumlandırılmasını sağlamak için diş çimentosu kullanın, böylece çimento sadece parafin filmine dokunur. Diş çimentosu kuruduğunda, parafin filmini, taban plakasını ve miniskobu çıkarın ve diş çimento tabanını içi boş tutun.

Röle lensini kalıplama silikon kauçuğu ile kapatın ve silikon kauçuğu ince bir diş çimentosu tabakasıyla örtün. Fareyi stereotaksik aletlerden ayırın ve fareyi bir kurtarma odasına yerleştirin. Taban kaplaması için, diş çimento çatısının ince tabakasını bir kemik rongeur ile dikkatlice kesin ve silikon kauçuğu çıkarın.

Röle lensinin yüzeyini %75 alkolle temizleyin. Miniskobun altına sabitlemek için taban plakasının yanındaki ayar vidasını sabitleyin. Netleme kaydırağını ana muhafazadan yaklaşık 2,7 ila 3 milimetre uzakta olacak şekilde ayarlayın.

Ayar tamamlandığında, miniskobu veri toplama kartına bağlayın ve miniskobu bilgisayardaki bir USB 3.0 bağlantı noktasına takın. UCLA ekibi tarafından geliştirilen veri toplama yazılımını çalıştırın. Pozlamayı 255'e, kazancı 64x'e ve uyarma LED'ini %5'e ayarlayınMiniskopu veri toplama yazılımına bağlamak için bağlan düğmesine tıklayın ve röle lensinin kenar boşluğunu bir dönüm noktası olarak göz önünde bulundurarak veri toplama yazılımının canlı akışını izleyin.

Röle lensi bulunduğunda, miniskop objektif lensini röle lensine elle hizalayın. Miniskopun çeşitli açılarını ve mesafelerini ayarlayarak, floresan sinyallerini aramaya başlayın. Miniskobu en uygun konumda tutarak, stereotaksik kolu mini skopa doğru hareket ettirin ve miniskobu yeniden kullanılabilir yapışkan kil ile stereotaksik kola yapıştırın.

X, Y ve Z kollarını hafifçe ayarlayarak en iyi görünümü arayın. Z eksenindeki kulak çubuğunu, diş çubuğunu veya yeniden kullanılabilir yapışkan kili döndürerek objektif lens ile röle lensinin yüzeyi arasındaki açıyı ayarlayın. Viral ekspresyon ve lens implantasyonu, bazlasyon sırasında en az bir hücre yer değiştirdiğinde floresan geçici olduğunda başarılıdır.

Optimum pozisyonun değişmediğinden emin olmak için ilgili bölgeyi izlerken taban plakasını mümkün olan en az miktarda diş çimentosu ile sıkıca sabitleyin. Temsili çalışmada, kukla taban kaplama prosedürü, taban plakası konumunda orijinal prosedürden daha küçük bir kaymaya neden olduğu için avantajlı olduğunu kanıtladı. Taban plakasının kayması da diş çimentosunun yüksekliğinden etkilenmiştir.

Kafatasının 0,5 santimetre yukarısına sabitlenmiş taban plakası, kafatasının bir santimetre yukarısına sabitlenmiş taban plakasından önemli ölçüde daha az kaymıştır. Baz kaplama prosedürü sırasında başarılı bir görüntüleme örneğinde, anestezi uygulanan hayvanda kan damarları ile birlikte floresan geçicileri fark edildi. Floresan geçicileri, fare ev kafesinde serbestçe davranırken bile, bir pozisyonda sadece hafif bir kayma ile taban kaplamasından beş gün sonra gözlendi.

Daha sonra farelerin kalsiyum görüntülemesi yapıldı. Birkaç durumda, taban kaplama prosedürü sırasında, tek tip bir arka plan veya beyaz hücre kenar boşluklarının görünürlüğü dışında hiçbir şeyin olmaması gibi sorunlar meydana geldi. floresan geçicileri olmadan.

Taban plakasını, mümkün olan en az miktarda diş çimentosu ile hedef bölgeye sıkıca sabitlemek önemlidir. Kayrak tekniği ile araştırmacılar, bu konudaki nöral aktiviteyi uzunlamasına gözlemleyebilirler. Uygun lisansla, bu prosedür görüş alanındaki sinir ağını gözlemlemek için de geçerli olabilir.