İnsan Preimplantasyon Embriyolarının Harcanan Kültür Ortamı Kullanılarak Kromozom Taraması: Örnek Toplama ve Kromozomal Ploidi Analizi

Protokol, insan implantasyon öncesi embriyolarının non-invaziv kromozom tarama NICS'sine dayalı kültürlenmiş ortam koleksiyonunu ve kromozomal ploidi analizini normalleştirmektir. NICS'in ana avantajı, TiDieR mikro manipülasyonundan ziyade kullanımı kolaydır, zaman kazandırır ve invaziv biyopsi örnek kaybını etkili bir şekilde azaltır. Örnekleme yöntemi çok esnektir.

Burada size biri rutin ardışık embriyo kültürü, diğeri ise bir adım için olmak üzere iki farklı seçenek sunuyoruz. Bunlar ekibimizin ana meslektaşlarıdır, Dr.Yaxin Yao ve Dr.Xiaohui Zhu esas olarak kütüphane hazırlığından ve NICS rejenerasyon dizilemesinden sorumludur. Dr.Jialin Jia ve ben embriyoloji çalışmalarını ve numune toplamayı tamamlıyoruz.

Profesör Liu, grubumuzun lideridir. Aynı zamanda bu makalenin sorumlu yazarıdır. Başlamak için reaktifleri ve araçları hazırlayın.

Kullanmadan önce 20 ila 30 mikrolitre kültür ortamı ve hyaluronidazı önceden ısıtın ve dengeleyin. Daha sonra kültür ortamını ve hyaluronidazı çeker ocaktaki bir çalışma yüzeyine yerleştirin. Oosit kullanımı için sindirilmiş OCCC'leri kültür kabına hızla aktarın ve her kuyucuğu mineral yağ ile kaplayın.

Oositlerin etrafındaki kalıntı granüloza hücrelerini çıkarmak için oositleri beş ila 10 kez nazikçe aspire edin ve serbest bırakın. Granüloza hücrelerini tamamen çıkarmak için kalan üç kuyucukta bu adımı tekrarlayın. Bir mikroskop kullanarak granüloza hücresi çıkarılmasının eksiksizliğini değerlendirin.

Daha sonra ICSI olarak da adlandırılan intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu yapın ve embriyoyu kültür ortamına aktarın. Her embriyo için 20 ila 30 mikrolitre blastosist kültürü ortamı mikrodamlacıkları hazırlayın. Embriyoları ikinci gün bir doku kültürü kabında mineral yağ ile kaplayın ve 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %5 oksijende inkübe edin.

Üçüncü gün embriyosunu yıkama mikrodamlacığına aktardıktan sonra, pipetleri kullanarak üç damlacıktaki mikro damlacıktaki embriyoyu nazikçe aspire edin ve serbest bırakın. Daha sonra embriyoyu blastosist kültür ortamına aktarın. Yıkama mikro damlacıklarını ve kültür mikro damlacıklarını hazırlayın.

Dördüncü günün öğleden sonrasında, embriyoyu önceden ısıtılmış kültür ortamının mikro damlacıklarına aktarın ve her embriyoyu pipetlerle üç mikro damlacık halinde seri olarak yıkayın. Numune toplama için her embriyoyu önceden ısıtılmış benzersiz bir tek mikro damlacık kültür ortamına aktarın. Kriyo-rezervasyondan önce blastosist embriyosunu kültürleyin.

Embriyo kriyoprezervasyonundan önce vitrifikasyonu gerçekleştirmek için, kültür mikrodamlacıklarını hazırlayın ve embriyoyu 10 ila 15 mikrolitre kültür ortamının önceden ısıtılmış mikro damlacıklarına aktarın. Ve her embriyoyu beşinci günün sabahı pipetleyerek üç mikro damlacıkta seri olarak yıkayın. Daha önce gösterildiği gibi, numune toplama için her embriyoyu önceden ısıtılmış benzersiz bir tek mikro damlacık kültür ortamına aktarın.

Ve kriyo-korumadan önce blastosist embriyosunu 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin. Daha sonra, sıvıyı blastocoel boşluğundan serbest bırakmak için trofektodermde küçük bir delik oluşturmak için trofektodermin hücre bağlantısına odaklanan lazer ışınının hedeflenen noktasından ICM'yi önemli bir mesafede nazikçe ayarlayın. Numuneyi toplamak için kitteki tamponu oda sıcaklığında çözdürün ve kısa bir süre santrifüjleyin.

Daha sonra kültür ortamını, her bir kültürlenmiş embriyodan, beş mikrolitre hücre lizis tamponu içeren bir RNase-DNaz içermeyen PCR tüpüne aktarın. Reaktifleri ve araçları hazırlayın. Genomik DNA'nın miktarının belirlenmesinden sonra, kültür ortamı ile mikrolitre başına 50 pikogram konsantrasyona seyreltilir.

İyice karıştırdıktan sonra, tüpü beş saniye boyunca 200 G'de kısaca santrifüjleyin. Kültür ortamını bir mikrosantrifüjde 30 ila 60 saniye santrifüjledikten sonra, tüpün altından 10 mikrolitre kültür ortamını seyreltilmiş pozitif kontrol ve taze kültür ortamını yeni bir 0.2 mililitrelik PCR tüpüne pipetleyin. Bir mikrolitre MT enzim karışımı ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın.

Ardından hemen iki ila üç saniye santrifüjleyin. PCR tüpünü önceden ısıtılmış karışık bir numune hazırlama istasyonuna koyun ve lizis programını çalıştırın. Pre-lib tamponu çözülüp karıştırıldıktan sonra, hemen 200 G'de iki ila üç saniye santrifüjleyin.60 mikrolitre ön kütüphane tamponuna iki mikrolitre kütüphane öncesi enzim karışımı ekleyerek kütüphane öncesi reaksiyon için bir ana karışım hazırlayın.

Reaksiyonu iyice karıştırın ve kısa bir süre santrifüjleyin. Ön işlemden geçirilmiş ortam numunesine 60 mikrolitre kütüphane öncesi reaksiyon karışımı ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırdıktan sonra, hemen 200 G'de iki ila üç saniye santrifüjleyin.

Kütüphane öncesi programı çalıştırın ve dört santigrat derecede tutun. 60 mikrolitre kütüphane tamponuna 1.6 mikrolitre kütüphane enzim karışımı ekleyerek kütüphane reaksiyonu için bir ana karışım hazırlayın. Reaksiyonu iyice karıştırın ve daha önce gösterildiği gibi santrifüjleyin.

Her bir kütüphane öncesi ürüne 60 mikrolitre kütüphane reaksiyon karışımı ve iki mikrolitre barkod astarı ekleyin. Ardından reaksiyonu iyice karıştırın ve gösterildiği gibi santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra PCR tüpünü termal döngüleyiciye yerleştirin.

Kütüphane hazırlık programını çalıştırın ve ardından dört santigrat derecede tutun. Reaktifleri ve araçları hazırlayın. Hazırlanan 1X hazırlanmış mega boncukları kütüphane örneğine ekleyin.

Saflaştırılmış kitaplıkları metin el yazmasında açıklandığı gibi ölçün ve havuzlama için her kitaplık örneğinin 10 nanogramını kullanın. Sıralama kullanım kılavuzuna bakın ve sıralama tamamlandıktan sonra veri analizi yapın. ChromGo'da veri analizi için oturum açma sayfasına kullanıcının adını ve şifresini girin.

Giriş yaptıktan sonra, NICS sekmesi altındaki Form Gönderimi Oluştur'a tıklayın. Ardından Platform için NGS'yi, Corporation için Illumina'yı ve Reaktif için NICSInst'i seçin. Proje Kimliği'nin altındaki kutuya proje bilgilerini girin.Analiz tercihlerini ayarlayın ve dosyaları yükleyin.

Tüm sıralama dosyaları başarıyla yüklendikten sonra, analizi başlatmak için Gönder'e tıklayın. Gönderilen projeler, Gönderimleri Görüntüle sekmesi altında listelenir. NICS analizinin özet tablosunu görüntülemek için Rapor alanındaki Göster düğmesini tıklatın.

Raporları kaydetmek için Raporu Dışa Aktar düğmesini tıklayın. Hastalardan altı blastosist elde edildi ve altı embriyonun hepsine dördüncü günden beşinci güne kadar NICS uygulandı. Ebeveynlerin dengeli translokasyonunun neden olduğu kromozom anormallikleri, NICS testi kullanılarak kromozomların beşinde tespit edildi ve bu nedenle transfer için kullanılmadı.

İki embriyonun NICS sonuçları, aynı karyotip 45 XN ve kromozom 18 delesyonunun her ikisinin de kromozom 18 delesyonları olduğunu gösterdi. Kromozom bir bölge delesyonunun karyotip 46 XN kısa kolu, kromozom bölgesi delesyonunun sadece kısa koluydu. NICS sonuçları, kromozom 18 bölgesinin uzun kolunda delesyon ve kromozomun kısa kolunda bir bölge duplikasyonu ile karyotip 46 XN gösterdi.

Karyotipler kromozom beş duplikasyonu olmasına ve sekiz mozaik farklılığı göstermesine rağmen, NICS testi 24 kromozomun tümünü anöploidi açısından tarayabilir. Bu işlem, tek normal karyotip blastosistlerin transferi için yeni bir yöntem sağlar. Bu prosedürü denerken, maternal orijin kontaminasyonunu önlemek için kümular hücreleri tamamen çıkarmayı ve DNA içeriği amplifikasyon için yeterli olduğunda kültür ortamını ve açıklanan blastosist aşamasını toplamayı hatırlamak önemlidir.

Bu çalışma, NICS teknolojisini kullanarak, WGA ve WGS kütüphanesi hazırlama adımlarını yaklaşık üç saat içinde düzene soktu ve CCS sonucunu yaklaşık dokuz saat içinde invaziv olmayan bir şekilde seçti. Geliştirildikten sonra, teknik, ART'deki klinisyene morfolojik değerlendirmeyi NICS ile birleştirmenin yeni bir yolunu sağladı ve iyi morfolojiye sahip aploidi embriyosunu uterusa transfer etmek için devam eden gebelik oranlarını ve canlı doğum oranlarını iyileştirebilir.