Name: Uyanık Farelerde Tekrarlanan In Vivo Görüntüleme için Kraniyal Pencerenin İmplantasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Öğrenin, uyanık farelerde kronik kraniyal pencere implantasyonu ile nöron ve astrositlerin tekrarlanan görüntülenmesini. Bu yöntem, nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozukluk modellerinde beyin hücre dinamiklerinin uzunlamasına incelenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm hayvan deneyleri, Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'ndeki IACUC tarafından onaylanan kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Ameliyattan önce
<ol><li>Viral enjeksiyonlar için pipetler hazırlayın. Pipet çektirici kullanarak borosilikat cam kılcal damarları çekin ve pipeti 20° açıyla eğimlendirin. Pipetleri gece boyunca sterilize edin.</li>
	<li>Taze steril jel köpük parçalarını küçük kareler halinde keserek hazırlayın. Jel köpüğü 0,5 mL salin içeren steril bir mikrofüj tüpüne batırın. Jel köpüğü kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca tuzlu suya batırın.</li>
	<li>İnce şeritler halinde keserek taze sünger şerit parçaları hazırlayın.</li>
	<li>Ameliyattan yirmi dakika önce, 4-6 haftalık GLAST-CreER / GCaMP6f farelere intraperitoneal olarak beyin şişmesini önlemek için 0.2 mg / kg deksametazon ve iltihabı azaltmak için 5 mg / kg karprofen enjekte edin. NOT: Astrositlerin yaklaşık% 40'ında GCaMP6f'nin rekombinasyonunu ve ekspresyonunu indüklemek için, GLAST-CreER / GCaMP6f farelerine, art arda 5 gün boyunca 3 haftada 100 mg / kg tamoksifen enjekte edildi.</li>
</ol>2. Ameliyatın başlaması
<ol><li>20 dakika sonra, fareleri yaklaşık 1,5 dakika boyunca 1 L / dak akış hızında oksijenle% 3 izofluran ile uyuşturun.</li>
	<li>Anestezi uygulandıktan sonra, ameliyat boyunca vücut ısısını 37 ° C'lik bir seviyede tutmak için fareyi su devridaim battaniyesi üzerine oturan stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin. Burun kelepçesini ve kulak çubuklarını kullanarak fareyi çerçeveye sabitleyin. Burun kelepçesinin ve kulak çubuklarının, işlem sırasında başın hareket etmeyeceği, ancak kafatasının hasar göreceği kadar sıkı olmadığından emin olun.</li>
	<li>Anesteziyi% 1-1.5 izofluran ile oksijen ile 1-2 L / dak akış hızında tutun. Bazı hayvanların sedasyonu sürdürmek için az ya da çok izoflurana ihtiyaç duyabileceğini unutmayın. Hayvanın nefes alışını, ayak parmağı ve kuyruk sıkışma reflekslerini izleyin ve izofluranı uygun şekilde ayarlayın.</li>
	<li>İşlem sırasında gözlerin kurumasını önlemek için pamuklu bir uç aplikatörü kullanarak her göze göz merhemi uygulayın.</li>
	<li>Kemirgen düzelticileri kullanarak, saçları boyundan gözleri geçmek için tıraş edin. Hayvanın bıyıklarının yanlışlıkla kesilmediğinden emin olmak için dikkatli olun.</li>
	<li>Tıraş edilen bölgeyi bir iyot hazırlama pedi ve ardından bir alkol hazırlama pedi ile temizleyin.</li>
	<li>Steril doku forseps ve cerrahi makas kullanarak, cildi ön dikişlerden ön dikişlerden lambda'ya kadar arkadan bregmaya kadar kesin ve çıkarın.</li>
	<li>Cilt çıkarıldıktan sonra, kafatasının kanamasını en aza indirmek için kafatasına yaklaşık 0.1 mL% 1 ksilokain (epinefrin 1: 200.000 ile lidokain) ekleyin.</li>
	<li>Bir sapa tutturulmuş steril boyutta 11 karbon çelik cerrahi bıçak kullanarak, bağ dokusunu kafatasından hafifçe kazıyın. Kafatasının kenarına yakın bağ dokusunu çıkarırken ekstra özen gösterin, çünkü kalan herhangi bir doku daha sonra camın veya kafa plakasının güçlü bir şekilde yapışmasını önleyebilir.</li>
	<li>Kafatasından gevşek bağ dokusunu çıkarmak için steril doku forseps kullanın.</li>
	<li>Steril pamuk ucu aplikatörleri kullanarak, kafatasından kalan ksilokaini temizleyin.</li>
	<li>Tamamlandığında, asetona batırılmış steril bir pamuk ucu aplikatörü kullanarak kafatasını iyice yağdan arındırın. Kafatasını hemen üfleyerek kurutmak için basınçlı hava kullanın.</li>
</ol>3. Kraniotomi
<ol><li>İnce noktalı bir işaretleyici ve bir cetvel kullanarak, istenen konumdaki açıklık için uygun boyutu ölçün. Kapak camının boyutuyla (3 veya 5 mm çapında) karşılaştırarak açıklığın boyutunu onaylayın; açıklığın kapak camının boyutundan biraz daha küçük olduğundan emin olun.</li>
	<li>Bir diş matkabı kullanarak, kemiği incelterek açıklığın ana hatlarını yavaş yavaş izleyin. Kemiğin delinmesini önlemek için yavaşça delin ve kemiğin incelmesini kolaylaştırmak için eşmerkezli dairelerde delin.</li>
	<li>Her konsantrik geçişten sonra, delinen bölgeye bir veya iki damla steril salin ekleyin. Kemiğin aşırı ısınmasını ve altta yatan duraya zarar vermesini önlemek için salinin en az 10 s oturmasına izin verin.</li>
	<li>Kalan tuzlu suyu emmek için steril bir pamuk ucu aplikatörü kullanın. Sondaja devam etmeden önce kalan tüm tuzlu suyun buharlaştığından emin olmak için alanın üzerine basınçlı hava üfleyin. Kalan kemik kalıntılarını üflemek için bunu yapın.</li>
	<li>Kemik çıkarılmak üzere yeterince inceltilene kadar 3.2-3.4 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>İnceltilmiş kafatasının hareket ettiğini kontrol etmek için kemiğin orta bölgesine ince forseps ile hafifçe iterek kemiğin çıkarılmak üzere yeterince inceltildiğinden emin olun. Altta yatan vaskülatür, sondajın gerçekleştiği yerde görünür olmalıdır. Kemiğin, incelmenin meydana geldiği yerde çatlayacakmış gibi görünebileceğini gözlemleyin. NOT: Bu aşamada eğitim, kemiğin ne zaman uygun şekilde inceltildiğini belirlemek için çok önemlidir.</li>
	<li>Kemiği çıkarmaya çalışmadan önce, tamamen yatıştırıldığından emin olmak için fareyi kontrol edin. Değilse, kemiği çıkarırken beyin şişmesini önlemek için izofluran bakımını kademeli olarak artırın.</li>
	<li>İnceltilmiş kafatasına saline doymuş küçük bir parça jel köpük ekleyin. İnceltilmiş kafatasına bir veya iki damla daha salin ekleyin. NOT: İnceltilmiş kafatası üzerinde bol miktarda salin bulunması, kemik kapağını çıkarırken kanamayı azaltmaya ve durayı korumaya yardımcı olur.</li>
	<li>Minyatür 15° sivri uçlu bir bıçak kullanarak, bıçağı inceltilmiş kemiğe dikkatlice yerleştirin ve inceltilmiş kemik boyunca kesin. Jel köpüğü tuzlu suya batırılmış halde tutun, oluşabilecek kanamaları durdurmaya hazır olun.</li>
	<li>Forseps kullanarak, kemiği dikkatlice kaldırın ve çıkarın. Altta yatan doku ve vaskülatüre zarar vermemek için mümkün olduğunca nazik olun. Dura mater'e zarar vermemek için çok dikkatli olun.</li>
	<li>Kemik kapağı çıkarıldıktan sonra, kortekse salin içine doymuş taze bir jel köpük parçası ekleyin. Jel köpüğün kurumasını önlemek için birkaç damla salin ekleyin, çünkü bu altta yatan dokuya zarar verecektir.</li>
</ol>4. Viral enjeksiyonlar
<ol><li>Stereotaksik bir cihaz kullanarak viral enjeksiyonlar yapın.<ol>
<li>AAV1'i hazırlayın. CaMKII.0.4.Cre (3 × 1013 genom kopyası (GC) / mL'lik titre) 1:5,000'de salin içindeki seri seyreltmelerle.</li>
		<li>AAV1 karışımını hazırlayın. CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) ve AAV1. CAG. FLEX.tdKüçük bir parafilm parçası üzerinde domates (5 ×10 12 GC/mL titre).</li>
		<li>Uç boyutu 20 μm olan steril eğimli cam pipeti, solüsyonun üzerine nazikçe yerleştirerek virüs karışımıyla doldurun.</li>
		<li>Pipet, beynin yüzeyine değecek şekilde alçaltın ve L2/3 enjeksiyonları için ilave 200-300 μm için alçaltmaya devam edin. Hücre içi mikroenjeksiyon dağıtım sistemi kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız), 2 dakika boyunca 12-15 kez basınç enjekte edin (20 psi, 9 ms darbe süresi). Pipetin tıkanmadığından emin olmak için her enjeksiyonda pipet damlasındaki menisküse dikkat edin.</li>
		<li>Enjekte edildikten sonra, geri akışı önlemek için pipeti beyinde 4-5 dakika bekletin. Pipetin yavaşça geri çekilmesini sağlayın.</li>
		<li>Enjeksiyonları 2-3 bölgede tekrarlayın (yaklaşık 500 μm aralık).</li>
		<li>Cre virüsünün seri seyreltilmesi için kullanılan kullanılmış cam pipetleri, parafilmi, pipet uçlarını ve mikrofüj tüplerini %10 ağartıcıya atın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Kraniyal pencerenin implantasyonu
<ol><li>Herhangi bir jel köpüğü çıkarın ve kalan salini emmek için küçük bir sünger şerit şeridi kullanın.</li>
	<li>Açıklığa birkaç damla antibiyotik enrofloksasin (22.7 μg / mL) ekleyin ve 1 dakika boyunca orada kalmasına izin verin. 1 dakika sonra, kalan enrofloksasini emmek için taze bir sünger şerit parçası kullanın. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Üçüncü yıkamadan sonra, açıklığa birkaç damla salin ekleyin ve 1 dakika boyunca orada kalmasına izin verin. 1 dakika sonra, kalan salini emmek için taze bir sünger şerit parçası kullanın. Bu yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın ve üçüncü yıkamadan sonra açıklığa küçük bir damla salin ekleyin.</li>
	<li>Kapak camını açıklığın üzerine yerleştirin. İyi kalitede görüntüler elde etmek için camın açıklığın üzerinde aynı hizada olduğundan emin olmak için forseps kullanın.</li>
	<li>Camı yavaşça yerinde tutarken, pencerenin kenarlarını kafatasına kapatmak için camın çevresine siyanoakrilat yapışkan jel (Malzeme Tablosu) uygulayın. Yapıştırıcının kapak camının altına sızmasına izin vermediğinizden emin olun ve kapak camının yüzeyinden mümkün olduğunca fazla yapıştırıcı tutun.</li>
	<li>Yapışkan jelin üzerine bir süper yapıştırıcı tabakası uygulayın. Sertleşmesini sağlamak için yapıştırıcının üzerine bir diş çimento sıvısı tabakası ekleyin.</li>
	<li>Uygun boyutta bir helikopter tipi kafa plakası alın ve merkezi açıklığın etrafına ince bir yapıştırıcı tabakası uygulayın. Kafa plakasını kapak camının üzerine yerleştirin ve yapıştırıcının kısa bir süre kurumasını bekleyin.</li>
	<li>1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde, tüp üzerindeki 0,1 mL işaretine diş çimento tozu ekleyin. 7-8 damla hızlı sertleşen, anında yapışkan ekleyin ve karıştırın. Daha büyük bir açıklık oluşturmak için kesilmiş 19 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik bir şırıngaya çekin.</li>
	<li>Karışımı, her iki taraftan da sızana kadar helikopter çubuğunun yan deliklerinden enjekte edin. Diş çimentosu / yapıştırıcı karışımını, kafa plakasını kafatasına sabitlemek için maruz kalan kafatasının geri kalanına uygulayın, bu da görüntüleme sırasında hareket artefaktlarını azaltacaktır.</li>
	<li>Karışımın en az 15 dakika boyunca havada kurumasını bekleyin.</li>
	<li>İyileşmeye yardımcı olmak için fareye deri altından 0,5 mL salin enjekte edin.</li>
</ol>6. İşlem sonrası
<ol><li>Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve kafesine geri getirin.</li>
	<li>İyileşmeye yardımcı olmak için kafesin bir kısmını su devridaim battaniyesine, uzay jeli ısıtma pedlerine veya izotermal pedlere yerleştirin.</li>
	<li>İyileşmeye daha fazla yardımcı olmak için hayvana, düzenli diyetlerine ek olarak, küçük bir yiyecek topağı ve ıslak yiyecek yardımı sağlayın. İyileşme süresi boyunca ameliyattan sonra her gün yeni yiyecek peleti ve ıslak yiyecek ekleyin.</li>
	<li>Ameliyattan sonraki gün, farelere bir kez 5 mg / kg karprofen ve 5 mg / kg enrofloksasin enjekte edin.</li>
	<li>2-6. günlerde, farelere bir kez 5 mg / kg karprofen ve iki kez 5 mg / kg enrofloksasin enjekte edin, yerel IACUC tarafından onaylanmayı bekleyin. Enrofloksasin enjeksiyonlarını en az 8 saat ayırın.</li>
	<li>7-20. günlerde, farelere günlük 5 mg / kg karprofen enjekte edin.</li>
</ol>7. Görüntüleme için hayvan alışkanlığı
<ol><li>Ameliyattan sonraki 14. günde, optik netlik için kraniyal pencereyi inceleyin. Belirsiz veya başka bir şekilde hasar görmüş pencereleri olan fareleri kullanmayın (yani, aşırı anjiyogenez).</li>
	<li>Bir floresan mikroskobu altında tdDomates ekspresyonunu kontrol edin. Etiketlenmiş hücreler tanımlanabilirse, hayvan alışkanlığına devam edin.</li>
	<li>Alışkanlığın ilk günü (kullanım)<ol>
<li>Fareyi birkaç dakika tutun ve kullandıktan sonra kafesine geri koyun. İşlemi seanslar arasında 15 dakikalık aralıklarla üç kez tekrarlayın.</li>
		<li>Üçüncü denemeden sonra, hayvanı küçük bir bez parçasına sararak fareyi alışkanlık haline getirin.</li>
		<li>Fareyi beze sarılmış olarak yaklaşık 1 dakika tutun.</li>
		<li>Denemeden sonra, fareyi kafesine geri getirin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın ve her deneme arasında 15 dakikalık bir aralığa izin verin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alışkanlığın ikinci günü<ol>
<li>Fare ağırlığını tartın ve kaydedin.</li>
		<li>Fareyi beze sarın ve kafa plakası aracılığıyla hava ile kaldırılan ev kafesinin kafa sabitleme koluna sabitleyin.</li>
		<li>Ev kafesini ışığa açık bırakın.</li>
		<li>Farenin mobil ev kafesinde 15 dakika boyunca sabit kalmasına izin verin.</li>
		<li>Alışkanlıktan sonra, fareyi ev kafesinden çıkarın ve hava akışını kapatın.</li>
		<li>Fareyi tartın ve kafesine geri koyun. Sadece vücut ağırlığının% 10'undan fazlasını kaybetmeyen fareleri dahil etmeye dikkat edin. Herhangi bir alışkanlık gününde ağırlıklarının% 10'undan fazlasını kaybeden fareleri görüntüleme deneylerinden hariç tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alışkanlığın üçüncü günü ve sonrası<ol>
<li>Fare ağırlığını hava ile kaldırılan ev kafesine sabitlemeden önce tartın ve kaydedin.</li>
		<li>Fareyi havayla kaldırılmış ev kafesine sabitleyin.</li>
		<li>Ev kafesini kutu gibi karanlık bir iç mekan sağlayacak bir şeyle örtün ve farenin 30 dakika boyunca güvenli kalmasına izin verin.</li>
		<li>30 dakika sonra, ev kafesini ortaya çıkarın, fareyi çıkarın ve hava akışını kapatın.</li>
		<li>Alışkanlıktan sonra fare ağırlığını tartın ve kaydedin.</li>
		<li>Bu işlemi her gün tekrarlayın, farenin ev kafesine sabitlenme süresini 15 dakika artırın. Fare, iki fotonlu görüntüleme oturumunun yaklaşık süresi olduğundan, fare 1,5 saat boyunca ev kafesine sabitlenene kadar bu işleme devam edin.</li>
		<li>Fareyi gürültüye alıştırmak için, fareyi lazer tarama aynalarının seslerine alıştırmak için mikroskopta bazı alışkanlık oturumları gerçekleştirin. Yeterince alışkanlık kazanamayan fareleri hariç tutun (yani, seslendirmeler ve strese bağlı dışkılama).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Çoklu foton görüntüleme
<ol><li>Pencerenin temizlenmesine izin vermek için ameliyattan 3 hafta sonra görüntülemeye başlayın.</li>
	<li>Ti:Sapphire lazer ile donatılmış özel yapım veya ticari olarak temin edilebilen bir multifoton mikroskopta görüntüleme gerçekleştirin. Yüksek sayısal diyaframlı (NA) suya daldırma hedefini kullanarak görüntüler elde edin. NOT: İki kanallı görüntüleme, 565 nm dikroik ayna ve iki harici fotoçarpan tüpü kullanılarak elde edilir. GCaMP6f emisyonunu tespit etmek için 535/50 bandpass filtresi kullanılır ve tdTomato'yu tespit etmek için 610/75 bandpass filtresi kullanılır. Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen görüntüleri elde etmek için 25x suya daldırma hedefi (1.05 NA) ve rezonans tarayıcıları kullanılmıştır. İlgilenilen her bölge, eksenel olarak 1 μm ile ayrılmış bir görüntü yığınından oluşuyordu. Her optik bölüm 512 x 512 piksel, 0,18 μm/piksel olarak toplandı. Görüntüler, stereotaksik koordinatlarla belirlenen primer motor korteksin ön ayak bölgesinden elde edildi.</li>
	<li>Lazerin dalga boyunu 920 nm'ye (kırmızıya kaymış bir GECI kullanılıyorsa 990 nm) ayarlayın.</li>
	<li>Fareyi mobil ev kafesine yerleştirin ve kafa plakasını kafa sabitleme koluna kelepçeleyin.</li>
	<li>Pencerenin ortasına birkaç damla su ekleyin.</li>
	<li>Mikroskobun geniş alan modunu kullanarak, kolayca tanımlanabilen vaskülatürden 2-3 pozisyon seçin. Bu kan damarlarının görüntülerini kaydedin ve sonraki görüntüleme oturumları için tdDomates etiketli dendritlerin yerini değiştirmek için motor kontrolöründe görünen X ve Y koordinatlarını kaydedin. Kan damarlarının kaydedilmiş görüntüleriyle yeniden hizalamak için her seferinde X ve Y koordinatlarını ayarlayın.</li>
	<li>Vaskülatür görüntülendikten ve pozisyonlar kaydedildikten sonra, tdTomato eksprese eden nöronların bulunduğu bölgeleri bulun (Şekil 1). Astrositlerdeki nöronların sinaptik yapılarını (dendritler ve aksonlar) ve GCaMP6f aktivitesini görüntüleyin. NOT: Dendritler, aynı bölgelere güvenilir bir şekilde geri dönmek ve tekrarlanan günlerde aynı dendritleri ve astrositleri görüntülemek için işaretler olarak hizmet edecektir. Stabil kafa fiksasyonu ile ve kafa fiksasyonuna alıştıktan sonra görüntüleme düzleminde saptanabilir bir kayma gözlenmedi. X ve Y yönlerinde meydana gelen yer değiştirme, hareket düzeltmelidir.</li>
	<li>Görüntülemeden sonra fareyi kafesine geri getirin. NOT: Fareler tipik olarak en fazla 2 saat boyunca kapsamda tutulur. Görüntüleme uzun sürdüğünde, hedefin altındaki su kuruyabilir. Deneyler sırasında su eklenmelidir. Alternatif olarak, su yerine ultrasonik bir jel kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branch-specific+dendritic+Ca2%2B+spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li>
<li>Goncalves, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+level+defects+in+the+developing+neocortex+of+Fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).</li>
<li>Padmashri, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+structural+and+functional+synaptic+plasticity+with+motor+skill+learning+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).</li>
<li>Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+reproducible+spatiotemporal+activity+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning.</a> Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).</li>
<li>Poskanzer, K. E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+cortical+state+switching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate cortical state switching in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2%28-%2F-%29+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).</li>
<li>Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+calcium+signaling+transforms+cholinergic+modulation+to+cortical+plasticity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stably+maintained+dendritic+spines+are+associated+with+lifelong+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories.</a> Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+long-term+dendritic+spine+stability+in+diverse+regions+of+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex.</a> Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li>
<li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742(2014).</li>
<li>Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+stabilization+of+dendritic+spines+in+fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice.</a> Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).</li>
<li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+opening+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+induces+microdomain+calcium+transients+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li>
<li>Bindocci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Ca2%2B+imaging+advances+understanding+of+astrocyte+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology.</a> Science. 356 (6339), (2017).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Han, S., Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+volumetric+imaging+of+neuronal+activity+of+cortical+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns.</a> Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Stowell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenergic+signaling+in+the+wakeful+state+inhibits+microglial+surveillance+and+synaptic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Chen, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+plasticity+of+inhibitory+circuits+in+motor+cortex+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).</li>
<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li>
<li>Matsui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024(2011).</li>
<li>Roth, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+synaptic+AMPA+receptor+plasticity+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning.</a> Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).</li>
<li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li>
<li>Suresh, A., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+synaptic+AMPAR+and+spine+dynamics%3A+impairments+in+the+FXS+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse.</a> Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+two-photon+imaging+of+synaptic+structures+in+the+cortex+of+awake+head-restrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-floored+air-lifted+platform%3A+a+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869(2014).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Hauglund, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+lymphangiogenesis+and+enhanced+glymphatic+activity+in+mice+with+chronically+implanted+EEG+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes.</a> Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).</li>
<li>De Paola, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+structural+plasticity+of+axonal+branches+and+boutons+in+the+adult+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex.</a> Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+two-photon+calcium+imaging+at+different+depths+with+spatiotemporal+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing.</a> Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742(2012).</li>
<li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium--implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li>
<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li>
<li>Pryazhnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+two-photon+imaging+in+somatosensory+cortex+of+behaving+mice+reveals+dendritic+spine+formation+enhancement+by+subchronic+administration+of+low-dose+ketamine%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6464(2018).</li>
<li>Thrane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li>
<li>Paukert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+controls+astroglial+responsiveness+to+local+circuit+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity.</a> Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).</li>
<li>Delekate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+P2Y1+receptor+signalling+mediates+astrocytic+hyperactivity+in+vivo+in+an+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 5, 5422(2014).</li>
</ol>

Burada, havayla kaldırılmış bir ev kafesinde uyanık, kafa ile kısıtlanmış farelerde kortikal astrositlerin ve nöronların in vivo görüntülenmesi için kronik kraniyal pencerelerin implantasyonu için bir protokol sunduk. GECI'leri ve nöronal sinaptik yapıları eksprese eden astrositlerin görüntülenmesi için kraniyal pencere uygulamasına özel örnekler verilmiştir. Multifoton mikroskobu kullanımı ile astrositik kalsiyum sinyal dinamikleri ve yapısal sinaptik dinamikler günler boyunca tekrar tekrar kaydedilebilir.
...

Farelerin korteksinde in vivo multifoton floresan mikroskobu yapabilme yeteneği, hücresel sinyalizasyon ve yapı 1,2,3,4,5,6,7,8,9, hastalık patolojisi 10,11 ve hücresel gelişim 12,13 çalışması için çok önemlidir. . Kronik kraniyal pencerelerin implantasyonu ile uzunlamasına görüntüleme mümkündür ve canlı hayvanlarda kortikal alanların günlerce, haftalarca veya aylarca tekrarlanan görüntülenmesine izin verir13,14. Multifoton mikroskopisi, gelişmiş derinlik sondalaması ve kullanılan kızılötesi lazerle ilişkili azaltılmış fotohasar nedeniyle in vivo, tekrarlanan görüntüleme için idealdir. Bu, çeşitli kortikal bölgelerdeki spesifik hücrelerin moleküler ve hücresel dinamiklerinin incelenmesine izin verir.
Multifoton mikroskopisi, farelerde nöronal ve glial hücrelerin in vivo görüntülenmesinde kullanılmıştır 15,16,17,18,19,20. Belirli hücre tiplerini ve ilgi alanlarını etiketlemek için çeşitli stratejiler uygulanabilir. Yaygın bir yaklaşım, genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin ekspresyonunu, Cre-Lox rekombinasyon sistemini kullanarak hücreye özgü bir şekilde yönlendirmektir. Bu, genetiği değiştirilmiş farelerle gerçekleştirilebilir, örneğin, tdDomates "floxed" fareyi (Ai14) ilgi çekici bir destekleyicinin altında Cre-rekombinaz eksprese eden bir fare ile geçmek21. Alternatif olarak, viral enjeksiyonlarla hücre ve bölgeye özgü etiketleme sağlanabilir. Burada, hücreye özgü bir promotor altında Cre rekombinazını kodlayan bir virüs ve ilgilenilen flokslanmış bir geni kodlayan bir virüs, tanımlanmış bir bölgeye enjekte edilir. Her iki viral vektörü de alan uygun hücre tipleri daha sonra istenen gen (ler) i ifade edecektir. Bu genler, hücresel morfoloji22'deki değişiklikleri görüntülemek için tdDomates gibi yapısal belirteçler veya kalsiyum dinamiklerini incelemek için GCaMP ve / veya RCaMP gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler)olabilir 23. Genetik rekombinasyon yöntemleri, bir veya daha fazla hücre tipini etiketlemek için ayrı ayrı veya kombinasyon halinde uygulanabilir. Transgenik fareler veya viral yapılar (sınırlı paketleme kapasitesine sahip) gerektirmeyen üçüncü bir yaklaşım, DNA yapılarının utero elektroporasyonudur24. Elektroporasyonun zamanlamasına bağlı olarak, farklı hücre tiplerihedeflenebilir 25,26,27.
Multifoton görüntüleme yapılırken, fareler uyanıkken veya anestezi altındayken görüntülenebilir. Uyanık farelerin görüntülenmesi, fareyi takılı bir kafa plakası28 ile sabitleyerek gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım, serbest yüzen, hava destekli strafor toplar29, serbest yüzen koşu bantları1 veya farelerin bağlı bir kafa plakası ile tutturulduğu ve açık bir odada hareket etmesine izin verilen hava kaldırılmış bir ev kafesi sistemi gibi yöntemler kullanılarak hayvanın nispeten serbest dolaşımına izin vererek daha az stresli hale getirilir. Bu görüntüleme koşullarının her biri için, önce fareleri görüntüleme kurulumuna alıştırmak gerekecektir. Bu yazıda, hava ile kaldırılmış bir ev kafesi sistemi kullanılarak alışkanlık ve görüntüleme prosedürü açıklanmaktadır.
Bu protokol, kortekste uzunlamasına in vivo görüntüleme için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonunu tanımlar. Burada, kalsiyum sinyal dinamiklerini izlemek için astrositlerde GCaMP6f'yi şartlı olarak eksprese eden fareleri kullanacağız. Ayrıca, bu makale tdTomato'yu nöronlar için bir etiket olarak kullanarak viral enjeksiyonlar için prosedürü açıklamaktadır. Bu, nöronal sinaptik yapıdaki değişikliklerin belirlenmesine ve / veya aynı astrositin tekrarlanan görüntülenmesini sağlayan yapısal bir belirteç olarak kullanılabilirliğe izin verir. Protokol boyunca, çoklu foton mikroskobundan elde edilen görüntülerin mümkün olan en iyi kalitesini sağlamak için önemli adımlar vurgulanacaktır.

<table><tbody><tr><td>15o Sivri Uçlu</td><td>Bıçak Surgistar</td><td>6500</td><td>Ameliyat Aletleri</td></tr><tr><td>19 G İğneler</td><td>BD</td><td>305186</td><td>Cerrahi Kaynağı</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdDomates</td><td>Addgene</td><td>28306-AAV1</td><td>Viral Vektör</td></tr><tr><td>AAV1-CaMKII-0-4-Cre</td><td>Addgene</td><td>105558-AAV1</td><td>Viral Vektör</td></tr><tr><td>Acteone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Alkol Hazırlama Pedleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>Covidien 5750</td><td>Cerrahi Tedarik</td></tr><tr><td>Beveler</td><td>Narishige</td><td></td><td>Ekipmanları</td></tr><tr><td>Borosilikat Cam</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>TW100F-4</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Tedarik Karbür Burslar</td><td>SS Beyaz Diş</td><td>14717</td><td>Cerrahi Aletler</td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl), 50 mg / mL</td><td>Zoetis Mylan Kurumsal, LLC.İlaç</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Basınçlı Hava</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022-523</td><td>Cerrahi Tedarik</td></tr><tr><td>Pamuk Ucu Aplikatörleri</td><td>Puritan</td><td>836-WC BAĞLAYICI</td><td>YOK Cerrahi Tedarik</td></tr><tr><td>Kapağı Camı, No. 1 kalınlık, 3 mm / 5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720, 64-0700</td><td>Cerrahi Tedarik</td></tr><tr><td>Diş Matkabı</td><td>Aseptico</td><td></td><td>Ekipmanları</td></tr><tr><td>Deksametazon, 4 mg / mL</td><td>Mylan Kurumsal, LLC.</td><td></td><td>İlaç</td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekipmanları Duralay Sıvı&nbsp; (diş çimentosu sıvısı)</td><td>Patterson Dental</td><td>602-8518</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Duralay Tozu&nbsp; (diş çimentosu tozu)</td><td>Patterson Dental</td><td>602-7932</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Enrofloksasin,% 2.27</td> <td>Bayer</td><td></td><td>İlaç</td></tr><tr><td>Göz Merhemi</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>Cerrahi Tedarik</td></tr><tr><td>Fiber Lite Yüksek Yoğunluklu Aydınlatıcı</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Ekipman</td><td></td></tr><tr><td>Forseps (Büyük)</td> <td>Dünya Hassas Aletler</td><td>14099</td><td>Cerrahi Aletler</td></tr><tr><td>Forseps ( Küçük)</td> <td>Dünya Hassas Aletler</td><td>501764</td><td>Cerrahi Aletler</td></tr><tr><td>GCaMP6f B6; 129S-GT (ROSA) 26Sortm95.1 (CAGGCaMP6f) Hze / J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Stok No: 024105</td><td>Fare hattı</td></tr><tr><td>Germinator</td><td>Fisher Bilimsel Ekipman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GLAST-CreER Tg (Slc1a3-cre / ERT) 1Nat/J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Stok No: 012586</td><td>Mouse Line</td></tr><tr><td>Başlık</td><td>Neurotar</td><td>Model 1, Model 3</td><td>Cerrahi Tedarik</td></tr><tr><td>Hemostatik forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>501705</td><td>Cerrahi Aletler</td></tr><tr><td>15o Sivri Bıçak Dünyası için</td><td>Tutucu</td><td>501247</td><td>Cerrahi Aletler</td></tr><tr><td>Neşter Bıçakları için Tutucu</td> Dünya <td>Hassas Aletler</td><td>500236</td><td>Cerrahi Aletler</td></tr><tr><td>İyot Hazırlama Pedleri</td><td>Avantor</td><td>15648-926</td><td>Cerrahi Tedarik</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Piramal</td><td></td><td>Cerrahi Kaynağı</td></tr><tr><td>İndüksiyon Kutulu İzofluran masa üstü sistemi</td><td>Harvard Aparat</td><td></td><td>Ekipmanları</td></tr><tr><td>İzofluran Buharlaştırıcı</td><td>SurgiVet</td><td></td><td>Ekipmanları</td></tr><tr><td>Krazy Tutkal Ofis</td><td>Deposu</td><td>KG517</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>40140</td><td>hızlı kürlenen anında yapıştırıcı</td></tr><tr><td>Loctite 454</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9194415</td><td>siyanoakrilat yapıştırıcı jel</td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aletleri Ekipmanları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multifoton Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekipmanları Azot</td><td>Matheson</td><td>NI M200</td><td>Gaz</td></tr><tr><td>Oksijen</td><td>Matheson</td><td>OX M250</td><td>Gaz</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker</td><td></td><td>hücre içi mikroenjeksiyon dağıtım sistemi</td></tr><tr><td>Pipet Uçları</td><td>Rainin</td><td>17014340</td><td>Cerrahi Tedarik</td></tr><tr><td>Kemirgen Saç Düzeltici</td><td>Wahl</td><td></td><td>Ekipmanları</td></tr><tr><td>Salin (%0.9 Sodyum Klorür)</td><td>Med Vet International</td><td>RX0.9NACL-30BAC</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Tedarik Neşter Bıçakları, Boyut 11</td><td>Integra</td><td>4-111</td><td>Ameliyat Aletleri</td></tr><tr><td>Makas</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>503667</td><td>Cerrahi Aletler</td></tr><tr><td>Stereotaksik Alet</td><td>Çalma</td><td></td><td>Ekipmanları</td></tr><tr><td>Sugi Sünger Şeritler (sünger şeritler)</td><td>Kettenbach Dental</td><td>31002</td><td>Cerrahi Malzemeleri</td></tr><tr><td>SURGIFOAM (jel köpük)</td><td>Ethicon</td><td>1972</td><td>26</td></tr><tr><td>G İğneli Cerrahi Malzeme Şırıngası</td><td>BD</td><td>309625</td><td>Cerrahi Kaynağı</td></tr><tr><td>Tamoksifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Ti: Safir Lazer</td><td>Tutarlı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekipman Transfer Pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Cerrahi</td></tr><tr><td>Tedarik Su</td><td>Battaniyesi Fisher Bilimsel Ekipman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epinefrin ile Ksilokain MPF (1: 200.000), 10 mg / mL</td><td>Fresenius Kabi ABD</td><td></td><td>İlaç</td></tr></tbody></table>

uyanık farelerde tekrarlanan in vivo görüntüleme için kraniyal pencerenin İmplantasyonu

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Davranış gösteren hayvanlarda nöronların ve gliaların hücresel fizyolojisini tam olarak anlamak için, morfolojilerini görselleştirmek ve davranışta bulunan farelerde in vivo aktivitelerini kaydetmek gerekir. Bu yazıda, uyanık, baş kısıtlı farelerde beyin hücrelerinin uzunlamasına görüntülenmesine izin vermek için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Genetik stratejiler ve viral enjeksiyonlarla kombinasyon halinde, spesifik hücreleri ve ilgilenilen bölgeleri yapısal veya fizyolojik belirteçlerle etiketlemek mümkündür. Bu protokol, her iki hücrenin bir kraniyal pencereden eşzamanlı görüntülenmesi için korteksteki GCaMP6 eksprese eden astrositlerin yakınındaki nöronları etiketlemek için viral enjeksiyonların nasıl birleştirileceğini göstermektedir. Aynı hücrelerin çoklu foton görüntülemesi, uyanık, davranan hayvanlarda günlerce, haftalarca veya aylarca gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım, araştırmacılara hücresel dinamikleri gerçek zamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem sunar ve sinirbilimdeki bir dizi soruyu cevaplamak için uygulanabilir.

Kraniyal pencerenin kalitesi, nöronal yapıların ne kadar net göründüğü ile değerlendirilebilir. İyi bir pencerede, dendritik dikenler açıkça görülebilir (Şekil 1). Saklanan yapısal ve konumsal verilerle, aynı hayvan aynı hücreleri incelemek için günlerce, haftalarca veya aylarca tekrar tekrar görüntülenebilir (Şekil 1). Şekil 1'deki görüntüler primer motor korteksin ön ayak bölgesinden (5 mm'lik bir pencerede) elde edilmiştir. Yapıs...

Burada, uyanık, baş kısıtlı farelerde beyin hücrelerinin uzunlamasına görüntülenmesi için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonu için bir protokol sunulmaktadır.

Uyanık Farelerde Tekrarlanan In Vivo Görüntüleme için Kraniyal Pencerenin İmplantasyonu

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Protokol, viral enjeksiyonların nasıl gerçekleştirileceğini ve uyanık, kafa kısıtlamalı farelerde beyin hücrelerinin görüntülenmesi için bir kafatası penceresinin nasıl implante edileceğini açıklar. Bu yöntemin avantajı, nöronların ve astrositlerin yapısının ve aktivitesinin birden fazla seansta tekrar tekrar görüntülenebilmesidir. Bu yaklaşım, nörogelişimsel veya nörodejeneratif bozukluk modellerinde sinir hücrelerinin nasıl değiştirildiğini veya deneyime bağlı plastisitenin bozulup bozulmadığını belirlemek için kullanılabilir.Burun kelepçesini ve kulak çubuklarını kullanarak anestezi uygulanmış bir fareyi stereotaksik bir çerçeveye sabitleyerek başlayın. Steril cerrahi aletler kullanarak, cildi ön dikişlerden bregmanın önünden lambda'ya posterioruna kadar kesin ve çıkarın. Steril boyutta 11 karbon çelik cerrahi bıçak kullanarak, kafatasındaki tüm bağ dokusunu hafifçe kazıyın.Bir diş matkabı yardımıyla, kemiğin incelmesini bile kolaylaştırmak için kafatası kemiğini açıklığın ana hatları boyunca konsantrik daireler halinde kademeli olarak delin. Her eşmerkezli geçişten sonra, delinen alana bir damla veya iki salin ekleyin ve delme işlemine devam etmeden önce salinin en az 10 saniye oturmasına izin verin. Kafatasının yeterince inceltilmiş ve hareket ettiğini kontrol etmek için kafatası kemiğinin orta bölgesini ince forseps ile hafifçe itin.Sondajın gerçekleştiği altta yatan vaskülatürün sağlam olduğundan ve kemiğin çatlamadığından emin olun. İnceltilmiş kemiğe minyatür 15 derecelik sivri uçlu bir bıçağı dikkatlice yerleştirin ve meydana gelebilecek kanamaları durdurmak için saline batırılmış jel köpüğü kesin ve kullanın. Forseps kullanarak, dura materine zarar vermemeye özen göstererek kemiği dikkatlice kaldırın ve çıkarın.Enjeksiyon için, steril eğimli bir cam pipeti 20 mikrometrelik bir uçla virüs karışımıyla doldurun. Daha sonra pipeti beynin yüzeyine dokunmak için indirin ve katman 2/3 enjeksiyonları için 200 ila 300 mikrometre daha alçaltmaya devam edin. Hücre içi mikroenjeksiyon dağıtım sistemi kullanarak, basınç sisteme iki dakika boyunca 12 ila 15 kez enjekte edilir.Kraniyal pencere implantasyonu için, kapak camını kafatasındaki açıklığın üzerine yerleştirin. Camın açıklığın üzerinde aynı hizada olduğundan emin olmak için forseps kullanın. Cam pencerenin kenarlarını kafatasına kapatmak için, cam yüzeyin çevresine siyanoakrilat yapışkan jel uygulayın.Yapışkan jelin üzerine bir yapıştırıcı tabakası uygulayın. Sonra bir kat diş çimento sıvısı ekleyin. Diş çimentosu sertleştiğinde, helikopter tipi kafa plakasının orta açıklığının etrafına ince bir yapıştırıcı tabakası uygulayın ve uygun boyuttaki helikopter tipi kafa plakasını kapak camının üzerine yerleştirin.Tutkalın kurumasını bekleyin. Diş çimento tozunu 1,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne 0,1 mililitrelik işarete kadar ekleyin. Yedi ila sekiz damla hızlı sertleşen anında yapıştırıcıyı tozun içine karıştırın ve elde edilen karışımı, daha büyük bir açıklık oluşturmak için kesilmiş 19 gauge iğneli bir mililitrelik bir şırıngaya çekin.Toz karışımını, her iki taraftan da sızana kadar helikopter çubuğunun yan deliklerinden enjekte edin. Kafa plakasını kafatasına sabitlemek için diş çimento yapıştırıcı karışımını maruz kalan kafatasının geri kalanına uygulayın. Fareyi beze sarın ve kafa plakasından havayla kaldırılan ev kafesinin kafa sabitleme koluna sabitleyin, ardından ev kafesini ışığa maruz bırakın.15 dakikalık bir alışkanlık süresinden sonra, fareyi ev kafesinden çıkarın. Mikroskobun geniş alan modunu kullanarak, kolayca tanımlanabilen vaskülatür iki ila üç pozisyonunu seçin. Kan damarlarının görüntülerini kaydedin ve motor kontrolöründe görünen x ve y koordinatlarını kaydedin.Nöronların sinaptik yapılarını ve astrositlerdeki GCaMP6f aktivitesini görüntüleyin. Temsili analizde, kranial pencerenin kalitesi, dendritlerin ve GCaMP6f eksprese eden astrositlerin günler boyunca tekrarlanan görüntülenmesi ile değerlendirildi. İyi bir pencerede, nöronal yapılar açıkça görülebilen dendritik dikenlerle net görünüyordu.Görüntülemenin ikinci gününde iki yeni diken ortaya çıktı. Sadece bir omurga devam etti ve beşinci günde görülebiliyordu. GCaMP6f'yi farklı zaman noktalarında eksprese eden astrositlerde kalsiyum aktivitesi incelenmiştir.Bir lokomotif nöbeti sırasında tüm hücreyi kapsayan küresel bir olaya tanık olundu. Bu protokolün iki kritik adımı, kemiğin çıkarılmasından önce kemiğin yeterince inceltilmesi ve kapak camının açıklığın üzerine uygun şekilde yerleştirilmesidir. Görüntüleme, nöronal ve astrosit yapısının ve fonksiyonunun öğrenme yoluyla nasıl modüle edildiğini belirlemek için görüntüleme sırasında veya yeni bir motor beceri öğrenmek gibi davranış sonrası davranışsal analiz ile birleştirilebilir.

implantation-cranial-window-for-repeated-vivo-imaging-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Cilalı ve takviyeli ince kafatası (portlar) kraniyal pencere ve glioblastoma (GBM) hücre enjeksiyonu birleştirerek, glioma inisiyasyon ve uzunlamasına bir canlı fare beynindeki enjekte GBM hücreleri büyüme gözlemleyebilirsiniz.

Görüntüleme Glioma Başlatma<em&gt; In Vivo</em&gt; Bir Parlak ve Takviyeli İnce kafatası Kranial Pencere arkası

Bu video, beynin farklı bölgelerine stabil optik erişim için bir fare modeline kraniyal pencere implante etmek için cerrahi bir prosedür sunmaktadır.

Fare Modelinde Kranial Görüntüleme Penceresinin İmplantasyonu: Murin Beyninin Bölgelerine Stabil Optik Erişim için Cam Tabanlı Lamel İmplante Etmek İçin Cerrahi Bir Prosedür

Bu video, transgenik farelerde optik bir pencereden beynin nöral aktivite kaydını göstermektedir. Fareler, sinirsel aktivitelerin tespit edilmesini sağlayan bir floresan proteini eksprese eder. Kafatasının küçük bir kısmı, optik bir pencere takmak için dikkatlice çıkarılır ve daha sonra görüntülemeden önce ışığı engellemek için kafatası siyah çimento ile kaplanır.

Görüntü Sinirsel Aktivitelerine Transgenik Farelerin Beynine Optik Pencerelerin Yerleştirilmesi

Kaynak: Pietruczyk, E. A., et al. Farede laminektomi ve omurilik penceresi implantasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, in vivo görüntüleme için anestezi uygulanmış bir fareye bir omurilik penceresinin implantasyonunu göstermektedir. Protokol, bir borosilikat kapak camı ve 3D baskılı bir arka plaka kullanarak açıkta kalan omuriliği stabilize eder. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri dinamiklerini ve nörovasküler etkileşimleri incelemek için yüksek çözünürlüklü iki foton mikroskobunu mümkün kılar.

In Vivo Görüntüleme için Bir Farede Omurilik Penceresi İmplantasyonu

Bu protokol, nöro-glio-vasküler yapıların uzunlamasına görüntülemesi, hem sağlıklı hem de hastalıklı koşullarda fonksiyon ve fonksiyon için kullanılabilecek kronik bir kafatası pencere implantasyon tekniğini açıklamaktadır. Genellikle tercih edilirken bazı kritik sınırlamalara sahip olan transkraniyal görüntüleme yaklaşımına tamamlayıcı bir alternatif olarak hizmet vermektedir.

Farelerde Nöro-İmmün Dinamiğin Vivo Görüntülemesinde Tekrarlayan Performans için Hassas Beyin Haritalaması

Bu protokol, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) yeni bir meme görüntüleme penceresini tanımlar. R.MIW'nin implantasyonundan sonra intravital mikroskopi, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin hücresel çözünürlükle uzunlamasına ve çok günlük görüntülenmesini sağlar.

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Mevcut protokol, gıda sargısı, şeffaf silikon ve kapak camı kullanarak büyük (6 x 3 mm2) bir kafatası penceresi yapmayı açıklamaktadır. Bu kafatası penceresi, aynı farede in vivo geniş alan ve iki fotonlu kalsiyum görüntüleme deneylerine izin verir.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Bu çalışma, farelere tekrarlayan bir travmatik beyin hasarının verilmesini ve iki foton mikroskobu kullanılarak nöron eksprese edilen bir EGFP'nin daha sonraki intravital görüntülemesi için bir kraniyal pencerenin eşzamanlı implantasyonunu göstermektedir.

Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kraniyal Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Foton Mikroskobu Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi

Bu protokol, floresan polistiren mikrosferler kullanılarak in vivo iki foton mikroskopi görüntüleme için optimize edilmiş kronik kraniyal pencere ve mikrovasküler embolizm fare fare modeli için adım adım yaklaşımın ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Floresan Polistiren Mikrosferleri Kullanarak In Vivo İki Foton Mikroskopi İçin Mikrovasküler Embolizm Fare Modeli

Bu protokol, farelerde büyük, yeniden kapatılabilir, dura koruyan bir kranial pencere oluşturmak için iki aşamalı cerrahi yöntemi tanımlar. Bu teknik, Varsayılan Mod Ağı gibi dağınık, derin beyin ağlarından birkaç hafta boyunca kronik, çok modlu elektrofizyolojik kayıtlar yapılmasını sağlar.

Büyük, yeniden kapatılabilir kranial pencere için cerrahi protokol, fare varsayılan modu ağının uzunlaması, çok modlu elektrofizyoloji kayıtlarını mümkün kılan

Öğrenin, uyanık farelerde kronik kraniyal pencere implantasyonu ile nöron ve astrositlerin tekrarlanan görüntülenmesini. Bu yöntem, nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozukluk modellerinde beyin hücre dinamiklerinin uzunlamasına incelenmesini sağlar.

Uyanık Farelerde Tekrarlanan In Vivo Görüntüleme için Kraniyal Pencerenin İmplantasyonu

Daha fazla video keşfet