RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması
24 Haziran 2021
Alternatif ekleme (AS) ve alternatif poliadenilasyon (APA), transkript izoformlarının ve ürünlerinin çeşitliliğini genişletir. Burada, deneysel koşullar arasında değişen AS ve APA'yı tespit etmek ve görselleştirmek için toplu RNA-seq ve 3' uç dizileme testlerini analiz etmek için biyoinformatik protokolleri açıklıyoruz.
Bu protokol, diferansiyel ekleme bölgelerini, diferansiyel olarak eksprese edilen ekzonları ve poli (A) bölgelerini tanımlamak için adım adım bir iş akışı sağlayarak alternatif ekleme ve poliadenilasyon tarafından üretilen gen izoformlarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Bu protokolün temel avantajı, alternatif eklemeyi incelemek için hem ekzon tabanlı hem de olay tabanlı yöntemleri değerlendirmesidir. Ayrıca alternatif poliadenilasyonu incelemek için ekzon bazlı yöntem uygular.
AS ve AP analizi için kodları ve notları içeren R Markdown dosyaları sağlanmıştır. R Markdown dosyasındaki adımları izlemeniz ve her adım için nota dikkatlice ulaşmanız önerilir. Limma'dan diffSplice kullanarak diferansiyel eklemeyi tanımlamak için R not defteri dosyasını izleyin.
Giriş dosyalarını metin makalesinde açıklandığı şekilde hazırlayın. Daha fazla ilerlemeden önce giriş dosyalarını hazırlamak için makaledeki bir ila üç arasındaki adımların sırayla takip edildiğinden emin olun. Gerekli kütüphaneleri yükleyerek başlayın.
Spesifik olmayan filtreleme gerçekleştirmek için, önce daha önce elde edilen okuma sayılarının matrisini ayıklayın ve satırların genleri ve sütunların örnekleri temsil ettiği edgeR paketinden DGEList işlevini kullanarak özelliklerin bir listesini oluşturun. Ardından, edgeR paketindeki BGBM işlevini kullanarak verileri ham ölçekten milyon başına sayıma dönüştürün ve ayarlanabilir bir eşiğin üzerinde sayımlara sahip ekzonları saklayın. Bu veri kümesi altı örnek içerir.
Bu nedenle, BGBM birden büyük ve altıdan en az üç örnek olarak ayarlanır. M değerlerinin Kırpılmış Ortalama değerini kullanarak edgeR paketinden calcNormFactors işleviyle numuneler arasındaki sayımları normalleştirin. Bu işlev, kitaplık boyutlarını ayarlamak için ölçeklendirme faktörlerini hesaplar.
Her numunenin deneysel koşullarını tanımlamak üzere tasarım matrisini oluşturmak için önceden oluşturulmuş örnek tabloyu kullanın. Varyansı tahmin etmek üzere RNA dizileme verilerini işlemek için limma paketinin voom işlevini çalıştırın. Bu işlev, Poisson sayım gürültüsünü düzeltmek için hassas ağırlıklar üretecek ve ekzon seviyesi sayımlarını milyonda iki sayım veya logCPM günlüğe kaydedecek şekilde dönüştürecektir.
Doğrusal modelleri her ekzonun ifade verilerine sığdırmak için lmfit işlevini çalıştırın. Ardından, diferansiyel ekzon ifadesini algılamak üzere takılan modelin ampirik tabanlı istatistiklerini hesaplamak için eBayes işlevini çalıştırın. İlgilenilen deneysel karşılaştırmalar için bir kontrast matrisi tanımlayın.
Kontrastları kullanın. Her bir karşılaştırma çifti için katsayılar ve standart hatalar elde etmek için fit işlevi. Vahşi tip ve nakavt arasındaki genlerin ekzon kullanımındaki farklılıkları test etmek için takılı modelde diffSplice çalıştırın.
T'ye eşit bir testin AS ekzonların sıralamasını verdiği ve simelere eşit testin genlerin bir sıralamasını verdiği topSplice işlevini kullanarak en üst sıradaki sonuçları keşfedin. Sonuçları çizmek için plotSplice işlevini çalıştırın. İlgilenilen geni gen kimliği argümanına koyarken, kırmızı noktalar farklı şekilde ifade edilen ekzonları gösterir.
Farklı şekilde ifade edilen ekzonları sergilemek için EnhancedVolcano biyoiletken paketini kullanarak bir volkan grafiği oluşturun. rMATS'ı kullanmak için, rMATS sürüm 4.1.1'in en son sürümünün çalışma dizininde conda veya GitHub kullanılarak yüklendiğinden emin olun. Eşlemeden sonra elde edilen bam dosyalarını içeren klasöre gidin.
Metin dosyalarını, bam dosyalarının adını ve virgülle ayrılmış yollarını kopyalamanın iki koşulu için rMATS'ın gerektirdiği şekilde hazırlayın. Ramas çalıştırın. py, bam dosyalarının yolunu ve ek açıklamayı açıklayan iki oluşturulan giriş metni dosyasını kullanarak.
gtf dosyası daha önce elde edilmiştir. Bu, rmats_out her ekleme olayı için ayrı ayrı P değerleri ve ekleme düzeyleri dahil olmak üzere istatistikleri açıklayan metin dosyalarını içeren bir çıktı klasörü oluşturur. rMATS sonuçlarını keşfetmek için biyoiletken paket maserini kullanın.
Kavşak ve ekzon sayma metin dosyalarını JCEC uzantısıyla maser nesnesine yükleyin ve sonucu kapsama alanına göre filtrelemek için ekleme olayı başına en az beş ortalama okuma ekleyin. rMATS sonuçlarını görselleştirmek için, önce maser paketinden topEvents işlevini çalıştırın, önemli ekleme olaylarını %10'luk yanlış bulma oranında ve PSI veya PSI içine eklenmiş yüzde olarak en az %10'luk bir değişiklikle seçin. İlgilenilen bireysel genler için gen olaylarını kontrol edin ve bu genin her bir ekleme olayı için PSI değerlerini çizin.
Olay türünü belirterek bir volkan grafiği oluşturun. rmats2sashimiplot paketini kullanarak sashimi grafikleri oluşturmak için rMATS ile elde edilen ekleme olayları sonuçlarını metin dosyaları biçiminde kullanın. Sashimi komplosu, Wnk1 geninde atlanan bir ekzon olayını göstermektedir.
Her satır bir RNA-seq örneğini, vahşi tipte üç kopyayı ve Mbnl1 nakavtını temsil eder. Yükseklik, RPKM cinsinden okuma kapsamını gösterir ve bağlantı yayları, ekzonlar boyunca kavşak okumalarını gösterir. Alt kısımda açıklamalı gen modeli alternatif izoformları gösterilmektedir.
DiffSplice ve DEXSeq kullanılarak elde edilen volkan arazilerinin sol üst veya sağ kadranlarında bulunan genlerde önemli bir kıvrım değişimi ve gerçek farklılıkların güçlü istatistiksel kanıtları gözlemlenebilir. Bir kaset ekzonunun, Wnk1 geni için farklı koşullar arasında değiştiği bulundu. Diferansiyel ekzon kullanım grafiği, Wnk1.6.45 yakınlarındaki beş ekzon bölgesinde diferansiyel ekleme kanıtı gösterdi ve pembe renkle vurgulanan ekzonların vahşi tipe kıyasla Mbnl1 nakavt örneklerinde eklenmesi muhtemeldi.
Alternatif olarak eklenen genlerin volkan grafiği, vahşi tipten dışlanan genler ile vahşi tipe dahil edilenler arasında ayrım yapılmasına yardımcı oldu. SE, A5SS, A3SS, MXE ve RI ekleme olaylarının türleri, bu olayların en önemli genlerinin sashimi grafikleri kullanılarak görselleştirildi. Genlerin üç ana çevrilmemiş bölgesindeki diferansiyel APA aktivitesi, volkan grafikleri kullanılarak gözlendi.
Farklı işlem hatlarından elde edilen önemli ölçüde diferansiyel PA sahası kullanım sonuçları, olay grafiği kullanılarak görselleştirildi. Çift nakavtlarda PA bölgesi kullanımının önemli bir distal ila proksimal kayması hem FOSL1 hem de Papola genlerinde gözlenebilir. Genom çapında bilinen PA bölünme bölgelerine demirlenmiş yan bölgelerdeki ortalama kapsama alanı, tanısal bir grafik kullanılarak belirlendi.
Transspesifik bilgiler ve çoklu örtüşmeye izin verme gibi parametrelerin sayım metrikleri oluşturulurken doğru kullanıldığından emin olun. Doğrusal modelin takılması ve kontrast çiftlerinin oluşturulması, doğru karşılaştırma için önemlidir. rMATS için, komutu çalıştırmadan önce tüm parametrelerin verilerinize göre doğru ayarlandığından emin olun.
Diferansiyel ekleme aktivitesinden elde edilen genler, gen seti zenginleştirme analizi yapmak için kullanılabilir. MISO adı verilen başka bir araç, daha fazla olay tabanlı analiz için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, gen ekspresyon düzenlemesinde alternatif splicing (AS) ve alternatif poliadenilasyon (APA) karmaşıklığını ele almaktadır. RNA sekanslama verilerini analiz etmek için biyoinformatik protokoller kullanarak araştırma, farklı deneysel koşullarda alternatif splicing ve poliadenilasyonu tespit etmek ve görselleştirmek için hem ekson tabanlı hem de olay tabanlı yöntemlerin avantajlarını vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Alternatif splicing
- Alternatif poliadenilasyon
- Biyoinformatik
Arka Plan
- Transkript izoform çeşitliliğindeki artış
- Gen ekspresyonu üzerindeki etki
- RNA sekanslamada teknolojik ilerlemeler
Kullanılan Yöntemler
- RNA-seq analizi için biyoinformatik protokoller
- Ekson tabanlı ve olay tabanlı tespit yöntemleri
- Splicing bölgeleri ve poliadenilasyon olaylarının görselleştirilmesi
Ana Sonuçlar
- Diferansiyel splicing bölgeleri ve poli(A) bölge kullanımının belirlenmesi
- Çeşitli deneysel koşullarda alternatif splicing ve poliadenilasyon kanıtı
- Sonuçların çizimler ve biyoinformatik çıktılar aracılığıyla başarılı bir şekilde görselleştirilmesi
Sonuçlar
- Bulgular, farklı koşullar altında AS ve APA'da önemli değişkenlik gösterdiğini ortaya koymaktadır.
- Bu çalışma, transkript çeşitliliği ve bunun biyoloji araştırmaları üzerindeki etkileri konusundaki anlayışımıza katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Alternative splicing and polyadenylation analysis enables biopharma R&D teams to resolve isoform-specific regulatory mechanisms that are obscured at the gene-expression level. This mechanistic de-risking supports target validation by clarifying functional consequences of genetic perturbations and improving predictive confidence in lead identification. Integrating exon- and event-based RNA-seq workflows enhances assay readiness for downstream screening and translational biomarker development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by identifying differential exon usage and polyadenylation site shifts that reflect isoform-specific gene regulation.
- Operational Value: Apply exon-based methods to study alternative polyadenylation, enabling unified analysis of splicing and 3' end processing from a single RNA-seq dataset.
- Predictive Value: Detect cassette exon variations and distal-to-proximal polyadenylation shifts that inform functional target de-risking and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generate quantitative exon-level and splicing-event readouts (e.g., percent spliced in, inclusion levels) suitable for high-resolution compound screening.
- Operational Value: Normalize and filter count data using edgeR and limma workflows to ensure reproducibility across replicates and conditions.
- Assay Readiness: Produce visualization-ready outputs such as volcano plots, sashimi plots, and event plots for cross-functional review of splicing and polyadenylation dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Link differential splicing and polyadenylation events to disease-relevant genes (e.g., Wnk1, FOSL1) observed in knockout models, supporting mechanistic continuity.
- Operational Value: Use rMATS and maser packages to filter significant splicing events by false discovery rate and percent spliced-in change, enabling robust biomarker candidate selection.
- Translational Value: Visualize isoform-specific expression changes via sashimi plots to support preclinical validation of target engagement and mechanism of action.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing isoform-resolution data that informs target validation, assay development, and mechanistic follow-up in lead optimization.
- Discovery Biology: Test hypotheses about isoform regulation by comparing exon usage and polyadenylation site distribution across genetic or pharmacological conditions.
- Screening: Generate standardized, quantitative exon and splicing event metrics that support reliable compound effect assessment in phenotypic or target-based assays.
- Analytics: Derive empirical statistics, p-values, and effect sizes from linear modeling (voom, lmfit, eBayes) and event-based tools (rMATS, diffSplice) to compare conditions objectively.
- Translational Research: Connect splicing and polyadenylation changes to gene-level phenotypes in preclinical models, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Deploy the R Markdown-based protocol as a reusable bioinformatics capability across projects studying genetic models, drug treatments, or disease tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduce mechanistic ambiguity by resolving isoform-specific regulatory layers missed in conventional gene-level differential expression analysis.
- Operational Value: Ensure reproducibility through standardized normalization (CPM, calcNormFactors), filtering thresholds, and validated Bioconductor packages (limma, edgeR, rMATS, maser).
- Strategic Value: Improve go/no-go decisions by providing early evidence of isoform-level target modulation, reducing late-stage biological attrition risk.
- Portfolio Impact: Enable risk-adjusted prioritization of targets based on concordant splicing and polyadenylation evidence across orthogonal methods (exon-based and event-based).
Implementation Considerations
- Requires bioinformatics expertise in RNA-seq analysis, linear modeling, and splicing event interpretation using R/Bioconductor.
- Dependent on aligned BAM files, gene annotation (GTF), and count matrices generated from standard RNA-seq preprocessing.
- Necessitates cross-team standardization of filtering criteria (e.g., CPM >1 in ≥3 samples) and statistical thresholds (FDR <0.1, ΔPSI ≥10%) for reproducible results.
- Involves adaptation of parameters (e.g., overlap settings, transpecific information) when applying count metrics to alternative splicing and polyadenylation pipelines.
- Includes practical limitations such as the need for sufficient sequencing depth to detect low-abundance isoforms and the importance of validating computational predictions with orthogonal methods (e.g., PCR, long-read sequencing).
