Name: RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Keşfedin RNA-seq verilerinde alternatif eklemeyi ve poliadenilasyonu biyoinformatik protokollerle analiz etme yöntemlerini. Bu çalışma, transkript çeşitliliğini ve gen düzenlemesini anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) Future Fellowship (FT16010043) ve ANU Futures Scheme tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li>
<li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li>
<li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li>
<li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li>
<li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PolyASite+2.0%3A+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3%27+end+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li>
<li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364(2014).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13(2016).</li>
<li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2014).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rMATS%3A+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li>
<li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li>
<li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li>
<li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li>
<li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+read+archive%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, suppl_1 19-21 (2010).</li>
<li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTange%2C+O+%22GNU+parallel-the+command-line+power+tool%22">GNU parallel-the command-line power tool</a>. 36, 42-47 (2011).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/2010">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/2010</a> (2011).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet+journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), Oxford, England. 15-21 (2013).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25(2010).</li>
<li>Veiga, D. F. T. maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVeiga%2C+DFT+%22R+package+version+1.4.0%22">R package version 1.4.0</a>. , (2019).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25(2009).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Ramírez, F., Dündar, F., Diehl, S., Grüning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools%3A+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li>
<li>Merino, G. A., Conesa, A., Fernández, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li>
<li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13(2016).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li>
<li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSEM%3A+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).</li>
<li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu çalışmada, toplu RNA-Seq ve 3' uç dizileme verilerinde AS ve APA'yı saptamak için ekzon tabanlı ve olay tabanlı yaklaşımlar değerlendirildi. Ekzon tabanlı AS yaklaşımları, hem diferansiyel olarak eksprese edilen ekzonların bir listesini hem de genel gen seviyesi diferansiyel ekleme aktivitesinin istatistiksel önemine göre sıralanmış bir gen seviyesi sıralaması üretir (Tablo 1-2, 4-5). Diferansiyel kullanım, bir ekzonun diferansiyel log kıvrım değişimini aynı gen içindeki diğer ekzonların ortalama log ...

RNA-seq, yıllar boyunca tipik olarak diferansiyel gen ekspresyonunu ve gen keşfini tahmin etmek için yaygın olarak kullanılmıştır1. Ek olarak, farklı izoformları ifade eden gen nedeniyle değişen ekzon seviyesi kullanımını tahmin etmek için de kullanılabilir, böylece transkripsiyon sonrası seviyede gen düzenlemesinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur. Ökaryotik genlerin çoğunluğu, mRNA ekspresyonunun çeşitliliğini arttırmak için alternatif ekleme (AS) ile farklı izoformlar üretir. AS olayları farklı kalıplara ayrılabilir: bir ("kaset") ekzonun yan tarafındaki intronlarla birlikte transkriptten tamamen çıkarıldığı tam ekzonların (SE) atlanması; ekzonun her iki ucunda iki veya daha fazla ekleme bölgesi bulunduğunda alternatif (donör) 5' ekleme yeri seçimi (A5SS) ve alternatif 3' (alıcı) ekleme yeri seçimi (A3SS); Bir intron olgun mRNA transkriptinde tutulduğunda intronların (RI) tutulması ve mevcut iki ekzondan sadece birininbir seferde tutulabildiği ekzon kullanımının (MXE) karşılıklı dışlanması 2,3. Alternatif poliadenilasyon (APA), tek bir transkript4'ten çoklu mRNA izoformları üretmek için alternatif poli (A) bölgeleri kullanarak gen ekspresyonunun düzenlenmesinde de önemli bir rol oynar. Çoğu poliadenilasyon bölgesi (pAs), 3' çevrilmemiş bölgede (3' UTR'ler) bulunur ve çeşitli 3' UTR uzunluklarına sahip mRNA izoformları üretir. 3' UTR, düzenleyici unsurları tanımak için merkezi merkez olduğundan, farklı 3' UTR uzunlukları mRNA lokalizasyonunu, kararlılığını ve translasyonunu etkileyebilir5. Protokol6'nın ayrıntılarında farklılık gösteren APA'yı tespit etmek için optimize edilmiş bir 3' uç sıralama tahlilleri sınıfı vardır. Burada açıklanan boru hattı PolyA-seq için tasarlanmıştır, ancak açıklandığı gibi diğer protokoller için uyarlanabilir.
Bu çalışmada, ekzon bazlı (DEXSeq9, diffSplice10) ve olay tabanlı (Multivariate Analysis of Transcript Splicing (rMATS)11) olmak üzere iki geniş kategoriye ayrılabilen diferansiyel ekzon analiz yöntemleri 7,8 (Şekil 1) boru hattını sunuyoruz. Ekzon tabanlı yöntemler, bireysel ekzonların koşulları arasındaki kıvrım değişimini, farklı şekilde ifade edilen ekzon kullanımını çağırmak için genel gen kıvrım değişiminin bir ölçüsüyle karşılaştırır ve bundan AS aktivitesinin gen düzeyinde bir ölçüsünü hesaplar. Olay tabanlı yöntemler, ekzon atlama veya intronların tutulması gibi belirli ekleme olaylarını algılamak ve sınıflandırmak için ekzon intronunu kapsayan bağlantı okumalarını kullanır ve çıktı3'teki bu AS türlerini ayırt eder. Bu nedenle, bu yöntemler AS12,13'ün tam bir analizi için tamamlayıcı görüşler sağlar. Diferansiyel ekleme analizi için en yaygın kullanılan paketler arasında yer aldıkları için çalışma için DEXSeq (DESeq214 DGE paketine dayanarak) ve diffSplice (Limma10 DGE paketine dayanarak) seçtik. rMATS, olay tabanlı analiz için popüler bir yöntem olarak seçildi. Bir başka popüler olay tabanlı yöntem MISO (İzoform Karışımı)1'dir. APA için ekzon tabanlı yaklaşımı uyarlıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> Şekil 1. Analiz işlem hattı. Analizde kullanılan adımların akış şeması. Adımlar şunları içerir: verileri elde etmek, kalite kontrolleri yapmak ve okuma hizalaması, ardından bilinen ekzonlar, intronlar ve pA siteleri için ek açıklamalar kullanarak okumaları saymak, düşük sayıları kaldırmak için filtreleme ve normalleştirme. PolyA-seq verileri diffSplice/DEXSeq yöntemleri kullanılarak alternatif pA bölgeleri için, bulk RNA-Seq diffSplice/DEXseq yöntemleri ile ekzon düzeyinde alternatif ekleme için ve AS olayları rMATS ile analiz edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu araştırmada kullanılan RNA-seq verileri, Gen İfade Omnibus'undan (GEO) (GSE138691)15 elde edilmiştir. Bu çalışmadan elde edilen fare RNA-seq verilerini iki koşul grubuyla kullandık: vahşi tip (WT) ve her biri üç kopya ile Kas körü benzeri tip 1 nakavt (Mbnl1 KO). Diferansiyel poliadenilasyon alanı kullanım analizini göstermek için, fare embriyo fibroblastları (MEF'ler) PoliA-seq verilerini elde ettik (GEO Katılımı GSE60487)16. Verilerin dört koşul grubu vardır: Wild-type (WT), Kas körü benzeri tip1/tip 2 çift nakavt (Mbnl1/2 DKO), Mbnl3 knockdown (KD) ile Mbnl 1/2 DKO ve Mbnl3 kontrollü Mbnl1/2 DKO (Ctrl). Her koşul grubu iki çoğaltmadan oluşur.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>GEO Katılımı</td>
			<td>SRA Çalıştırma numarası</td>
			<td>Örnek adı</td>
			<td>Koşul</td>
			<td>Çoğaltmak</td>
			<td>Doku</td>
			<td>Sıralama</td>
			<td>Okuma uzunluğu</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-Seq</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1 nakavt</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1 nakavt</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220 göster</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1 nakavt</td>
			<td>Temsilci 3</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>Vahşi tip</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>Vahşi tip</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>Vahşi tip</td>
			<td>Temsilci 3</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-Seks</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>Vahşi tip (WT)</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>Vahşi tip (WT)</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 çift nakavt (DKO)</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 çift nakavt (DKO)</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977 göster</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 3 siRNA (KD) ile Mbnl 1/2 çift nakavt</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 3 siRNA (KD) ile Mbnl 1/2 çift nakavt</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>36 bg</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 çift nakavt, hedeflemeyen siRNA (Ctrl) ile</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 çift nakavt, hedeflemeyen siRNA (Ctrl) ile</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1. Analiz için kullanılan RNA-Seq ve PolyA-seq veri setlerinin özeti.

<table><tbody><tr><td>Hesaplamalı çalışma</td><td></td><td></td><td></td> için ilgili değil</tr></tbody></table>

rna-seq verilerinde alternatif ekleme ve poliadenilasyonun tanımlanması

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

Deneysel / biyolojik koşullar boyunca diferansiyel gen ekspresyonunu (DGE) ölçmek için RNA-Seq'in tipik analizinin yanı sıra, RNA-seq verileri ekzon seviyesindeki diğer karmaşık düzenleyici mekanizmaları keşfetmek için de kullanılabilir. Alternatif ekleme ve poliadenilasyon, transkripsiyon sonrası seviyede gen ekspresyonunu düzenlemek için farklı izoformlar üreterek bir genin fonksiyonel çeşitliliğinde çok önemli bir rol oynar ve analizleri tüm gen seviyesine sınırlamak bu önemli düzenleyici katmanı kaçırabilir. Burada, Bioconductor ve DEXSeq, Limma paketinden diffSplice ve rMATS dahil olmak üzere diğer paketleri ve fonksiyonları kullanarak, koşullar arasında diferansiyel ekzon ve poliadenilasyon sahası kullanımının tanımlanması ve görselleştirilmesi için ayrıntılı adım adım analizler gösteriyoruz.

Yukarıdaki adım adım iş akışını çalıştırdıktan sonra, AS ve APA analiz çıktıları ve temsili sonuçlar, aşağıdaki gibi oluşturulan tablolar ve veri grafikleri şeklindedir.
GİBİ: AS analizinin ana çıktısı (diffSplice için Ek Tablo 1; DEXSeq için Tablo 2), koşullar arasında diferansiyel kullanımı gösteren ekzonların bir listesi ve istatistiksel anlamlılığa göre sıralanmış, bir veya daha fazla kurucu ekzonun önemli genel ekleme aktivitesini göst...

Alternatif ekleme (AS) ve alternatif poliadenilasyon (APA), transkript izoformlarının ve ürünlerinin çeşitliliğini genişletir. Burada, deneysel koşullar arasında değişen AS ve APA'yı tespit etmek ve görselleştirmek için toplu RNA-seq ve 3' uç dizileme testlerini analiz etmek için biyoinformatik protokolleri açıklıyoruz.

RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Bu protokol, diferansiyel ekleme bölgelerini, diferansiyel olarak eksprese edilen ekzonları ve poli (A) bölgelerini tanımlamak için adım adım bir iş akışı sağlayarak alternatif ekleme ve poliadenilasyon tarafından üretilen gen izoformlarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Bu protokolün temel avantajı, alternatif eklemeyi incelemek için hem ekzon tabanlı hem de olay tabanlı yöntemleri değerlendirmesidir. Ayrıca alternatif poliadenilasyonu incelemek için ekzon bazlı yöntem uygular.AS ve AP analizi için kodları ve notları içeren R Markdown dosyaları sağlanmıştır. R Markdown dosyasındaki adımları izlemeniz ve her adım için nota dikkatlice ulaşmanız önerilir. Limma'dan diffSplice kullanarak diferansiyel eklemeyi tanımlamak için R not defteri dosyasını izleyin.Giriş dosyalarını metin makalesinde açıklandığı şekilde hazırlayın. Daha fazla ilerlemeden önce giriş dosyalarını hazırlamak için makaledeki bir ila üç arasındaki adımların sırayla takip edildiğinden emin olun. Gerekli kütüphaneleri yükleyerek başlayın.Spesifik olmayan filtreleme gerçekleştirmek için, önce daha önce elde edilen okuma sayılarının matrisini ayıklayın ve satırların genleri ve sütunların örnekleri temsil et

identification-alternative-splicing-polyadenylation-rna-seq

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Alternatif ekleme düzenlemesinin, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde önemli bir hücresel program olan epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Burada, EMT sırasında alternatif eklemenin tespiti için indüklenebilir bir EMT modeli kullanan bir yöntemi açıklıyoruz.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Bu rapor, özellikle memeli hücrelerinde hedef genlerin eklenmesini düzenleyen yeni Yapay Ekleme faktörler (ASFS) tasarım ve yapı için biyoteknolojik yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem ayrıca, RNA metabolizması diğer yönlerini işlemek için çeşitli yapay faktörleri mühendisi genişletilebilir.

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

Bu iletişim kuralı için siteleri işleme eşleme pre-mRNA 3' ucu bir yöntemi açıklar.

A-seq2 ile kütüphane hazırlık sıralama 3' ucu

Kısa antianlamlı oligonucleotides fare beyin bölümlerde alternatif pre-mRNA yapıştırma desenleri algılamak için kullandığı bir in situ hibridizasyon (ISH) protokolü tanımlanır.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Bu protokol, kemoterapötik tedaviden sonra alternatif birleştirme regülasyonunda karakteristik olmayan işleve sahip bir proteinin rolünü değerlendirmek için hızlı ve kullanışlı bir araç sunar.

mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma

Bu protokol, 5'-splice bölgesi mutasyonlarının birleştirme üzerindeki etkisini izlemek için bir minigene muhabiri testini açıklar ve mutasyona bağlı birleştirme inhibisyonunun kurtarılması için bastırıcı U1 snRNA geliştirir. Muhabir ve bastırıcı U1 snRNA yapıları HeLa hücrelerinde ifade edilir ve birleştirme astar uzantısı veya RT-PCR ile analiz edilir.

Birleştirme Verimliliğini İzlemek için Muhabir Tabanlı Hücresel Test

Burada, basit, non-invaziv toplama ve vaginal smear örneklerinin sitolojik değerlendirmesi ile fare üreme (Proestrus, kızgınlık, metestrus veya diestrus) aşamasında nasıl belirleneceği açıklanmaktadır. Biz daha vajinal sitoloji fare üreme döngüsü boyunca geçiş yatan hormonal seviyeleri dolaşımdaki nasıl yansıttığını açıklar.

Fare Östrus Döngüsü Evreleme Tanımlaması Vajinal Lavaj, Kristal Violet Boyama ve Vajinal Sitolojik Değerlendirilmesi Sahne

Bu protokol ile veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq, güçlü bir nesil DNA dizileme teknolojisi, uygulamak için tam ve ayrıntılı prosedür sunar. Bu protokol, farklı reaktifler veya hastalık durumlarında etkilenen çeşitli hücreleri veya dokulara genellenebilir olduğunu.

RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

Keşfedin RNA-seq verilerinde alternatif eklemeyi ve poliadenilasyonu biyoinformatik protokollerle analiz etme yöntemlerini. Bu çalışma, transkript çeşitliliğini ve gen düzenlemesini anlamaya katkı sağlar.

RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması

Daha fazla video keşfet