Bir GCaMP3 Muhabiri ile Kardiyak Spesifik Kalsiyum Akısını Ölçerek Kardiyak Yeniden Programlamanın İn vitro Değerlendirmesi
22 Şubat 2022
Burada, kardiyak yeniden programlama değerlendirmesi için bir Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıdaki αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare muhabir hattının kurulmasını ve uygulanmasını açıklıyoruz. Fare zorlanmasından izole edilen yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) dönüştürülerek, kalsiyum (Ca2+) akı yoluyla iCM'lerin yeniden programlama verimliliğinin ve fonksiyonel olgunlaşmasının rahat ve veri
Bu protokolde açıklanan yöntemler, kardiyak yeniden programlama çalışmaları için ICM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için değerli bir platform sağlayacaktır. Kalsiyum akısı sadece ICM'lerde görülür ve ICM fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmenin bir yolunu sağlar. Bu fare zorlanması değerlendirme prosedürlerini basitleştirir ve sonuçların tekrarlanabilirliğini artırır.
Bu protokol, kardiyak yeniden programlama alanında ICM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için yeni bir yöntemdir. Kardiyomiyosit farklılaşması ve kardiyak fonksiyonu değerlendirmek için de uygulanabilir. 10 milyon yenidoğan kardiyak fibroblast veya NCF'yi izole etmek için sekiz ila 10 yavru, P0 ila P2 yavruları elde ederek başlayın.
Yavruları hipotermi ile derinlemesine uyuşturun. İstenilen genotipe sahip kalbin, GCaMP3 tarafından kalplerin atışını göstererek kalsiyum akı gösterdiğiden emin olmak için floresan mikroskop altındaki kalpleri gözlemleyin. Diğer genotipler floresan göstermez.
Kalpleri izole ettikten sonra, gevşek bir şekilde bağlı olacak şekilde dört parçaya bölün. İzole hücrelerdeki kan hücresi kirliliğini sınırlamak için buz gibi Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde veya DPBS'de altı santimetrelik bir plakada birkaç kez iyice yıkayın. 37 santigrat derecede sekiz mililitre sıcak %0,25 Trypsin-EDTA ile kalpleri 10 dakika boyunca sindirin.
Trypsin süpernatantı atın ve Hank'in dengeli tuz çözeltisinde mililitre başına 0,5 miligram sıcak tip iki kollajenaz ekleyin. Karışımı iyice girdaplayın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe etti. Kuluçkadan sonra, tekrar, karışımı iyice girdaplayın ve sindirilmemiş dokunun yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
Süpernatantı beş mililitre soğuk fibroblast ortamına sahip 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Hücreleri fibroblast ortamı ile seyreltin, böyle şekilde tohumlama yoğunluğu santimetreküp başına iki ila 2,5 çarpı 10 ila dördüncü hücreler civarındadır. Daha sonra hücreleri tabaklara veya tabaklara tohumlayın.
Ekli fibroblastlar, tohumlamadan sonraki ikinci günde ovalden yuvarlak şekle sahip olmalıdır. Sıfır gününde, NCF'leri fibroblast ortamında santimetreküp başına yaklaşık bir ila iki kez 10 ila dördüncü hücre yoğunluğuna tohumlayın. İlk gün, kültür ortamını her biri için istenen kadar orta içeren bir virüsle değiştirin.
2. günde, virüs enfeksiyonundan 24 saat sonra, orta içeren virüsü normal bir ICM ortamı ile değiştirin. Kalsiyum iyon akısını oda sıcaklığında ters floresan mikroskopla değerlendirin. GCaMP3 pozitif hücrelerini 10X hedefi altında gözlemleyin, parlak alan kanalında spontan hücrelerin attığını gösterdiğindan emin olmak.
Doğru genotipe sahip kalpler, GCaMP3 unescence olarak görselleştirilen, atım ile senkronize kalsiyum iyon akısı gösterdi. Kontrol kalplerinde floresan gözlenmedi. İki saat içinde kuyuya bağlı izole NCF'ler ve tohumlamadan bir gün sonra ovalden yuvarlak şekle kadar gösterdi.
Kalsiyum iyon salınımı GCaMP3 floresan değişiminin maksimum ve minimum arasında değiştiğini ve bu hücrelerin kalsiyum iyon salınımının periyodik olarak değiştiğini göstermiştir. IMAP'i tanıttıktan sonra, imap orta tedavi grubunda yüksek güç alanı için kalsiyum iyon akısı olan GCaMP3 pozitif hücrelerinin sayısı artırıldığı için, dayayan kümelerin sayısı kontrollü gruptakinden önemli ölçüde daha yüksekti. NCF'ler izolasyondan sonra taze hazırlanmalı ve sağlıklı olmalıdır.
Hızlı bir kalp izolasyonu, kesme ve uygun sindirim süresi prosedürü, hücre canlılığı ve durumunda azalmayı önlemeye yardımcı olabilir. Bu yöntem, kardiyak yeniden programlama araştırmacıları için fonksiyonel olgunlaşmalı ICM'leri tanımlamanın bir yolunu sağlar. Birden fazla değerlendirme yöntemiyle, fonksiyonel olgunlaşmış ICM'ler hakkında daha kısa bir anlayış elde edilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kardiyak yeniden programlamayı değerlendirmek için geliştirilmiş yeni bir fare raporcu hattı olan αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3'ü sunmaktadır. Kurulan protokol, neonatal kardiyak fibroblastlardan (NCF'ler) türetilen indüklenmiş kardiyomiyositlerin (iCM'ler) kalsiyum akışı analizi yoluyla değerlendirilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak yeniden programlama
- İndüklenmiş kardiyomiyositler
- Kalsiyum akışı analizi
Arka Plan
- αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare modeli, kardiyak araştırmaları kolaylaştırır.
- Neonatal kardiyak fibroblastlar, iCM'lere verimli bir şekilde dönüştürülebilir.
- Kalsiyum akışı, iCM fonksiyonel olgunlaşmasının temel bir göstergesi olarak hizmet eder.
- Bu yöntem, kardiyak yeniden programlama çalışmalarında tekrarlanabilirliği artırır.
Çalışmanın Amacı
- iCM fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için güvenilir bir platform oluşturmak.
- Kardiyak yeniden programlama araştırmalarındaki değerlendirme prosedürlerini basitleştirmek.
- Kardiyomiyosit farklılaşması ve kardiyak fonksiyon hakkında içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- P0 ile P2 arasındaki yavrulardan neonatal kardiyak fibroblastların izolasyonu.
- NCF'lerin indüklenmiş kardiyomiyositlere dönüştürülmesi.
- Kalsiyum akışı ölçümü yoluyla fonksiyonel olgunlaşmanın değerlendirilmesi.
- Yeniden programlama verimliliğinin ve kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- NCF'lerin fonksiyonel iCM'lere başarılı bir şekilde dönüştürülmesi.
- Yalnızca iCM'lerde gözlemlenen kalsiyum akışı, olgunlaşmayı göstermektedir.
- Kardiyak yeniden programlama çalışmalarında sonuçların tekrarlanabilirliğinin artırılması.
- Kardiyomiyosit farklılaşmasını değerlendirmek için uygulanabilir protokol.
Sonuçlar
- αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare modeli değerli bir araçtır.
- Kalsiyum akışı analizi, iCM olgunlaşmasını değerlendirmek için etkilidir.
- Bu yöntem, kardiyak yeniden programlama ve fonksiyon araştırmalarını ileriye taşıyabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama Uygunluğu
İndüklenmiş kardiyomiyositlerin fonksiyonel olgunlaşmasının değerlendirilmesi, rejeneratif tedaviler için kardiyak yeniden programlamada kritik bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu protokol, iCM fonksiyonel olgunluğunun objektif değerlendirmesine olanak tanıyan kalsiyum akışının doğrudan, raporlayıcı tabanlı bir okumasını sağlayarak erken keşif aşamasında hedef doğrulamayı ve mekanik risk azaltmayı destekler. Transkripsiyonel yeniden programlamayı fonksiyonel elektrofizyolojik çıktıya bağlayarak, preklinik modellerdeki öngörü güvenini artırır ve kardiyak onarım stratejilerine ilişkin portföy kararlarına bilgi sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Transkripsiyon faktörü iletimini (MGT), yeniden programlanmış hücrelerdeki fonksiyonel kalsiyum geçici okumalarıyla ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Başarıyla yeniden programlanmış iCM'leri izole etmek için GCaMP3 floresanını kullanarak gen ekspresyonu gibi dolaylı belirteçlere olan bağımlılığı azaltır.
- Öngörücü Değer: Kalsiyum akışı, kardiyak yeniden programlama yaklaşımlarında biyolojik risk azaltmayı ve hedef güvenini destekleyen fonksiyonel bir biyobelirteç görevi görür.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: iCM maturasyon analizlerinde sayısal bir bağımlı değişken olarak kalsiyum akışını nicelleştirmek için standartlaştırılmış, floresans tabanlı bir platform oluşturur.
- Tekrarlanabilirlik: Reporter fare hattı, deneyler genelinde fonksiyonel iCM'lerin tutarlı bir şekilde tespit edilmesini sağlayarak analiz standartlaştırmasını destekler.
- Ölçeklenebilirlik: Floresans mikroskobu ile uyumludur ve yeniden programlama verimliliğinin taranması için daha yüksek kapasiteli görüntüleme sistemlerine uyarlanabilir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişki: Keşif aşamasından preklinik doğrulamaya köprü kurarak, iCM fonksiyonel olgunlaşmasını in vitro değerlendirmek için hastalıkla ilişkili bir sistem sağlar.
- Translasyonel Süreklilik: iCM olgunlaşmasının erken yeniden programlama aşamalarından fonksiyonel elektrofizyolojik yetkinliğe kadar olan boylamsal değerlendirmesine olanak tanır.
- Mekanistik Risk Azaltma: Kalsiyum akışı ölçümleri, yapısal olarak yeniden programlanmış hücrelerin fonksiyonel olarak olgun iCM'lerden ayırt edilmesine yardımcı olarak yanlış pozitif sonuçları azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve ardından preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlar; özellikle transkripsiyonel yeniden programlama sonrası ancak in vivo doğrulama öncesindeki fonksiyonel değerlendirmeyi mümkün kılar.
- Keşif Biyolojisi: Yeniden programlama faktörlerinin yalnızca belirteç ekspresyonunu değil, aynı zamanda fonksiyonel kalsiyum yönetimini de tetikleyip tetiklemediğini belirleyerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşiklerin veya koşulların karşılaştırılması için kantitatif kalsiyum akış okumaları sunan, analize hazır ve tekrarlanabilir biyolojik sistemler sağlar.
- Analitik: Kalsiyum osilasyon frekansı ve genliği üzerine floresans tabanlı zamansal veriler üreterek yeniden programlama koşullarının istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: İn vitro yeniden programlama sonuçlarını, preklinik modellerle ilgili fonksiyonel kardiyomiyosit fenotipleriyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla kardiyak yeniden programlama hedefi ve diferansiyasyon protokolü boyunca uygulanabilen, yeniden kullanılabilir bir raporlayıcı platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Fonksiyonel olgunlaşmanın doğrudan ölçümünü sağlayarak, yeniden programlama sonuçlarındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Genetik raporlayıcı spesifitesi aracılığıyla standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği artırır, antikor tabanlı yöntemlerden kaynaklanan değişkenliği minimize eder.
- Stratejik Değer: Moleküler yeniden programlamayı fonksiyonel elektrofizyolojik hazırlığa bağlayarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Fonksiyonel iCM verimi ve olgunlaşma kalitesine dayanarak, yeniden programlama stratejilerinin risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Fare yetiştirme, kalp dokusu izolasyonu ve floresan mikroskobu konularında uzmanlık gerektirir.
- αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare hattına ve MGT için viral iletim sistemlerine erişime bağlıdır.
- Tutarlı iCM indüksiyonu ve kalsiyum akışı değerlendirmesi için standardize edilmiş kültür koşulları ve zamanlama gereklidir.
- Alternatif fibroblast kaynaklarına veya türlerine yapılan adaptasyonlar, raporlayıcı özgüllüğünün ve kalsiyum sinyalizasyonu doğruluğunun doğrulanmasını gerektirebilir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, akış görselleştirmesi için spontan kasılmaya olan bağımlılık ve transfeksiyon verimliliğindeki potansiyel değişkenlik yer almaktadır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation and Selection of Neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mice Hearts
1:23
Isolation of Neonatal Cardiac Fibroblasts (NCFs)
2:43
Reprogramming NCFs to iCMs with MGT Encoding Retrovirus Infection
3:28
Results: In Vitro Assessment of Cardiac Reprogramming
4:20
Conclusion
