Geliştirici Tabanlı İfade Yapılarının AAV Dağıtımı In Vivo in Mouse Brain
31 Mart 2022
Bu protokol, yeni bir rAAV tabanlı geçici arttırıcı-muhabir analizini açıklamaktadır. Bu tahlil, fare beyninde in vivo olarak arttırıcı güdümlü ifadeyi indüklemek için kullanılabilir.
Bu protokol önemlidir, çünkü yalnızca bir geliştirici dizisinin ifadeyi yönlendirip yönlendiremeyeceğinin değil, aynı zamanda vücudun belirli bir bölümündeki ifadeyi nereye yönlendirebileceğinin görselleştirilmesini sağlar. Hızlı. Enjeksiyonların tamamlanması 10 dakikadan az sürer ve bir muhabir geninin ifade edilip edilmediği ve nerede ifade edildiği, numune toplandıktan sonraki birkaç gün içinde görülebilir.
Klonlamaya başlamak için bir reporter yapısı seçin veya tasarlayın. Burada kullanılan yapı, geliştirici adayı, hsp68 minimal promotörünün kontrolü altında ifade edilen bir EGFP muhabir geninin çevrilmemiş üç ana bölgesine yerleştirir. Bir dizi ilgi alanını yükseltmek ve vektöre klonlamak için PCR primerlerini tasarlamak için, Gibson klonlaması için uygun homoloji kolunu primerlerin beş ana ucuna ekleyin.
Tasarlanan primerleri kullanarak, bir DNA örneğinden PCR gerçekleştirin. Gerekli klonlama reaksiyonlarının istenen sayısına bağlı olarak Pac1 ve Asc1 kullanarak bir ila 10 mikrogram vektör DNA'sını sindirin. 100 voltta 30 ila 60 dakika boyunca% 0.7 ila% 1 jel elektroforezi kullanarak, kısıtlama sindirim parçalarını ayırın.
Doğrusallaştırılmış vektör için bandı çıkarın ve ticari bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın. Gibson klonlaması ve hücrelerin dönüşümü tamamlandıktan sonra, hücreleri seçici ortamlara yerleştirir ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilir. Muhabir yapısının başarılı klonlamasını doğruladıktan sonra, gliserol stoğunu kullanarak başlangıç kültürünün beş mililitresini aşılayın.
Kültürü, sallanan bir inkübatörde 30 santigrat derecede ve dakikada 180 rotasyonda sekiz ila 16 saat boyunca büyütün. Et suyu bulanıklaştıkça, başlangıç kültürünü 250 ila 300 mililitre taze seçici LB suyunda 1.000x seyreltin ve gece boyunca 30 santigrat derecede sallanan bir inkübatörde ve dakikada 180 rotasyonda inkübe edin. Ticari bir plazmid maxi kiti kullanarak, plazmidi saflaştırın.
ITR'lerin rekombinasyonunu test etmek için, bir Xma1 sindirimi gerçekleştirin. Bantları görselleştirin. Özetinizin beklenen bant sayısını gösterdiğinden emin olun.
Rekombinasyon, beklenenden daha az bantla sonuçlanacaktır. Teslimat için rekombinant AAV karışımı hazırlayın. Birden fazla geliştirici muhabir virüsünün ifade kalıplarını karşılaştırıyorsanız, virüs titrelerini en az konsantre virüse eşitlemek için her virüsü seyreltin.
Geliştirici muhabir virüsünü ve yapısal olarak ifade edilen kontrol muhabiri virüsünü iki ila bir veya üçe bir oranında karıştırın. Son konsantrasyonu %0,06 olan az miktarda hızlı yeşil boya ekleyinMikrolitre dereceli kılcal borudan yapılmış çekilmiş bir cam pipetin ucunu nazikçe delerek hassas, tüy bırakmayan bir mendil haline getirin. Pipetleri, mikrokapiler pipeti tutmak için lastik contaya bağlı basınç uygulayan bir cihazla aspiratör tertibatına yerleştirin.
Aspiratörden negatif basınç uygulayarak pipete yaklaşık 0,2 ila 0,5 mikrolitre mineral yağ gibi küçük bir hacim çekin. Aspiratör tertibatını bir kenara koyun ve enjekte edilmeye hazır olana kadar virüsü buzun üzerine yerleştirin. Yenidoğan farelerini kriyo-anestezi uyguladıktan sonra, aspiratör tertibatını kullanarak negatif basınç uygulayın ve menisküs iki mikrolitrelik kene işaretini geçene kadar virüs karışımını çekilen cam pipete çekin.
Fareyi soğuk odadan uzaklaştırın ve tezgahın üstüne yerleştirin. İki taraflı enjeksiyon bölgelerini lambda ve bregma arasındaki ortaya, ayrıca sagital sütür ve her bir gözün ortasına yerleştirin. Alkollü bir mendil kullanarak onları sterilize edin.
Çekilen cam pipeti kullanarak yenidoğan farelerinin kafatasını delin. İğne kafatasına girerken, aspiratör tertibatından pozitif bir basınç uygulayın. Virüsün bir mikrolitresini lateral ventriküle dağıtın ve pipeti çekin.
Kurtarmak için fareyi bir ısıtma yastığına veya bir ısıtma odasına yerleştirin. Uyandıktan sonra hayvanı ev kafesine geri döndürün. Düşük büyütmeli 5x öznel lens kullanarak beyin bölümünü geçen floresan görüntüleri kaydedin.
Enjeksiyon bölgesini bularak, kırmızı floresan hücrelerin yoğunluğuna ve yoğunluğuna bağlı olarak virüs iletiminin derecesini değerlendirin. Benzer şekilde dönüştürülen hayvanları karşılaştırın. Floresan görüntüleri 25x'ten daha yüksek büyütmeli objektif lensle kaydedin.
Ardından, analiz yazılımını açın ve gürültüyü azaltmak için üçe üç medyan filtre uygulayın. İşlem menüsüne tıklayın, ardından Gürültü'ye tıklayın ve Benek Gider seçeneğini seçin. Ardından, görüntülerden arka plan floresansını çıkarmak için, çok kanallı bir görüntünün kanallarını ayırarak başlayın.
Görüntü menüsüne tıklayın, ardından Renk'e tıklayın ve Kanalları Böl seçeneğini seçin. Dikdörtgen veya daire seçim aracını kullanarak, herhangi bir floresan hücresi olmadan görüntünün bir alanına küçük bir şekil çizin. Analiz Et'e ve ardından Ölç'e tıklayarak arka planın ortalama piksel yoğunluğunu ölçün ve birden çok kez örneklemek için tekrarlayın.
Ortalama gri değerin ortalamasını beş ila sekiz arka plan alanından alın ve ondalık değerleri bırakın. İşlem menüsünü seçerek görüntüdeki her pikselden değerleri çıkarın, ardından Matematik ve Çıkar'ı tıklayın. Ardından, çıkarılacak arka plan değerini girin ve Tamam'ı tıklatın. Gerekirse, Görüntü menüsünü seçerek kanalları tekrar çok kanallı bir görüntüde birleştirin, ardından Renk'e tıklayın ve Kanalları Birleştir'i seçin.
Yeşil floresan hücrelerin sayısını saymak, yeşil kanalı gizlemek ve serbest form seçim aracını kullanarak beyin bölgesinin etrafına kırmızı floresanı ifade eden bir şekil çizin. Seçilen bölgedeki kırmızı kanalın alanını, entegre yoğunluğunu ve ortalama gri değerini ölçmek için Ölçüm işlevine tıklayın. Çok noktalı bir seçim aracı kullanarak yeşil hücrelerin sayısını sayın ve yeşil hücrelerin sayısını kırmızı kanalın tümleşik yoğunluğuna göre normalleştirin.
Güçlendirici muhabiri dönüştürdükten sonra, farenin pozitif bir AAV yapısı ile P0'a intrakraniyal olarak enjekte edildiğini, enjeksiyondan 28 gün sonra korteksin orta alt katmanlarında arttırıcı güdümlü EGFP ekspresyonu gösterdi. P0'da negatif bir kontrol yapısı ile enjekte edilen fare, enjeksiyondan 28 gün sonra herhangi bir EGFP ifadesi göstermez, bu da arttırıcı elemanların fare beyninde EGFP'nin transkripsiyonunu yönlendirdiğini gösterir. Başarılı bir şekilde dönüştürülen alanı görselleştirmek ve potansiyel değişkenliği kontrol etmek için, farklı titrelerin AAV tarafından verilen geliştirici muhabir kütüphaneleri incelenmiştir.
Aday arttırıcıların yüksek titre kütüphanesi geniş EGFP ekspresyonunu yönlendirirken, aday arttırıcıların düşük titre kütüphanesi P7 fare beyninde seyrek CGFP ekspresyonunu yönlendirir. Arttırıcı muhabir AAV'yi her enjeksiyonda pozitif kontrol ile karıştırmak, aktivitesi olmayan arttırıcılar ile başarısız teslimatlar arasında ayrım yapmak için hayati önem taşır. Bu prosedür, bir arttırıcının hangi hücre tiplerinde aktif olduğunu belirlemek için immünohistokimya, RNA FISH veya tek hücreli RNA dizilimi ile eşleştirilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, fare beyninde in vivo kullanım için geliştirici tarafından sürülen gen ekspresyonunu görselleştirmek amacıyla yeni bir rAAV tabanlı geçici geliştirici-raporör tahlili sunmaktadır. Protokol, araştırmacıların yalnızca bir geliştiricinin ekspresyonu sürebileceğini değil, aynı zamanda özel beyin bölgelerinde nerede yapabileceğini hızlı bir şekilde değerlendirmelerini sağlamaktadır.
Çalışmanın Önemli Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gen Ekspresyonu
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- Geliştirici dizilerini anlamak, gen düzenlemesini deşifre etmek için çok önemlidir.
- In vivo modeller, spesifik dokulardaki ekspresyon paternlerini anlamak için bilgiler sağlar.
- Bu yöntem, geleneksel yaklaşımlara kıyasla gen aktivitesinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Canlı bir organizmada geliştirici aktivitesini görselleştirmek için verimli bir tahlil yaratmak.
- Fare beyninde raporör gen ekspresyonunun hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak.
- Geliştirici tarafından sürülen ekspresyonun kesin lokalizasyonunu sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Protokol, rAAV tabanlı bir transdüksiyon yaklaşımı kullanmaktadır.
- Viral teslimat sonrası ekspresyon paternlerini değerlendirmek için fare beyin modelleri kullanılmaktadır.
- Anahtar adımlar arasında raporör yapılarının klonlanması ve in vivo enjeksiyonların gerçekleştirilmesi bulunmaktadır.
- Gen ekspresyon paternlerinin analizi, enjeksiyondan günler sonra gerçekleşir.
Ana Sonuçlar
- Spesifik korteks katmanlarında geliştirici tarafından sürülen EGFP ekspresyonunun başarılı görselleştirilmesi.
- Pozitif ve negatif kontrol yapılarının etkileri arasında net bir ayrım.
- Ekspresyon paternlerinin doğrulanması, etkili geliştirici aktivitesi değerlendirmesini gösterir.
Sonuçlar
- Bu protokol, in vivo geliştirici fonksiyonunun değerlendirilmesi için yeni bir yöntem göstermektedir.
- Gen ekspresyonunun hızlı ve lokalize değerlendirilmesini sağlayarak düzenleyici mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştirir.
- Yaklaşım, sinirsel bağlamlardaki gen düzenlemesini araştıran gelecekteki çalışmalar için değerlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, in vivo assessment of enhancer activity in the mouse brain, providing spatial and temporal resolution of gene regulation without requiring transgenic models. It supports target validation by linking non-coding DNA elements to functional expression patterns in disease-relevant neural circuits. The approach accelerates mechanistic de-risking in early discovery by delivering quantitative, imaging-based readouts of enhancer function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether candidate enhancer sequences can drive gene expression in specific brain regions.
- Operational Value: Uses standard cloning and AAV packaging to generate enhancer-reporter libraries for high-throughput screening of regulatory elements.
- Predictive Value: Enables biological de-risking by linking enhancer activity to cell-type-specific expression patterns in the cortex and other neural structures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative fluorescence readouts (EGFP intensity) that correlate with enhancer strength and activity patterns across developmental stages.
- Operational Value: Leverages expanding AAV serotypes and standardized imaging workflows for reproducible, scalable enhancer testing across multiple constructs.
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (transduced mouse brain) suitable for downstream applications like immunohistochemistry or single-cell RNA sequencing to define enhancer-active cell types.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by mapping enhancer activity to specific cortical layers and developmental timepoints (P0 to P7).
- Translational Continuity: Enables cross-functional collaboration by providing standardized, spatially resolved expression data that can inform biomarker alignment and target selection.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by distinguishing active enhancers from negative controls through normalized green-to-red fluorescence ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling hypothesis testing of non-coding regulatory elements prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing where enhancers drive expression in the mouse brain, linking genotype to phenotype in neural tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized virus production, equitized titers, and co-injection with control reporters to distinguish true enhancer activity from delivery failure.
- Analytics: Enables quantitative comparison of enhancer activity via integrated density measurements and background-subtracted fluorescence imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing follow-up with RNA FISH or immunohistochemistry to determine cell-type specificity of enhancer-driven expression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for enhancer library screening, leveraging low-cost AAV production and standard microscopy for repeated campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in enhancer function through direct in vivo visualization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled virus titers, background subtraction protocols, and normalized cell counting.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of enhancer candidates without generating and maintaining transgenic lines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing clear, imaging-based evidence of enhancer activity in disease-relevant brain regions.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise for Gibson assembly and viral vector preparation.
- Depends on AAV purification and titration infrastructure for consistent enhancer-reporter delivery.
- Necessitates stereotaxic injection skills and neonatal mouse handling for accurate intracranial delivery.
- Relies on fluorescence microscopy and image analysis tools (e.g., background subtraction, channel splitting) for reliable readout.
- Limited by enhancer context-dependency; activity may vary across developmental stages, brain regions, or disease models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Enhancer Candidate Sequence Cloning into the AAV Vector Plasmid
3:09
Intracranially Inject rAAV-Packaged Plasmid into Neonatal Mice
5:32
Image and Analyze Brain Tissue Sections for Enhancer Activity
8:10
Results: AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs in Mouse Brain
9:21
Conclusion
