İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Hepatosit Benzeri Hücre İndüksiyonu İçin Etkili Bir Yöntem

Bu makalede, hESC farklılaşması sırasında Activin A ve CHIR99021'in kesin endoderm (DE) olarak sürekli olarak takviye edilmesiyle insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC' ler) fonksiyonel hepatosit benzeri hücrelere (HLC) farklılaştırılması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan embriyonik kök hücre türevi hepatosit benzeri hücreler hastalık modelleme ve ilaç taramasında faydalıdır. Bu, insan embriyonik kök hücrelerinin fonksiyonel hepatosit benzeri hücrelere farklılaştırılmasını etkili bir şekilde teşvik etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Farklılaşmamış bir durum ve insan embriyonik kök hücrelerinin uygun bir şekilde birleşmesi, hepatosit benzeri hücrelere başarılı bir farklılaşma için kritik öneme sahiptir.

Kök hücre bakımı için, steril altı kuyu doku kültürü ile işlenmiş plakaları kuyu başına bir mililitre 1X insan embriyonik kök hücre nitelikli Matrigel ile kaplayın ve bir gecede dört santigrat derecede saklayın. Plakaları kullanmadan önce oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Kriyo ile korunmuş HES'leri 37 santigrat derecelik su banyosunda üç dakika boyunca titremeden çözün, ardından kök hücreleri hemen dört mililitre önceden ısıtılmış, 37 santigrat santigrat derece mTESR ortamı içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetleterek aktarın.

HESE'leri santrifüj edin ve süpernatantı epire edin, ardından hücreleri bir mililitre mTESR ortamında hafifçe yeniden askıya alın. DMEM F-12 ortamını plakadan aspire edin. Hücreleri iki mililitre mTESR'de 1 x 10'dan 5.hücrelere kadar olan yoğunlukta altı kuyulu bir tabağa tohumlayın ve% 5 karbondioksit inkübatöründe kuluçkaya yatırın.

Ortamı her gün önceden ısıtılmış mTESR ortamıyla değiştirerek hücreleri koruyun. Hücreleri kabaca% 70 ila 80 birleştiğinde veya hücre kolonileri temas etmeye başladığında geçiş yapın. Geçen hücreler için, ortamı epire edin ve hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca enzim çözeltisi başına bir mililitre ile kuluçkaya yatırın.

Hücreleri, önceden 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış dört mililitre DMEM F-12 içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetle aktarın. 24 kuyu plakalarını 250 mikrolitre 1X hESC nitelikli Matrigel ortamı ile kaplayarak hazırlayın. 500 mikrolitre mTESR ortamında kuyu başına 1 ila 1,5 kat 10 ila 5.

Her iki aktivin A'yı mililitre başına 100 nanogramlık son konsantrasyona ve CHIR99021'i önceden ısıtılmış birinci aşama ayırt etme temel ortamının uygun hacminde üç mikromolar son konsantrasyona ekleyin. Üç günlük farklılaşmadan sonra, farklılaştırılmış hücreler FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 ve FOXA1 gibi kesin endoderm hücrelerinin işaretlerini ifade etmelidir. Farklılaşmanın üçüncü gününde, ortamı aspire edin, ikinci aşama ortamla değiştirin ve 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.

Ortamı dört ila sekiz gün arasında iki günde bir değiştirin. Sekiz günlük farklılaşmadan sonra, farklılaştırılmış hücreler HNF4 alfa, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA gibi hepatik progenitör hücrelerin uygun belirteçlerini ifade etmelidir. Sekizinci günde, ikinci aşamayı hücrelerden epire edin ve üçüncü aşama ortamla değiştirin.

Hücrelerin karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede 10 gün kuluçkaya yatmasına izin verin ve her gün medyayı yeni eklenen farklılaşma faktörleriyle değiştirin. 18 günlük farklılaşmadan sonra, farklılaştırılmış hücreler AAT, ALB, TTR, HNF4 alfa, NTCP, ASGR1, CYP3A4 gibi hepatositlerin karakteristik belirteçlerini ifade etmelidir. HESC'lerden hepatatosit benzeri hücrelerin şematik diyagramı ve her farklılaşma aşamasının parlak alan görüntüleri gösterilir.

Birinci aşamada, kök hücreleri endoderm hücreleri oluşturmaya teşvik etmek için üç gün boyunca activin A ve CHIR99021 eklendi. İkinci evrede endoderm hücreleri beş gün boyunca bir farklılaşma ortamı ile tedavi edildikten sonra hepatik progenitör hücrelere farklılaştı. Üçüncü evrede, 10 gün sonra, erken hepatositler hepatosit büyüme faktöründe ve onkostatinde hepatosit benzeri hücrelere olgunlaşmış ve farklılaşmıştır.

Farklılaşmanın son aşamasında, hücreler tipik bir hepatosit fenotipi gösterdi. Endoderm hücrelerinin, hepatik öncül hücrelerin ve olgun hepatositlerin belirteçlerini tespit etmek için RT-PCR, immünoresans lekeleme ve batı şişkinliği kullanıldı. Farklılaştırılmış hücreler, üçüncü günde endoderm belirteçleri SOX17, sekizinci günde hepatik öncü işaretleyici HNF4 alfa, 14. günde AFP ve 18. günde olgun hepatosit belirteci ALB gibi her aşamada farklılaşmaya bağlı gen ve proteinlerin yüksek ekspresyon seviyelerini gösterdi.

HLC'lerde yeşil lekeleme ve geniş sitoplazmik asit kayması lekesi sergilendi. Hepatositler tipik çift çekirdekli morfoloji gösterdi. HLC'lerde karaciğerdeki temel metabolik CYP olan CYP3A4'ün enzimatik aktivitesi bir enzim tahlili ile doğrulandı.

İnsan embriyonik kök hücrelerinin uygun yoğunlukta oturması ve aşağıdaki tarihte farklılaşmaya başlaması kritik öneme sahiptir. Birinci aşamada, hücreler yukarı doğru yüzmeye eğilimli olduğundan medyaya hafifçe dokunun. Aktiv A ve diğer küçük moleküllerin kombinasyonu, farklılaşma verimliliklerini daha da artırabilir ve bu prosedürde daha olgun hepatosit benzeri hücreler üretebilir.

Bu teknik hepatosit nakli, karaciğer doku mühendisliği, biyoartificial karaciğerler ve hastalık modellemesini keşfetmek için bir platform sağlayabilir.