Name: Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Öğrenin, otomatik fraksiyonasyon sistemleri olmadan polizom profili oluşturmayı. Bu yöntem, Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde ribozom aktivitesini analiz etmek için güvenilir bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Dr. Percy Tumbale ve Dr. Melissa Wells'e bu makaleyi eleştirel okumaları için teşekkür eder. Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir; ABD Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS; ZIA ES103247 ila R.E.S).

1. %7 -%47 sakkaroz gradyanlarının hazırlanması
NOT: Sakkaroz gradyanının doğrusal aralığı, kullanılan hücre tipine bağlı olarak daha iyi ayırma elde etmek için değiştirilebilir. Bu protokol, S. cerevisiae için polizom profilleri için optimize edilmiştir.
<ol><li>Sakkaroz gradyan tamponunda %7 ve %47 sakarozlu stok çözeltileri hazırlayın (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 ve 1 mM DTT). Filtre, sakkaroz stok çözeltilerini 0,22 μm'lik bir filtreyle sterilize eder ve 4 °C'de saklar.</li>
	<li>%7 ve %47 sakaroz stok çözeltilerini Tablo 1'de açıklanan şekilde dağıtarak ve karıştırarak %17, %27 ve %37'lik 14 mL sakkaroz çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Altı polipropilen santrifüj tüpünü (14 x 89 mm) tam görünümlü bir test tüpü rafına yerleştirin. Tüpler arasında yeterli boşluk bırakın, böylece bir tüple yapılan eylemler diğerlerini rahatsız etmez.</li>
	<li>3 mL'lik bir şırıngaya uzun bir iğne takın. Bu protokol için, künt uçlu 9 inç, 22 G'lik bir iğne kullanın (Şekil 1), ancak santrifüj tüpünün dibine ulaşacak kadar uzun herhangi bir iğne yeterli olacaktır. NOT: Degradeleri ayarlamadan önce şırınganın sakkaroz çözeltisini damlama olmadan tutabildiğinden emin olmak için bir test dolgusu ve dağıtımı gerçekleştirin.</li>
	<li>Her santrifüj tüpünün dibine %7 sakarozun 2 mL'sini ekleyin.</li>
	<li>İğne ucunu tüp tabanının hemen yakınına yerleştirerek ve çözeltiyi yavaş ve dikkatli bir şekilde dağıtarak% 7'lik çözeltinin altına% 17 sakarozun 2 mL'sini ekleyin.</li>
	<li>% 27,% 37 ve% 47 sakkaroz çözeltilerinin her biri 2 mL ile tekrarlayın. Her katmanın birbirinden yoğunlukların ayrılmasını işaretleyen bir çizgi ile ayırt edilebildiğinden emin olun (Şekil 2). NOT: Eğer gradyanlar 48 saat içinde kullanılmayacaksa, bu noktada, sürekli bir gradyana yerleşmeden önce, tüpleri sıvı azotta katmanlı sakkaroz çözeltileri ile flaş dondurun ve uzun süreli depolama için -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.</li>
	<li>Degradelerin sürekli, artan bir sakkaroz yüzdesine yerleşmesine izin vermek için gradyanları gece boyunca 4 ° C'de saklayın. Katmanlı sakkaroz çözeltilerinin doğrusal bir sakkaroz gradyanına yerleşmesi 8-12 saat sürer. Doğrusal gradyanlar 48 saate kadar kararlıdır. 4 ° C'de gece boyunca depolama, dondurulmuş, katmanlı sakkaroz çözeltilerinin kullanılması için çözülme ve doğrusal bir gradyana yerleşme için yeterli zaman sağlar. Degrade kalitesini değerlendirmek için bir densitometre kullanın. NOT: Herhangi bir hareket veya titreşim gradyanı bozacağından, gradyanları rahatsız edilmeyecekleri sabit bir yerde saklamak çok önemlidir.</li>
</ol>2. Maya hücresi ekstraktlarının hazırlanması
<ol><li>İlgilenilen maya suşunu 50 mL maya özü pepton dekstroz (YPD) ortamına aşılayın ve sallanan bir inkübatörde sabit faza kadar gece boyunca 30 ° C'de büyür. NOT: Sıcaklık, maya suşu gereksinimlerine bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>10 mL sabit faz kültürünü 1 L taze YPD ortamına aktarın. Kültür orta-üstel büyüme fazına ulaşana kadar hücreleri 30 ° C'de (veya başka bir uygun sıcaklıkta) kuvvetli sallanarak inkübe edin (OD600 = 0.4-0.6).</li>
	<li>Üstel büyüme evresinin ortasında, kültüre 0.1 mg / mL'lik son konsantrasyonda sikloheksimid ekleyin. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücreleri 3.000 x g'de santrifüjleme ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca hasat edin. NOT: Bu noktada, hücreler dondurulabilir ve -80 ° C'de saklanabilir.</li>
	<li>Soğutulmuş 700 μL polizom ekstraksiyon tamponunda hücreleri yeniden askıya alın (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT,% 1 Triton X-100, 0.1 mg / mL sikloheksimid, 0.2 mg / mL heparin). 100 birim RNaz İnhibitörü ekleyin ve 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Santrifüj tüpüne 425-600 μm boyut aralığına sahip ~400 μL önceden soğutulmuş cam boncuk ekleyin. Maya hücrelerini 5 dakika boyunca bir boncuk çırpıcıda kuvvetli ajitasyon ile bozun.</li>
	<li>4 ° C'de 5 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüjleme ile lizatı netleştirin.</li>
	<li>Berraklaştırılmış lizattaki RNA'nın konsantrasyonunu, bir spektrofotometre ile 260 nm'deki absorbansı ölçerek veya floresan tabanlı bir RNA algılama sistemi kullanarak belirleyin. NOT: Çok doğru RNA konsantrasyon ölçümleri için, floresan bazlı RNA algılama kitleri kullanın.</li>
	<li>RNA konsantrasyonunun 0.5-1 μg / μL olduğundan emin olun. RNA konsantrasyonu çok düşükse, gelecekteki deneylerde hücreleri yeniden askıya almak için kullanılan polizom ekstraksiyon tamponunun hacmini azaltın. NOT: Lisatı lizis ve RNA kantitasyonundan hemen sonra gradyanlara yükleyin. Gerekirse, lizatları sıvı azotta flaş dondurun ve birkaç gün boyunca -80 ° C'de saklayın.</li>
</ol>3. Degradelerin santrifüjlenmesi
<ol><li>Lisatı dikkatlice gradyanların üstüne yükleyin. Pipet ucunu iç duvara, polipropilen tüpün üstüne yerleştirin. Tüpü yavaşça açın ve lizatı duvara doğru sallayarak yavaşça gradyanın üstüne dağıtın. Lisatı yüklerken gradyanı bozmamaya veya rahatsız etmemeye büyük özen gösterin. NOT: Yüklenen lizat miktarı hücre türüne göre değişir. RNA'nın içeriği de değişecektir. Optimal bir polizom profili oluşturmak için gereken lizat miktarını belirlemek için bir dizi deney yapmak gerekebilir. Maya için, 300 μg RNA optimizasyon için iyi bir başlangıç noktasıdır.</li>
	<li>Tüpleri, sallanan bir kova rotorunun önceden soğutulmuş kovalarına yavaşça yerleştirin. NOT: Her polipropilen santrifüj tüpü eşit miktarda gradyana ve yüklenen lizat miktarına sahip olmalıdır. Bu tüpten tüpe değişebilir. Varyasyonun ultrasantrifüjleme sırasında dengesizlik hatasına neden olmadığından emin olun.</li>
	<li>Degradeleri 4 °C'de 150 dakika boyunca 260.110 x g'de santrifüj yapın.</li>
</ol>4. Kesir ve veri toplama
<ol><li>Santrifüj tüplerini sallanan kova rotorundan dikkatlice çıkarın ve bir tüp tutucuya yerleştirin.</li>
	<li>Fraksiyonları saklamak ve buz üzerinde önceden soğutmak için 96 kuyucuklu plakaları etiketleyin. NOT: 260 nm/280 nm'de nükleik asit tayinleri için 230 nm'ye kadar optik penceresi olan spektrofotometre için uygun 96 delikli bir plaka kullanın.</li>
	<li>Degradenin üst kısmına dikkatlice bir pipet ucu yerleştirerek gradyanın üstünden başlayarak 100 μL veya 200 μL fraksiyonları toplayın. Tüm gradyan aliquoted olana kadar kesirleri toplayın. Kesirlerin sayısı toplam gradyan hacmine bağlı olacaktır. NOT: Kesirleri, gradyanın geri kalanını bozmayacak şekilde toplayın. Tüm kesirlerin eşit hacme sahip olduğundan emin olun. Manuel fraksiyonasyona ek olarak, fraksiyonasyon için bir başka düşük maliyetli yöntem de küçük bir peristaltik pompa kullanmaktır.</li>
	<li>Santrifüj tüpünün dibine ulaşmak için her fraksiyonu 96 delikli plakaya aktarın. Toplanan fraksiyonları her zaman buzun üzerinde tutun.</li>
	<li>Her fraksiyonun absorbansını 254 nm'de bir spektrofotometre ile ölçün. % 7 ve% 47 sakkaroz çözeltilerini boşluk olarak kullanın. NOT: Fraksiyonların absorbansını ölçerken, çoğu spektrometre ve kolorimetre için en etkili absorbans aralığının 0,1-1 olduğunu unutmayın. Absorbans ölçümleri aralık dışındaysa (≥1.0), fraksiyonlar çok fazla malzemeye sahiptir. Örneği seyreltin, verileri yeniden toplayın ve ardından profili çizerken seyreltme faktörünü hesaba katın.</li>
	<li>Kesir sayısını absorbansa karşı çizerek çoklu profili oluşturun.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).</li>
<li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).</li>
<li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79(2019).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3(2018).</li>
<li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+in+leishmania%2C+human+cells+and+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600(2018).</li>
<li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).</li>
<li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15(2017).</li>
<li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate%2C+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573(2017).</li>
<li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295(2014).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164(2014).</li>
<li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126(2017).</li>
<li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li>
<li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRS1+to+DRS7%2C+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li>
<li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li>
<li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li>
<li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+assembly+coming+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li>
<li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+puzzle+of+life%3A+Crafting+ribosomal+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li>
<li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+nascent+ribosome%3A+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3%2FLas1+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).</li>
<li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li>
<li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymolog%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li>
<li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+%28eEF%29+1A+and+eEF3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li>
<li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada, pahalı otomatik fraksiyonasyon sistemleri kullanılmadan polizom profilleri oluşturmanın bir yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntemin avantajı, polizom profillemeyi otomatik fraksiyonasyon sistemlerine sahip olmayan laboratuvarlar için erişilebilir hale getirmesidir. Bu protokolün en büyük dezavantajları, sıkıcı el fraksiyonasyonu ve özel yoğunluk fraksiyonasyon sistemine kıyasla daha az hassasiyettir.
Bu protokol, ribozomal alt birimleri, monozomları ve polizomları ayırmak için yeterli çözün...

Ribozomlar, mRNA'yı proteinlere dönüştürmenin temel işlemini gerçekleştiren mega-Dalton ribonükleoprotein kompleksleridir. Ribozomlar, bir hücre içindeki tüm proteinlerin sentezini gerçekleştirmekten sorumludur. Ökaryotik ribozomlar, sedimantasyon katsayılarına göre küçük ribozomal alt birim (40S) ve büyük ribozomal alt birim (60S) olarak adlandırılan iki alt birimden oluşur. Tamamen monte edilmiş ribozom, 80S monozomu olarak adlandırılır. Polizomlar, tek bir mRNA molekülünü çevirmekle uğraşan ribozom gruplarıdır. Sakkaroz yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile polizom fraksiyonasyonu, ribozom profilleri oluşturmak, ribozomların çevrilmesiyle ilişkili spesifik mRNA'ları tanımlamak ve polizomla ilişkili faktörleri analiz etmek için kullanılan güçlü bir yöntemdir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Bu teknik genellikle polizomları tek ribozomlardan, ribozomal alt birimlerden ve haberci ribonükleoprotein parçacıklarından ayırmak için kullanılır. Fraksiyonasyondan elde edilen profiller, polizomların çeviri aktivitesi14 ve ribozomların montaj durumu15,16,17 hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Ribozom montajı, ribozom montaj faktörleri18,19,20,21 olarak bilinen bir grup protein tarafından kolaylaştırılan çok karmaşık bir süreçtir. Bu faktörler, ribozom biyogenezi sırasında, ATPazlar, endo ve ekzo-nükleazlar, GTPazlar, RNA helikazlar ve RNA bağlayıcı proteinler22 dahil olmak üzere diğer birçok proteinle etkileşimler yoluyla çok çeşitli işlevler yerine getirir. Polizom fraksiyonasyonu, bu faktörlerin ribozom montajındaki rolünü araştırmak için kullanılan güçlü bir araç olmuştur. Örneğin, bu yöntem, bir pre-rRNA işleme faktörü olan polinükleotid kinaz Grc3'teki mutasyonların ribozom montaj işlemini nasıl olumsuz yönde etkileyebileceğini göstermek için kullanılmıştır17,23. Polizom profilleme ayrıca ATPase Rix7 içindeki korunmuş motiflerin ribozom üretimi için nasıl gerekli olduğunu vurgulamış ve göstermiştir16.
Polizom fraksiyonasyonu prosedürü, ilgilenilen hücrelerden çözünür hücre lizatları yapmakla başlar. Lisat RNA, ribozomal alt birimler ve polizomların yanı sıra diğer çözünür hücresel bileşenleri içerir. Bir ultrasantrifüj tüpü içinde sürekli, doğrusal bir sakkaroz gradyanı yapılır. Hücre lizatının çözünür fraksiyonu, sakkaroz gradyan tüpünün üstüne yavaşça yüklenir. Yüklü gradyan tüpü daha sonra santrifüjlemeye tabi tutulur, bu da hücresel bileşenleri sakkaroz gradyanı içindeki boyuta göre yerçekimi kuvveti ile ayırır. Daha büyük bileşenler, gradyana daha küçük bileşenlerden daha fazla gider. Degradenin üst kısmı daha küçük, daha yavaş hareket eden hücresel bileşenleri barındırırken, altta daha büyük, daha hızlı hareket eden hücresel bileşenler bulunur. Santrifüjlemeden sonra, tüpün içeriği fraksiyonlar halinde toplanır. Bu yöntem ribozomal alt birimleri, monozomları ve polizomları etkili bir şekilde ayırır. Her fraksiyonun optik yoğunluğu daha sonra spektral absorbansın 254 nm dalga boyunda ölçülmesiyle belirlenir. Absorbans ve fraksiyon sayısının çizilmesi polizom profili verir.
Doğrusal sakkaroz yoğunluk gradyanları, bir gradyan oluşturucu kullanılarak üretilebilir. Santrifüjlemeyi takiben, gradyanlar genellikle fraksiyone edilir ve absorbanslar otomatik bir yoğunluk fraksiyonasyonsistemi 3,7,13,24,25 kullanılarak ölçülür. Bu sistemler polizom profilleri üretmek için çok iyi çalışsa da, pahalıdır ve bazı laboratuvarlar için maliyet engelleyici olabilir. Burada, bu aletleri kullanmadan polizom profilleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bunun yerine, bu protokol tipik olarak çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan ekipmanı kullanır.

<table><tbody><tr><td>Otomatik Fraksiyonlayıcı</td><td>Brandel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clariostar Çok Modlu Plaka Okuyucu</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>Cam Boncuklar, asitle yıkanmış</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td>425 &ndash; 600 &mu; m</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür, 1 M</td><td>KD Medical</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>İğne, 22 G, Metal Hub</td><td>Hamilton Company</td><td>7748-08</td><td>özel uzunluk 9 inç, nokta stili 3</td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen Santrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen Test Tüpü Peg Raf</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-810-54A</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kübit 4 Florometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33228</td><td></td></tr><tr><td>Kübit RNA HS Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>RNAse İnhibitörü</td><td>Uygulamalı</td><td>Biyosistemler N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Sallanan Kova Rotor Pkg</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga, 3 mL</td><td>Coviden</td><td>888151394</td><td></td></tr><tr><td>Tris, 1 M,&nbsp; pH 7.4</td><td>KD Medikal</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>UV-Star Mikroplaka, 96 kuyu</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>655801</tr></tbody></table>

degrade yapıcılar veya fraksiyonasyon sistemleri olmadan polizom profilleme

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Sakkaroz yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile polizom fraksiyonasyonu, ribozom profilleri oluşturmak, ribozomlar tarafından çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak ve polizomla ilişkili faktörleri analiz etmek için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Otomatik gradyan üreticileri ve gradyan fraksiyonasyon sistemleri bu teknikle yaygın olarak kullanılırken, bu sistemler genellikle pahalıdır ve sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar için maliyet engelleyici olabilir veya araştırmaları için bu yöntemi nadiren veya ara sıra gerçekleştirme ihtiyaçları nedeniyle masrafı haklı çıkaramazlar. Burada, özel fraksiyonasyon aletleri olmadan çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan standart ekipmanı kullanarak çoğaltılabilir polizom profilleri üretmek için bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, gradyan fraksiyonasyon sistemi olan ve olmayan polizom profillerin karşılaştırılması sağlanmaktadır. Tekrarlanabilir polizom profillerini optimize etme ve üretme stratejileri tartışılmaktadır. Saccharomyces cerevisiae bu protokolde model organizma olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu protokol birçok farklı organizma ve hücre tipi için ribozom profilleri oluşturmak üzere kolayca değiştirilebilir ve uyarlanabilir.

Şekil 3'te üç temsili polizom profili gösterilmiştir. Tüm profiller aynı maya suşundan gelmektedir. Tipik bir polizom profili, 40S, 60S ve 80S ribozomal alt birimleri ve polizomlar için iyi çözülmüş zirvelere sahip olacaktır. Her ribozomal alt birimin tepesi ve polizom zirvesi her profilde belirgin olacaktır (Şekil 3). Otomatik yoğunluk fraksiyonasyon sisteminden temsili bir profil Şekil 3A'da gösterilmiştir. Bu profili oluşturmak i...

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Bu protokol, hücre içindeki ribozomların aktivitesi hakkında moleküler ayrıntıları ortaya çıkaran bir polizom profilinin nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu teknik, kullanıcıların otomatik gradyan fraksiyonasyon sistemlerine erişimi olmayan bir polizom profili tarafından sağlanan değerli bilgileri elde etmelerini sağlar. Degradeleri hazırlarken zaman ayırın ve gradyanları, doğrusal bir gradyana yerleşirken bir kompresör veya diğer mekanik işlemler tarafından bozulmayacakları bir yerde saklayın.Başlamak için, sakkaroz gradyan tamponunda% 7 ve% 47 sakkaroz stok çözeltileri hazırlayın. Filtre, sakkaroz stok çözeltilerini 0,22 mikronluk bir filtreyle sterilize eder. %7 ve %47'lik stok çözeltilerini dağıtarak ve karıştırarak 17, 27 ve %37 oranında sakkaroz çözeltisi hazırlayın.Altı polipropilen santrifüj tüpünü tam görünümlü bir test tüpü rafına yerleştirin. Tüpler arasında yeterli boşluk olduğundan emin olun, böylece bir tüple yapılan hareketler diğerlerini rahatsız etmez. Üç mililitrelik bir şırıngaya künt uçlu dokuz inçlik, 22 gauge bir iğne takın ve şırınganın gradyanları ayarlamadan önce sakkaroz çözeltisini damlamadan tutabilmesini sağlamak için bir test dolgusu yapın ve dağıtın.Her santrifüj tüpünün dibine iki mililitre %7 sakkaroz ekleyin. Daha sonra, iğne ucunu tüp tabanının hemen yakınına yerleştirerek% 7'lik çözeltinin altına% 17 sakarozun iki mililitresini ekleyin. Çözeltiyi dikkatlice ve yavaşça dağıtın.Prosedürü% 27, 37 ve% 47 sakkaroz çözeltisinin her biri iki mililitre ile tekrarlayın, her katmanın diğerinden yoğunlukların ayrılmasını gösteren bir çizgi ile ayırt edilebilmesini sağlayın. Gradyanları, sürekli, artan bir sakkaroz yüzdesine yerleşmelerini sağlamak için gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Mayanın büyümesi ve toplanmasından sonra, Saccharomyces cerevisiae hücreleri, soğutulmuş 700 mikrolitre polizom ekstraksiyon tamponunda hücreleri yeniden askıya alır.100 birim RNAse İnhibitörü ekleyin. Ardından, yaklaşık 425 ila 600 mikron boyutunda 400 mikrolitre önceden soğutulmuş cam boncuk ekleyin. Karışımı cam boncuklarla 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve maya hücrelerini beş dakika boyunca bir boncuk çırpıcıda kuvvetli ajitasyonla bozun.Hücreleri bozduktan sonra, santrifüjleme ile lizatı netleştirin. Floresan tabanlı bir RNA algılama sistemi kullanarak, absorbansı 260 nanometrede ölçerek arıtılmış lizattaki RNA konsantrasyonunu belirleyin. RNA konsantrasyonunun mikrolitre başına 0,5 ila bir mikrogram olduğundan emin olun.RNA konsantrasyonu çok düşükse, hücreleri askıya almak için kullanılan ekstraksiyon tamponunun hacmini azaltın. Lisatı dikkatlice gradyanların üstüne yükleyin. Pipet ucunu polipropilen tüpün üst kısmındaki iç duvara yaslayın.Tüpü açın ve lizatı yavaşça gradyanın üstüne dağıtın, duvara doğru sürün. Tüpleri yavaşça sallanan bir kova rotorunun önceden soğutulmuş kovalarına yerleştirin ve gradyanları santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüplerini sallanan kova rotorundan dikkatlice çıkarın ve bir tüp tutucuya yerleştirin.Fraksiyonları saklamak ve buz üzerinde önceden soğutmak için 96 kuyucuklu plakaları etiketleyin. Degradenin tepesinden başlayarak 100 veya 200 mikrolitre fraksiyonu toplayın, gradyanın üstüne dikkatlice bir pipet ucu yerleştirin ve tüm gradyan aliquote olana kadar fraksiyonları toplayın. Her fraksiyonun 254 nanometredeki emilimini,% 7 ve% 47 sakkaroz çözeltilerine karşı boşluk olarak bir spektrofotometre ile ölçün.Kesir sayısını absorbansa karşı çizerek çoklu profili oluşturun. Maya S.Cerevisiae'den üç temsili polizom profili gösterilmiştir. Her ribozomal alt birimin tepesi ve polizom zirvesi her profilde belirgindir.Otomatik yoğunluk fraksiyonasyon sisteminden temsili bir profil burada gösterilmiştir. Bu profil, sakkaroz gradyanı aşağıdan yukarıya doğru bir kovalama çözeltisi ile, bir dedektör akış hücresi aracılığıyla yer değiştirdiği ve fraksiyonlar halinde toplandığı için sürekli bir absorbans profilinden üretildi. 200 ve 100 mikrolitrelik numunelerin elle parçalanmasıyla oluşturulan polizom profili burada gösterilmiştir.Bu prosedürle hatırlanması gereken en önemli şey, gradyanları bozmamaktır. Hava kabarcıkları sokmamaya veya çözeltiyi çok hızlı dağıtarak gradyanı bozmamaya dikkat edin. Bu prosedürü takiben, RNA, aktif ribozomlarla ilişkili mRNA'ları belirlemek için daha fazla analiz için gradyanlardan ekstrakte edilebilir.

polysome-profiling-without-gradient-makers-or-fractionation-systems

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu makale, ökaryotik hücrelerde ribozom tercüme çıkarılması için bir protokol tanımlamaktadır. Bir kez çıkarılan, ribozom, farklı ribozomal popülasyonlar analiz izin vermek için sukroz gradient fraksiyonlandırmasıyla monosomes ve polyribosomes içine ayrılır. Gibi, bu yöntem çeviri düzenleme incelenmesi için altın standarttır.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Bu protokol, in vivo CNS numunelerin translatome incelemek amacıyla polyribosome fraksiyonasyon bölgesinin temel bir değişiklik göstermektedir. Bu, izolasyon ve bağlı RNA ribozom fraksiyonlarının toplam RNA ile karşılaştırılması, translasyon ve transkripsiyon düzenleme küresel değerlendirmesini sağlar.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Bu protokol, bağlı ribozom sayısına dayanarak bitki dokularından transkriptleri çıkarmak ve fraksiyonlamak için kolay bir yöntemi açıklar. Translasyon aktivitesinin küresel bir tahminine ve belirli mRNA'ların translasyon durumunun belirlenmesine izin verir.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Translasyonel yönetmelik protein bereket kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, kantitatif analiz tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeçeviri için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Burada sunulan protokol, ribozomlarla ilişkili mRNA'lar olan translatom'u, sakaroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yoluyla Arabidopsis'ten polisomal olmayan ve polisomal RNA'lara izole etmek için polisomal profillemeyi içerir. Bu yöntem, ısı stresli Arabidopsis'in çeviri verimliliğini göstermektedir.

Isı Stresi Altında Polizom Profilleri Kullanılarak Translasyon Verimliliği Testi

Öğrenin, otomatik fraksiyonasyon sistemleri olmadan polizom profili oluşturmayı. Bu yöntem, Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde ribozom aktivitesini analiz etmek için güvenilir bir alternatif sunar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Daha fazla video keşfet