Fiberoptik Konfokal Lazer Mikroendoskopi Kullanılarak Oküler İlaç Dağıtım Sistemlerinin Spatio-Temporal In Vivo Görüntülemesi

Bu protokol, değişikliklerin doku ikamet sürelerini nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için yeni formülasyonların taranmasını kolaylaştırır, bu da en uygun ilaç dağıtım sisteminin tasarlanmasında kritik öneme sahiptir. Bu teknik noninvazivdir ve hayvanların örnekleme için aşırı kullanımını azaltan gerçek zamanlı görüntülemeye izin verir. İlaç dağıtım sistemleri, sadece terapötik ilaç ve görüntüleme moiety'si bir nano taşıyıcıya dahil edilerek görüntüleme ve terapötik uygulamalar için yeniden tasarlanabilir.

Bu hem kanser tedavisinde hem de bulaşıcı hastalık tedavisinde yararlı uygulamalara sahiptir. Prosedürü gösteren rasha Msallam olacak, laboratuvarımdan kıdemli bir araştırma görevlisi. Başlangıç olarak, subkonjonktival enjeksiyondan iki saat önce, fareyi kuyruk yoluyla, evans mavisi veya EB kilogramı başına 2,5 miligram ile intravenöz olarak enjekte edin. Fareyi% 5 izofluran ile sakinleştirdikten sonra, fareyi bir burun konisine aktarın ve bir ısıtma yastığı üzerinde sakinleştirilmiş fareyi koruyun.

Daha sonra, enjekte edilecek gözün yanındaki bıyıkları kesin. % 0.5 proxymetacaine hidroklorür çözeltisini doğrudan göze aşılayın. Daha sonra, floresan lipozomlu 32 kalibrelik bir iğne ile donatılmış 10 mikrolitre cam şırınga yükleyin ve hava kabarcıklarının şırıngada bulunmadığından emin olun.

Bir cımbız kullanarak konjonktivayı kaldırın ve lipozomları yavaşça subkonjonktival alana enjekte edin, ardından iğneyi yavaşça geri çekerek geri akışı önleyin. Floresan lipozomlarla dolu bleb oluşumunu sağlayın. Göze% 1 fusitik asit damlası uygulayın ve fareyi kendine gelene kadar izleyin.

CLM sistemini aç. Sondayı CLM sistemine bağlayın. Bu noktada, edinme dosyalarının görüş alanını ve konumunu seçin.

Floresan DHPE için floresan algılamasının doğrusal aralıkta olduğundan emin olmak için lazer yoğunluğunu ayarlayın ve farklı zaman noktalarında çekilen görüntüler arasında karşılaştırma için yoğunluğu tutarlı tutun. Sistem 15 dakika ısındıktan sonra, her lazer için temizleme, durulama ve floro-4 çözeltilerini içeren kalibrasyon kitini kullanarak sistemi üreticinin talimatlarına göre kalibre edin. Kısaca, ucu temizleme şişesinde ve ardından durulama şişesinde beş saniye boyunca batırarak kalibre etmeye başlayın.

Arka plan kaydının problardaki arka plan değerlerini farklı liflerden normalleştirmesi için ucu havada bırakın ve görüntü homojenliği sağlayın. Yine, ucu temizleme şişesinde beş saniye ve ardından durulama şişesinde daldırin. Ardından, sinyal değerlerini normalleştirmek için ucu floro-4 488 nanometre içeren şişeye beş saniye daldırın.

Uç daldırma işlemi beş saniye boyunca temizleme şişesinde ve ardından durulama şişesinde tekrarlayın. Bir önceki adımda kaydedilen floresan sinyali kaybolana kadar ucu durulama şişesinde tutun. Ardından, probdaki farklı liflerden gelen sinyal değerlerini normalleştirmek için ucu floro-4 660 nanometre içeren şişeye aktarın.

Kalibrasyondan sonra, probun arka planı için değerin 100'den az olduğundan emin olun. Aksi takdirde, probun pamuk ucu aplikatörü ile tekrar tekrar temizlenmesini gerçekleştirin. Hayvan sıcaklığı kontrol cihazını bağlı bir ısıtma yastığı ile kapatın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Isıtma yastığını cerrahi bir örtü ile kaplattıktan sonra, burun konisini ısıtma yastığına sabitleyin. Bir indüksiyon odasında% 5 izofluran kullanarak fareyi sakinleştirdikten sonra, fareyi burun konisine aktarın ve sakinleştirilmiş fareyi bir ısıtma yastığı üzerinde saklayın. Daha sonra, göze bir damla anestezik% 0.5 proxymetacaine hidroklorür çözeltisi aşılayın.

Oküler yüzeyi yıkamak ve lensin kristalleşmesini önlemek için, birkaç tuzlu su damlası bırakarak gözleri yağlayın. Ardından, fare gözünü 0,67 kat büyütmede doğrudan odakta ergonomik olarak görüntülemek için mikroskobun göz merceği döndürün ve ayarlayın. Lazeri açın ve probu görüntülenecek göz bölgesine bir kalem gibi yerleştirin.

Ardından, ilgi çekici bölgedeki gözdeki floresanları gözlemlemek için kayıt edinimine başlayın. Tüm bölgeler işaretlendiğinde ve tam çerçevedeki prob konumunu tam olarak bilmek için göz haritasına göre etiketlendiğinde kaydı durdurun. Edinme dosyaları, daha önce seçilen konumda video dosyaları olarak otomatik olarak kaydedilir.

Floresan görüntüleme sklera ve kornea bölgeleri arasında belirgin bir farklılaşma olduğunu ortaya koydu. Episklera ve konjonktivanın yüksek vaskülerizasyonu sklera bölgesinin EB ile kırmızıya boyanmasını neden oldu. Vaskülat eksikliği olan kornea siyah görünüyordu. Yedi günlük çalışmada limbus ve skleranın kontrast floresanları gözlendi.

Floresan boya enjekte kontrol fareleri lipozom türevli floresan özgüllüğünü doğruladı. Floresan yoğunlukları birinci ve üçüncü günlerde yüksekti. Yeşil floresan zamanla limbus ve sklera bölgelerindeki lipozom azalmasını proxied.

Temporal limbus ve üstün limbus bölgelerinde enjeksiyon sonrası birinci günden üçüncü güne kadar floresan sinyallerindeki farklılıklar önemli değildi, bu da nötr lipozomların limbus bölgesine, özellikle kornea çevresine tercih edildiğini gösteriyordu. Enjeksiyon sonrası ilk gün zamansal ve üstün bölgeler için, skleradaki floresan limbüsten altı kat daha yüksekti. Üçüncü ve yedinci gün, lipozomlar zamansal ve üstün bölgelerdeki sklerada önemli ölçüde azaldı, oküler boşluk mekanizmalarına atfedildi.

Enjeksiyon bölgesinden uzaklık nedeniyle en düşük floresan miktarı burun ve alt bölgelerde tespit edildi. Kayıt durdurulmadan önce fleck çerçevelerini göz haritasına göre etiketlemek önemlidir. Lazer yoğunluğunu tutarlı tutun ve farklı denemelerde uygun karşılaştırma için maksimum arka plan değerini tanımlayın.

Kurşun formülasyonlarının tanımlanmasından sonra, ilacın biyoyararlanimini incelemek ve formülasyonlarının terapötik etkinliğini doğrulamak için hayvanlarda kapsamlı farmakokinetik ve biyodistribasyon çalışmaları yapılabilir.