Name: Mühendislik Nöral Benzeri Dokular için Murine Kortikal Astrositlerin 3D Biyobaskı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Keşfedin murine kortikal astrositlerin 3D biyobaskı yöntemiyle nöral benzeri doku üretimini. Bu teknik, nörolojik hastalıklarda astrosit fonksiyonlarını incelemek için gelişmiş in vitro modeller sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma São Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP), 2018/23039-3 ve 2018/12605-8 hibe numaraları tarafından desteklendi; Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Gelişim Konseyi (CNPq), 465656/2014-5 ve 309679/2018-4 hibe numaraları; ve Yükseköğretim Personelinin İyileştirilmesi Koordinasyonu (CAPES), mali kod 001.

Hayvanları içeren tüm prosedürler araştırmalarda hayvan kullanımı için uluslararası yönergelere uydu (http://www.iclas.org) ve Universidade Federal de São Paulo Araştırma Etik Komitesi (CEUA 2019/ 9292090519) tarafından onaylandı.
1. Farelerin beyin diseksiyonu
<ol><li>10 mL soğuk Hanks Tamponlu Tuz Çözeltisini (HBSS) 100 mm kültür yemeğine ve 1 mL'yi 1,5 mL mikrotüpe aktarın. Hayvan başına bir mikrotüp hazırlayın. NOT: Hem kültür yemeğinin hem de mikrotüplerin buzda tutulması gerekir.</li>
	<li>DMEM F12 + %10 Fetal Sığır Serumu (FBS), %2 glutamin ve %1 Penisilin-Streptomisidin (P/S) kullanarak astrosit kültür ortamını hazırlayın. 0,2 μm filtre kullanarak ortamı sterilize edin.</li>
	<li>Keskin bir çalışma makası kullanarak kafa keserek C57Bl /6 fare yavrularını (doğum sonrası 1 gün) ötenazi edin. Yaban tokası kullanarak, deriyi çekin ve kafatasını ortaya çıkarın. Hem makas hem de asaların %70 etanol ile sterilize olduğundan emin olun.</li>
	<li>Keskin kavisli bir uç makası kullanarak kafatasını foramen magnum'dan sagittal düzlem boyunca başın tepesine kesin. NOT: Ensefalik dokunun zarar görmemesine dikkat edin.</li>
	<li>Daha önce % 70 etanol ile sterilize edilmiş bir spatula kullanarak, beyni kraniyal boşluktan kaldırın ve 10 mL soğuk HBSS içeren kültür kabına yerleştirin.</li>
	<li>Beyni içeren kültür çanasını stereomikroskopun altına yerleştirin ve iki künt uçlu etops kullanarak menenjitleri beyinden çıkarın (Şekil 1).</li>
	<li>Kortikalleri bir spatula kullanarak beynin ortanca çizgisinden yavaşça uzaklaştırarak beynin geri kalanından ayırın.</li>
	<li>Her iki kortiği de toplayın ve hemen 1 mL soğuk HBSS içeren aynı mikrotüpe aktarın.</li>
</ol>2. Astrosit izolasyonu ve kültürü
<ol><li>Laminer akışın altında, kavisli bir mikro makas kullanarak kortikal dokuyu küçük parçalara ayırın ve 3x yukarı ve aşağı pipetleme yaparak 1 mL HBSS ile yıkayın. Dokunun oturmasını bekle. HBSS'yi çıkarın ve işlemi iki kez daha tekrarlayarak taze HBSS ekleyin.</li>
	<li>HBSS'yi çıkarın ve dokuyu 5 dakika boyunca 37 °C'de% 0.05 trypsin 1 mL ile kuluçkaya yatırın. NOT: Bu noktada sadece tripsin sindirimi yeterlidir.</li>
	<li>15x yukarı ve aşağı hafifçe pipetleme ile dokuyu mekanik olarak ayrıştırın. NOT: Dokunun tamamen ayrışması, süspansiyon bulanıklığındaki artış ve süspansiyonda büyük doku parçalarının bulunmaması ile gözlenir.</li>
	<li>Çözeltiyi 15 mL konik bir tüpe aktarın, eşit miktarda FBS ekleyerek tripsin aktivitesini nötralize edin ve ayrışmayan parçaları çıkarmak için çözeltiyi 0,4 μm hücre süzgeç filtresinde filtreleyin.</li>
	<li>Filtreyi 1 mL astrosit ortamıyla yıkayın, süzgeçten geçen hücre süspansiyonunu toplayın ve 200 x g ve 25 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peletin 1 mL astrosit kültür ortamında askıya alın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu bir T25 kültür şişesine aktarın, ortamın hacmini 3,5 mL'ye kadar yapın ve hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'dekuluçkaya haline getirin.</li>
	<li>24 saat sonra hücrelerin yapışmasını sağlayın. Ardından, ortamı değiştirin ve her 3 günde bir değiştirin.</li>
	<li>7 gün sonra, hücreleri 2 mL 1x PBS ile yıkayarak mikroglia ve oligodendrositleri kültürden çıkarın.</li>
	<li>PBS çözümünü astrosit kültür ortamıyla değiştirin ve kültür şişesini bir gecede 180 rpm'de bir yörünge çalkalayıcıda bırakın. NOT: Astrositler yaklaşık 10-12 günlük kültürde bir konfluent monolayer oluşturur.</li>
</ol>3. Jelatin methacryloyl sentezi (GelMA)
<ol><li>Porcine derisinden elde edilen 10 g jelatin tartın ve çözeltinin tamamen çözünene kadar 240 rpm ve 50 ° C'de bir ısıtma plakasında karıştırmasına izin vererek 100 mL PBS'de çözün.</li>
	<li>Bir kaputun altına, düşük bir fonksiyonelleştirme derecesi için 2 mL methakrilik anhidrit (MA) ekleyin ve jelatin emülsiyonunun 240 rpm ve 50 ° C'de 2 saat karıştırmasına izin verin. DİkKAT: MA tehlike beyanı: H302 + H332 (yutulursa veya solunursa zararlı), H311 (ciltle temas halinde toksik), 314 (ciddi cilt yanıkları ve göz hasarına neden olur), 315 (cilt tahrişi neden olur), H317 (alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir), H318 (ciddi göz hasarına neden olabilir), 331 (solunursa toksik), H332 (solunursa zararlı), H335 (solunum tahrişi neden olabilir). Kullanım kuralları: P261 (toz/duman/gaz/sis/buhar/sprey solumaktan kaçının), P305 + P351 + P338 + P310 (GÖZLERDEYSE: Birkaç dakika boyunca suyla dikkatlice durulayın. Varsa ve yapılması kolaysa kontakt lensleri çıkarın. Hemen bir ZEhİr MERKEZİ / doktor arayın), P301 + P312 + P330 (YUTULURSA: Kendinizi iyi hissetmiyorsanız ZEhİr MERKEZİ / doktor çağırin. Ağzı durulayın). NOT: MA'yı çok yavaş ekleyin, damla damla.</li>
	<li>Jelatin-MA çözeltisini 200 mL son hacim elde etmek için önceden ısıtılmış PBS 'nin (50 °C) 100 mL'sinde seyreltin ve çözeltinin 240 rpm ve 50 °C'de 10 dakika karıştırmasını sağla.</li>
	<li>~20 cm diyaliz zarını kesin (moleküler kesme 12-14 kDa) ve yumuşayana kadar deiyonize suya batırın. NOT: Delik veya kusur olmadığından emin olmak için zarları deiyonize suyla doldurun.</li>
	<li>Bir huni kullanarak jelatin-MA çözeltisini membranlara aktarın. NOT: Karışıma izin vermek için içeride fazladan alan bırakarak her iki tarafı da kapatın.</li>
	<li>Jelatin-MA çözeltisini içeren zarları diyaliz için 2 L damıtılmış su içeren bir kaba yerleştirin ve 5 gün boyunca 40 °C'de (500 rpm) karıştırmalarını sağlayın. NOT: Suyun buharlaşmasını önlemek için kabı örtün.</li>
	<li>Damıtılmış suyu günde iki kez değiştirin. Her seferinde, homojenizasyon için zarları ters çevirin.</li>
	<li>Beşinci gün, 200 mL önceden ısıtılmış ultra saf suyu (40 °C) diyalizlenmiş jelatin-MA'ya karıştırın ve 40 °C'de 15 dakika karıştırın.</li>
	<li>Jelatin-MA çözeltisini 25 mL'ye kadar 50 mL konik tüplere aktarın ve tüplerin 2 gün boyunca -80 ° C'de kalmasını bırakın. NOT: Liyofilizasyonu kolaylaştırmak için tüpleri yatay olarak saklayın.</li>
	<li>Donmuş çözeltileri 3-5 gün boyunca liyofilize edin ve nemden korunan liyofilize JelMA'yı saklayın.</li>
</ol>4. Bioink hazırlığı
NOT: 1 mL biyoink elde etmek için filtrasyon sırasında kayıplar olabileceğinden en az 3 mL biyomalzeme çözeltisi imal edilmesi önerilir.
<ol><li>Fibrinojen çözeltisinin hazırlanması<ol>
<li>Deiyonize suda salin çözeltisi (%0,9) hazırlayın ve 10 mg/mL konsantrasyon elde etmek için salin çözeltisinin 1 mL'sinde sığır plazmasından 10 mg fibrinojen çözün. NOT: Fibrinojen adsorblar olarak, fibrinojen çözeltisini hazırlamak için cam şişeler kullanmayın.</li>
		<li>Fibrinojenin tamamen çözünmesine kadar çözeltiyi 37 °C'de ajitasyon altında bırakın. NOT: Fibrinojen çözünmesi için, 37 °C'de bir fırının içine yerleştirilmiş bir döner sistem kullanın. 37 °C'de sıcak bir plaka üzerinde manyetik ajitasyon (180 rpm) fibrinojen de uygundur. Bu durumda, 10 mg/ mL fibrinojenin çözülmesi yaklaşık 40 dakika sürer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jelatin/GelMA çözeltisinin hazırlanması<ol>
<li>0,12 g jelatin tartın ve % 4 (w/v) jelatin nihai konsantrasyon elde etmek için önceden ısıtılmış PBS (40 °C) 1,9 mL'ye ekleyin. Çözülmeyi kolaylaştırmak için girdap.</li>
		<li>Emülsiyonun tamamen çözünene kadar 40 °C'de tutun.</li>
		<li>0.06 g lyophilized GelMA tartın ve % 2 (w/ v) JelMA son konsantrasyon elde etmek için jelatin çözeltisine aktarın. Çözülmeyi kolaylaştırmak için girdap.</li>
		<li>Çözeltiyi tamamen çözünene kadar 40 °C'de tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Astrosit yüklü jelatin/GelMA/fibrinojen biyoink hazırlanması<ol>
<li>Pipet 0.9 mL 10 mg/mL fibrinojen çözeltisi ve jelatin/ GelMA çözeltisine transfer 3 mg / mL fibrinojen nihai konsantrasyon elde etmek için.</li>
		<li>0.015 g fotoinitiatör (PI) tartın ve son konsantrasyonu elde etmek için jelatin / GelMA / fibrinojen çözeltisine aktarın% 0.5 (w / v) PI. Tüpü yukarı ve aşağı çevirerek çözeltiyi karıştırın ve PI bozulmasını önlemek için ışıktan korunarak 40 °C'de tutun. NOT: Biyoink'i maksimum 24 saat boyunca 4 °C'de stokla.</li>
		<li>Laminar akış altında, 0,2 μm filtre kullanarak çözeltiyi steril 15 mL konik tüpe filtreleyin. NOT: Filtrasyona izin vermek için biyomalzeme çözeltisi 37-40 °C'de olmalıdır.</li>
		<li>Biyomalzeme çözeltisinin 980 μL'lik kısmını 15 mL konik tüpe aktarın.</li>
		<li>100 μg/ mL stok çözeltisi elde etmek için laminin'i tuzlu çözeltide seyreltin.</li>
		<li>Pipet 20 μL laminin ve 2 μg / mL laminin nihai konsantrasyonu elde etmek için biyoink içeren tüpe aktarın.</li>
		<li>Kabarcıklardan kaçınarak yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Herhangi bir kabarcık devam ederse, konik tüpü 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin. Biyoink'i hücrelerle karışana kadar 37 °C'de tutun.</li>
		<li>Trypsinize birincil astrositler ile 0.05% trypsin 5 dk. NOT: 1 ile 3.</li>
		<li>Trypsin aktivitesini FBS ile 1:1 oranında nötralize edin ve hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin.</li>
		<li>Hücreleri sayın ve 1 x 106 hücreyi farklı bir konik tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin.</li>
		<li>Konik tüpün altına hafifçe dokunarak hücre peletini askıya almak için küçük bir hacim (~200 μL) bırakarak üstnatant çıkarın.</li>
		<li>1 mL jelatin/GelMA/fibrinojen çözeltisini hücreleri içeren tüpe aktarın ve homojenize etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipet, 1 x 106 hücre / mL'lik son bir konsantrasyon elde edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Çapraz bağlantı çözümünün hazırlanması
<ol><li>Trombin rekonsesi<ol>
<li>Steril deiyonize suda 15 mL konik tüpte %0,1 (w/v) sığır serum albümini (BSA) ile trombin 100 U/mL stok çözeltisi hazırlayın. -20 °C'de mikrotüplerde stokla. NOT: Trombin adsorbları cama olarak, stok çözeltisini hazırlamak veya aliquotları saklamak için cam şişeler kullanmayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trombin-CaCl2 çözeltisinin hazırlanması<ol>
<li>Pipet 100 μL trombin stok çözeltisi ve 1 U/mL trombin nihai konsantrasyon elde etmek için 8.9 mL steril deiyonize su içeren 50 mL konik tüpe aktarın.</li>
		<li>Deiyonize suda %10 (w/v) CaCl2 çözeltisi hazırlayın ve 0,2 μm filtre kullanarak sterilize edin.</li>
		<li>1:9 (CaCl2 ila trombin) nihai bir oran elde etmek için% 10 CaCl2 çözeltisinin 1.1 mL'sini trombin içeren konik tüpe aktarın. NOT: Çapraz bağlantı çözümünü denemede kullanılacak birimde hazırlayın ve depolamayı önleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Ekstrüzyon bazlı bir biyobaskı kullanarak biyobaskı astrosit yüklü biyoink
<ol><li>Sinir dokusunun tasarımı<ol>
<li>G kodunu kullanarak: X ve Y eksenindeki her biyobaskı çizgisi arasında 1 mm mesafe ve Z ekseninde 6 katman (her çizgi arasında 0,2 mm) 6 x 6 mm (kare şekil) ızgara oluşturun; ekstrüzyonu (E) 0,01 mm'ye ayarlayın ve Z ekseninin her yeni katmanında 0,001 mm artırın; ve yazdırma hızını (F) 400 mm/dk olarakayarlayın( Ek Bilgi ).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biyobaskı kurulumu<ol>
<li>Makineyi 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırak ve sonra% 70 etanol ile silin.</li>
		<li>Güç anahtarını kullanarak biyobaskıyı açın. Makineyi bir USB kablosuyla bilgisayara bağlayın. Biyobaskıya bağlamak ve dosya tasarımını yüklemek için kontrol yazılımını açın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biyobaskı şırındının hazırlanması<ol>
<li>Astrosit yüklü jelatin/GelMA/fibrinojen biyoink'i 1.000 μL pipet kullanarak 5 mL plastik şırınna aktarın. NOT: Kabarcık oluşumunu önlemek için yavaşça aktarın.</li>
		<li>Steril 22 G künt iğneyi şırıngaya bağlayın. NOT: Şırınnayı 4 °C'de 2 dakika bekletin.</li>
		<li>Şırınnayı biyobaskı baskı kafasına bağlayın ve kalan kabarcıkları çıkarmak için biyoink'i manuel olarak yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biyobaskı NOT: Biyobaskı laminar davlumbazın dışında gerçekleştirildi.<ol>
<li>Biyobaskı masasına 35 mm'lik bir kültür çanağı yerleştirin ve iğnenin hareket etmesini sağlamak için iğneyi kültür çanağı yüzeyinden 0,1 mm uzağa yerleştirin. NOT: Her biyobaskı için bir adet 35 mm kültür çanağı kullanın.</li>
		<li>Yazdır düğmesine basın.</li>
		<li>Biyobaskı bittikten sonra şırınnanın çanaktan uzaklaştığından emin olun. Ardından, kültür yemeğini kapatın ve çapraz bağlama işlemine hazırlanın. NOT: Bir yapının biyobaskı yaklaşık 1 dakika 10 s sürer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biyobaskı yapı ve kültürün çapraz bağlantısı<ol>
<li>Kültür çanağı UV ışığı altında GelMA çapraz bağlama için2 x 60 s (yukarı ve aşağı) için 2 mW/cm 2'ye yerleştirin.</li>
		<li>Laminar akışı altında, biyobaskılı yapıyı steril bir spatula kullanarak 24 kuyulu bir tabağa aktarın.</li>
		<li>500 μL trombin/CaCl2 çözeltisi ekleyin ve fibrin çapraz bağlantısına izin vermek için 30 dakika bekletin.</li>
		<li>Çapraz bağlama solüsyonunun çıkarın ve yapıyı 2 mL PBS 1x ile yıkayın. Ardından, PBS'yi 1 mL astrosit kültürü ortamı ile değiştirin ve 37 °C ve% 5 CO2'dekuluçkaya yatırın. Ortamı her 3 günde bir değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Astrositlerin uygulanabilirliğinin değerlendirilmesi
<ol><li>Biyobaskı astrositlerin uygulanabilirliği<ol>
<li>Biyobaskı yapıyı spatula kullanarak 35 mm'lik bir kültür çanağı içine aktarın.</li>
		<li>Yapıyı 1 mL 1x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Canlı/Ölü reaktifin 100 μL'lik kısmını yapının üzerine yatırın ve 37 °C'de 30 dakika boyunca tutun ve ışıktan koruyun.</li>
		<li>Canlı/Ölü reaktifini çıkarın ve yapıyı 1 mL 1x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Örneği bir spatula kullanarak konfokal bir çanağa aktarın ve görüntülerin elde edilmesi için 488 ve 570 nm uyarım kullanarak konfokal mikroskop altında yapı içindeki hücreleri gözlemleyin. NOT: Yapı içindeki hücrelerin genel bir görselleştirmesi için 10x büyütme kullanın.</li>
		<li>Numunenin düz oturduğundan emin olun. Gerekirse, düzlüğü artırmak için numunenin üzerine bir kapak yerleştirin. NOT: Görüntüleme sırasında, numunenin kurumasını önlemek için konfokal kabın iyice kapatıldığından emin olun.</li>
		<li>Hesaplamalı bir yazılım kullanarak uygulanabilir (yeşil) ve ölü (kırmızı) sayısını hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2D astrosit kültürünün uygulanabilirliği<ol>
<li>Tohum 0,5 x10 6 astrosit (geçiş 1-3) 35 mm konfokal bir tabakta, astrositler orta ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO2'dekuluçkaya yatır .</li>
		<li>Hücreler birleştiğinde, kültür ortamını çıkarın ve 1 mL 1x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Live/Dead reaktifinin 200 μL'sini biriktirin ve çanağı ışıktan korunarak 37 °C'de 30 dakika tutun.</li>
		<li>Canlı/Ölü reaktifini çıkarın ve hücreleri 1 mL 1x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Yemeği dijital kamerayla birleştiğinde konfokal mikroskopa alın ve görüntü elde etmek için 488 ve 570 nm heyecan verici kullanın.</li>
		<li>Hesaplamalı bir yazılım kullanarak uygulanabilir (yeşil) ve ölü (kırmızı) sayısını hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Astrositlerin immünositleri
<ol><li>3D biyobaskılı astrositlerin glial fibril asidik protein (GFAP) boyanma NOT: Diğer hücre belirteçlerinin varlığını araştırmak için birincil antikoru buna göre değiştirin.<ol>
<li>Ortamı kuyudan çıkarın ve yapıyı 1 mL 3x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Yapı tamamen kaplanana kadar kuyuya PBS'de % 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve 4 °C'de 2 saat bekletin.</li>
		<li>PFA'yı çıkarın ve yapıyı 1 mL 3x PBS ile yıkayın. NOT: PBS'de 4 °C'de saklanırsa bu prosedür birkaç ay duraklatılabilir. PBS buharlaşmasını önlemek için kuyu plakasının kapalı olduğundan emin olun.</li>
		<li>Numuneyi 5 dakika boyunca glisinin 0.1 mol / L ile tedavi edin.</li>
		<li>5 dakika boyunca 1 mL 1x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Orbital ajitasyon altında 25 °C'de 1 saat boyunca %0,1 Triton X-100 ve %10 FBS içeren PBS ile numuneyi permeabilize edin.</li>
		<li>Yapıyı bir gecede 4 °C'de tavuk anti-GFAP (birincil antikor seyreltme 1:500) ile kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Birincil antikoru epire edin ve numuneyi 1 mL PBS ile 5 dakika, 3 kez yıkayın. NOT: Primer antikor 4 °C'de depolandığında birkaç kez tekrar kullanılabilir.</li>
		<li>Örneği Alexa flor 488 konjuge anti-tavuk (ikincil antikor seyreltme 1:500) ve 1 μg/mL DAPI ile yörüngesel ajitasyon altında 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Numuneyi ışıktan koruyun.</li>
		<li>Numuneyi 1 mL PBS ile 5 dakika, 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Yapıyı 35 mm konfokal bir tabağa aktarın. NOT: Numunenin kurumasını önlemek için kabın iyi kapalı olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2B astrosit kültürünün glial fibril asidik protein (GFAP) boyanma<ol>
<li>Tohum 0,5 x10 6 astrosit (geçiş 1-3) 35 mm konfokal bir tabakta, astrositler orta ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO2'dekuluçkaya yatır .</li>
		<li>Hücreler birleştiğinde, kültür ortamını çıkarın ve 1 mL 1x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>8.1.2-8.1.10 adımlarını yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Astrositler sitoskeleton boyama<ol>
<li>8.1.1-8.1.6 adımlarını yineleyin.</li>
		<li>PBS'ye 200 μL 50 μg/mL floresan konjuge phalloidin çözeltisi ve yapının üzerine 1 μg/mL DAPI ekleyin.</li>
		<li>Yörüngesel ajitasyon altında 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yatarak numuneyi ışıktan korur.</li>
		<li>Numuneyi 1 mL PBS ile 5 dakika 3 kez yıkayın ve yapıyı bir spatula kullanarak konfokal bir tabağa aktarın. NOT: Numunenin kurumasını önlemek için kabın iyi kapalı olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Konfokal görüntüleme
<ol><li>Bulaşıkları görüntüleme için dijital kamera (359, 488 ve 570 nm eksilme) ile birleştirilmiş bir konfokal mikroskopa alın.</li>
	<li>Genel bir görselleştirme için 10x ve hücrelerin yakınlaştırılmış görüntüleri için 40 veya 63x büyütme kullanın. NOT: Numunenin düz oturduğundan emin olun. Gerekirse, düzlüğü artırmak için numunenin üzerine bir kapak yerleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+Role+and+functions+in+brain+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: Role and functions in brain pathologies.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1114(2019).</li>
<li>Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+astrocytes+and+their+potential+as+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).</li>
<li>Giovannoni, F., Quintana, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+astrocytes+in+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of astrocytes in CNS inflammation.</a> Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).</li>
<li>Escartin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocyte+nomenclature%2C+definitions%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions.</a> Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).</li>
<li>Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+response+in+neuroinflammation%3A+The+role+of+leukocytes%2C+microglia+and+astrocytes+in+neuronal+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival.</a> Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).</li>
<li>Liddelow, S. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes%3A+Production%2C+function%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential.</a> Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).</li>
<li>Clarke, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+aging+induces+A1-like+astrocyte+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unied+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes+isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079(2013).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Knight, E., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+3D+cell+culture+technologies+enabling+tissue-like+structures+to+be+created+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).</li>
<li>Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+neural+tissue+models%3A+From+spheroids+to+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting.</a> Biomaterials. 154, 113-133 (2018).</li>
<li>Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+environment+sustains+morphological+heterogeneity+and+promotes+phenotypic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression.</a> Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).</li>
<li>Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+3D+glial+cell+culture+systems+and+applications+for+neurodegeneration+and+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation.</a> SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).</li>
<li>Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+neurospheroid+niche+model%3A+optimizing+embedded+3D+bioprinting+for+fabrication+of+neurospheroid+brain-like+co-culture+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs.</a> Biofabrication. , (2020).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional-bioprinted+dopamine-based+matrix+for+promoting+neural+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).</li>
<li>de la Vega, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+tissues+using+a+novel+lab-on-a-printer+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology.</a> Applied Sciences. 8 (12), 2414(2018).</li>
<li>Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombin-fibrinogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The thrombin-fibrinogen interaction.</a> Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).</li>
<li>Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+factor+XIII+in+fibrin+clot+formation+and+effects+of+genetic+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms.</a> Blood. 100 (3), 743-754 (2002).</li>
<li>Yue, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+properties%2C+and+biomedical+applications+of+Gelatin+Methacryloyl+%28GelMA%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels.</a> Biomaterials. 73, 254-271 (2015).</li>
<li>de Melo, B. A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+use+fibrinogen+as+bioink+for+3D+bioprinting+fibrin-based+soft+and+hard+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues.</a> Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin-based+hydrogels+for+organ+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting.</a> Polymers (Basel). 9 (9), 401(2017).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Naure.+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).</li>
<li>de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+models+of+neural+tissues%3A+The+current+state+of+the+field+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions.</a> Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>Hanu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocarboxylic+acid+transporters%2C+MCT1+and+MCT2%2C+in+cortical+astrocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).</li>
<li>Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cortical+astrocyte+subpopulation+inhibits+axon+growth+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).</li>
<li>Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+engineered+aligned+astrocyte+networks+to+recapitulate+developmental+mechanisms+and+facilitate+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848(2018).</li>
<li>East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+3D+culture+model+facilitates+monitoring+of+astrocytes+undergoing+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).</li>
<li>Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+conditions+differentially+affect+astrocyte+modulation+of+brain+endothelial+barrier+function+in+response+to+transforming+growth+factor+B1%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1.</a> Brain Research. 1608, 167-176 (2015).</li>
<li>Abelseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+of+neural+tissues+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+fibrin-based+bioink%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).</li>
<li>Filippo, T. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL12+N-terminal+end+is+sufficient+to+induce+chemotaxis+and+proliferation+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells.</a> Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).</li>
<li>Galindo, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+impairs+neural+stem+cell+migration+through+ROCK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation.</a> Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).</li>
<li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+definition+of+bioinks+and+their+distinction+from+biomaterial+inks%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks.</a> Biofabrication. 11 (1), 03001(2018).</li>
<li>Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printability+of+candidate+biomaterials+for+extrusion-based+3D+printing%3A+state-of-the-art%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).</li>
<li>Blaeser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+shear+stress+in+3D+bioprinting+is+a+key+factor+to+balance+printing+resolution+and+stem+cell+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).</li>
<li>Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+sol-gel+transition+of+gelatin+in+terms+of+water+activity+in+various+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions.</a> Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).</li>
<li>Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+tuning+of+facile+one-pot+Gelatin+Methacryloyl+%28GelMA%29+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis.</a> Science Reports. 6, 31036(2016).</li>
<li>Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variations+in+stiffness+in+live+mouse+brain+tissue+determined+by+depth-controlled+indentation+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping.</a> Science Reports. 8 (1), 12517(2018).</li>
<li>Iwashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+brain+stiffness+among+amniotes+using+glyoxal+fixation+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619(2020).</li>
<li>Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stiffness+of+living+tissues+and+its+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering.</a> Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).</li>
<li>Ye, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+of+gelatin+methacrylate-based+nerve+guidance+conduits+with+multiple+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+and+Design%22%5BJournal%5D)">3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels.</a> Materials and Design. 192, 108757(2020).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+the+stiffness+of+GelMA+substrate+on+the+outgrowth+of+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells.</a> Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+hydrogels+induce+mixed+dorsal%2Fventral+spinal+neuron+identities+during+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).</li>
<li>Arulmoli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+scaffolds+of+salmon+fibrin%2C+hyaluronic+acid%2C+and+laminin+for+human+neural+stem+cell+and+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).</li>
<li>Brenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GFAP+in+CNS+Injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience.+Letters%22%5BJournal%5D)">Role of GFAP in CNS Injuries.</a> Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir ihtilafı yoktur.

3D biyobaskı teknolojisi, yapısal ve fizyolojik olarak doğal dokulara benzeyen rafine yapıların mühendisliğine izin veren bir biyofabrikasyon alternatifi olarak ortaya çıkmıştır22, beyindahil 23. Nöral benzeri dokuların biyofabrikasyonu, CNS11'ietkileyen birçok hastalığın gelişimi ve tedavisi ile ilişkili hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için önemli bir araç olan in vitro yerel mikroçevre modellemesine izin verir. Glial hücrelerin...

Astrositler Merkezi Sinir Sistemi'ndeki (CNS) en bol hücre tipidir ve beyin homeostazında önemli bir rol oynar. Kalıcı nöronal desteğe ek olarak, astrositler nörotransmitter alımını modüle etmekten, kan-beyin bariyer bütünlüğünü korumaktan ve nöronal sinaptogenez1,2'yi düzenlemekten sorumludur. Astrositler ayrıca CNS iltihabında önemli bir role sahiptir, astrosit reaktivitesine veya reaktif astrogliosis3,4, dejeneratif ajanlara sağlıklı doku ekspozisyonlarını önleyen bir glial skar oluşturan bir süreçte beyindeki yaralanmalara yanıt verir5. Bu olay astrositlerin gen ekspresyonunda, morfolojisinde ve fonksiyon 6 ,7 'dedeğişikliklerlesonuçlanır. Bu nedenle, astrositlerin işlevselliğini içeren çalışmalar, nörolojik bozuklukları tedavi etmek için tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olur.
İn vitro modeller nörolojik yaralanmalarla ilgili mekanizmaları incelemek için çok önemlidir ve başarılı izolasyon ve kortikal astrositlerin iki boyutlu (2D) kültürü oluşturulmuş olmasına rağmen8, bu model yerel hücre davranışını taklit eden gerçekçi bir ortam sağlayamaz ve beynin karmaşıklığını yeniden üretememektedir9 . 2D durumda, zayıf mekanik ve biyokimyasal destek, düşük hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri ve bazal-apikal polaritenin yokluğuna yol açan hücre düzleştirme, hücre sinyal dinamiklerini ve tedavilere yanıtı tehlikeye atan değiştirilmiş hücre morfolojisi ve gen ekspresyona yol açan deneysel sonuçları etkiler10. Bu nedenle, sonuçları kliniğe çevirmeyi amaçlayan daha gerçekçi bir sinir ortamı sağlayan alternatifler geliştirmek çok önemlidir.
Üç boyutlu (3D) hücre kültürü, CNS11de dahil olmak üzere organların ve dokuların artan sadakat özellikleriyle yeniden özetleyen daha gelişmiş bir modeli temsil eder. Glial kültür ile ilgili olarak, 3D modeller astrosit morfolojisinin, hücre bazal-apikal polaritesinin ve hücre sinyalinin korunmasına katkıda bulunur12,13. 3D biyobaskı teknolojisi, yerel dokuların yapısını ve özelliklerini yeniden oluşturmak için hücreler ve biyomalzemeler kullanarak 3D canlı dokuları kontrollü bir şekilde biyofabrik hale getirmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknolojinin kullanımı sonuç tahmininin önemli ölçüde iyileşmesine yol açmış ve CNS14 , 15,16'ya uygulanan rejeneratif tıbba katkıdabulunmuştur.
Burada açıklanan protokol kortikal astrositlerin izolasyonu ve kültürünü detaylandırıyor. Protokol ayrıca, laminin ile desteklenmiş jelatin / jelatin methacryloyl (GelMA) / fibrinojene gömülü biyobaskı astrositleri için tekrarlanabilir bir yöntemi detaylandırıyor. Bu çalışmada kortikal astrositler içeren biyomalzeme bileşimi 1 x 106 hücre/mL yoğunlukta yazdırmak için ekstrüzyon bazlı bir biyobaskı kullanılmıştır. Baskı hızı kontrol altına alarak biyobaskı kesme stresi en aza indirilmiş ve astrositler işlemden sonra yüksek canlılık göstermiştir. Biyobaskılı yapılar 1 hafta boyunca kültürlendi ve astrositler hidrojel içinde yayılabildi, bağlanabildi ve hayatta kalabildi, astrositik morfolojiyi korudu ve belirli bir belirteç glial fibrili asidik proteini (GFAP)ifade etti 4.
Bu prosedür piston tahrikli ekstrüzyon bazlı biyobaskılarla uyumludur ve farklı kaynaklardan elde edilen biyobaskı astrositleri için kullanılabilir. Burada önerilen 3D biyobaskı modeli, sağlıklı dokularda astrosit işlevselliğinde yer alan mekanizmaların çalışmaları ve nörolojik patolojilerin ilerlemesini ve tedavi gelişimini anlamak gibi çok çeşitli sinir mühendisliği uygulamaları için uygundur.

<table><tbody><tr><td>3D Biyoyazıcı</td><td>3D Biyoteknoloji Çözümleri</td><td></td><td>Ekstrüzyon tabanlı biyoyazıcı</td></tr><tr><td>Künt uçlu forseps</td><td>Integra Miltex</td><td>6--30</td><td>Beyin diseksiyonu için forseps önceden sterilize edilmiş</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Proteaz içermez, yağ asidi içermez, esasen globulin içermez</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>156340</td><td>Kültür şişesi T25</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td>Hücre süzgeci 40 ve mikro; m</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Konfokal TCS SP8 mikroskobu, Olympus FluoView 300 konfokal sistem ile birleştirilmiş</td></tr><tr><td>Konik tüpler</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>339651, 339652</td><td>15 mL ve 50 mL'lik steril tüpler</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab224589</td><td>DAPI boyama solüsyonu</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>12500062</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco'nun Mod. Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Karışımı) L-glutamin</td></tr><tr><td>Dyalisis tüpü</td> ile <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9527</td><td>Moleküler ağırlık kesme = 14 kDa</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-15-5</td><td>Reaktif sınıfı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>12657011</td><td>Araştırma Sınıfı</td></tr><tr><td>Fibrinojen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-32-5</td><td>Sığır plazmasından Fibrinojen kristalin tozu</td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td>Domuz derisinden jelatin tozu</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-40-6</td><td>Glisin tozu</td></tr><tr><td>Hanks Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS)</td> <td>Gibco; Yaşam Teknolojileri A.Ş</td><td>. 14175095</td><td>Kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol yok kırmızı</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-85-9</td><td>L-Glutamin kristal toz</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td>Laminin 1-2 mg / mL L 50 mM Tris-HCl</td></tr><tr><td>Canlı ölü kiti hücre görüntüleme kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>R37601</td><td>Canlı hücrelerde yeşil floresan (ex/em 488 nm/515 nm). Ölü hücrelerde kırmızı floresan (ex/em 570 nm/602 nm)</td></tr><tr><td>Metakrilik anhidrit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>760-93-0</td><td>GelMA hazırlama</td></tr><tr><td>mikrotüpleri</td> için <td>Corning Incorporated</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Mikrotüpleri Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>İğne 22G</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1362045</td><td>Steril künt iğne</td></tr><tr><td>Çalıştırma makas</td><td>Integra Miltex</td><td>05--02</td><td>Beyin diseksiyonu için keskin makas önceden sterilize edilmiş</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Paraformaldehit tozu</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>15070063</td><td>Pen Strep (5.000 Ünite / mL Penisilin; 5.000 ug / mL Streptomisin)</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Corning Incorporated</td><td>430591, 430588</td><td>35 ve 100 mm steril petri kapları</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>iFluor 488 reaktif</td></tr><tr><td></td><td>Foto başlatıcı Sigma-Aldrich</td><td>106797-53-9</td><td>2-Hidroksi-4 ve prime;-(2-hidroksietoksi)-2- metilpropiyofenon</td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin (PBS)</td> <td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>10010023</td><td>PBS 1 x, kültür sınıfı, kalsiyum yok, magnezyum yok</td></tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25988-63-0</td><td>Poli-L-lizin hidrobromür mol wt 30.000-70.000</td></tr><tr><td>Birincil antobody</td><td>Abcam</td><td>ab4674</td><td>Tavuk poliklonal - GFAP</td></tr><tr><td>İkincil antikor</td><td>Abcam</td><td>ab150176</td><td>Alexa fluor 594 anti-tavuk</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Miltex</td><td>V973-70</td><td>Numara 24 çimento spatula önceden sterilize edilmiş</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Fisherbrand</td><td>3000038</td><td>Beyin diseksiyonu için mikroskop</td></tr><tr><td>Şırınga 5 mL</td><td>BD</td><td>1222C84</td><td>Steril şırınga</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi 2 ve mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-105</td><td>Sterilizasyon için polipropilen filtre</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002--04-4</td><td>Sığır plazmasından trombin kristalin tozu</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Laboratuvar sınıfı</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>15400054</td><td>Tripsin fenol içermez, kırmızı 1 x PBS</td></tr><tr><td>Versene çözeltisi</td><td>Gibco'da seyreltilmiş; Life Technologies Corporation</td><td>15040066</td> PBS Kuyu plakasının <td>litresi başına 0,2 g EDTA(Na4) olarak formüle edilmiş Versene Çözeltisi (0,48 mM)</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>144530</td><td>Steril 24 oyuklu plaka</td></tr></tbody></table>

mühendislik nöral benzeri dokular için murine kortikal astrositlerin 3d biyobaskı

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrositler, nöronal destek ve işlevsellik de dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminde (CNS) önemli bir role sahip glial hücrelerdir. Bu hücreler ayrıca sinirsel yaralanmalara yanıt verir ve dokuyu dejeneratif olaylardan korumak için hareket eder. Astrositlerin işlevselliğinin in vitro çalışmaları, bu tür olaylarda yer alan mekanizmaları aydınlatmak ve nörolojik bozuklukları tedavi etmek için tedaviler geliştirmeye katkıda bulunmak için önemlidir. Bu protokol, astrositler bakımından zengin sinir benzeri bir doku yapısını 3D biyobaskı astrosit yüklü biyoink ile biyofabrik hale getirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu çalışmada ekstrüzyon bazlı bir 3D biyobaskı kullanıldı ve C57Bl/6 fare yavrularının beyin kortikallerinden astrositler çıkarıldı. Biyoink, kortikal astrositlerin 3. 3D biyobaskı koşulları hücre stresini en aza indirerek, hücrelerin% 74.08'inin ±% 1.33'ünün biyobaskıdan hemen sonra uygulanabilir olduğu işlem sırasında astrositlerin yüksek canlılığına katkıda bulundu. 1 haftalık inkübasyondan sonra, astrositlerin canlılığı önemli ölçüde% 83.54'e ±% 3.00'e yükseldi ve bu da 3D yapının hücre büyümesi için uygun bir mikroçevrasyonu temsil ettiğini gösteriyor. Biyomalzeme bileşimi hücre bağlanmasına izin verdi ve astrositik davranışı uyardı, hücreler spesifik astrosit belirteci glial fibril asidik proteini (GFAP) ifade etti ve tipik astrositik morfolojiye sahip oldu. Bu tekrarlanabilir protokol, hücrelerin yerel mikroçevresine benzeyen astrositler bakımından zengin 3D sinir benzeri dokuyu biyofabrilleştirmek için değerli bir yöntem sağlar, astrositlerin işlevselliğini ve nörolojik hastalıklarda yer alan mekanizmalarla ilişkilerini anlamayı amaçlayan araştırmacılar için yararlıdır.

Bu çalışma, katman katman primer astrositler yüklü jelatin /GelMA/fibrinojen biyoink biriktirmek için 3D biyobaskı teknolojisini kullanarak sinir benzeri bir doku geliştirmeyi amaçlamaktadır. Astrositler, canlı bir 3D yapının biyofabrikasyonuna izin vererek biyomalzeme bileşimine eklenen fare yavrularının serebral korteksinden çıkarıldı ve izole edildi .
Bilgisayar destekli tasarım (CAD), besin maddelerinin ve oksijenin difüzyonunu kolaylaştırmayı amaçlayan, 1 mm'...

Burada, merkezi sinir sistemindeki astrositlerin işlevselliğini ve nörolojik hastalık ve tedavilerde glial hücreleri içeren mekanizmaları incelemek için nöral benzeri dokuların biyofabrik olarak tanımlanması için 3D biyobaskı murine kortikal astrositlerin bir yöntemini rapor ediyoruz.

Mühendislik Nöral Benzeri Dokular için Murine Kortikal Astrositlerin 3D Biyobaskı

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Astrositlerin 3D biyobaskı, nörolojik hastalıkta yer alan mekanizmaları anlamak için yararlı olan in vitro modellerin biyofabrikasyonuna izin veren nöro doku mühendisliğinde bir ilerlemeyi temsil eder. 3D biyobaskılamanın temel avantajı, dokuların biyokimyasal ve mekanik özelliklerini taklit eden hücre yardımcı yapılarını biyofabrik haline getirmek, sağlık ve hastalıkta hücre dinamiklerinin daha iyi anlaşılmasını sağlamaktır. Bu protokol, doğal polimerler ve hücre dışı matris bileşenlerinden oluşan bir biyo-mürekkecin 3D biyobaskısına dayandığı için diğer yumuşak dokuların biyofabrikasyonuna uygulanabilir.Başlangıç olarak, ötenazili fareden izole edilmiş kortikal dokuyu kavisli bir mikro makasla küçük parçalara bölün. Doku parçalarını yukarı ve aşağı pipetleme ile bir mililitre HBSS ile üç kez yıkayın. Üçüncü kez eklenen HBSS'yi çıkardıktan sonra, bir mililitre% 0.05 tripsin ekleyin ve dokuyu 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya bırakın.Mekanik doku ayrışması için, doku tripsin karışımını 15 kez hafifçe pipetleyin. Daha sonra, ayrışmış karışımı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tripsin aktivitesini nötralize etmek için eşit miktarda FBS ekleyin. Ayrışmayan parçaları çıkarmak için süspansiyonu 0,4 mikrometre hücre süzgeç filtresinden geçirin.Filtreyi bir mililitre astrosit ortamıyla yıkayın. Pelet, santrifüjleme ile filtrelenmiş hücre süspansiyonunu indirdi. Süpernatant attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre astrosit kültür ortamında askıya alın.Hücre süspansiyonu bir T25 kültür şişesine aktarın. Toplam 3,5 mililitrelik orta hacmi oluşturan ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kuluçkaya yatırarak. Mililitre başına üç miligramlık son konsantrasyonda fibrinojen elde etmek için, mililitre fibrinojen çözeltisi başına 10 miligramın 0,9 mililitresini jelatin-jelatin methacryloyl çözeltisine aktarın.Fotoğraf başlatıcıyı hacme göre% 0,5 ağırlıkta son konsantrasyonda elde etmek için, hazırlanan jelatin-jelatin methacryloyl fibrinojen çözeltisine 0,015 gram fotoğraf başlatıcısı ekleyin. Girdaplamadan sonra, PI bozulmasını önlemek için çözeltiyi ışıktan korunarak 40 santigrat derecede tutun. Daha sonra, çözeltiyi 0,2 mikrometre filtreden steril 15 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin.Biyomalzeme çözeltisinin 980 mikrolitresini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Mililitre başına iki mikrogramın son konsantrasyonunda laminin elde etmek için, biyo-mürekkep içeren tüpe 20 mikrolitre seyreltilmiş laminin ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, kabarcıklardan kaçınarak hafifçe karıştırın ve biyo-mürekkep çözeltisini hücrelerle karışmaya hazır olana kadar 37 santigrat derecede tutun.Birincil astrositleri 5 dakika boyunca %0,05 trypsin ile deneyin ve FPS ile tripsin aktivitesini bire bir oranında nötralize edin. Ardından, hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de 15 mililitrelik konik tüpe ve santrifüje aktarın. Hücreleri saydıktan sonra, 1 kez 10'u 6 hücreye, gösterildiği gibi farklı bir konik tüpe ve santrifüje aktarın.Tüpte sadece 200 mikrolitre süpernatan bırakın ve konik tüpün altına hafifçe dokunarak hücre peletini askıya alın. Mililitre başına 6 hücreye 1 kez 10'luk son bir konsantrasyon elde etmek için, bir mililitre jelatin-jelatin methacryloyl fibrinojen çözeltisini hücreleri içeren tüpe aktarın ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin. Jelatin-jelatin methacryloyl fibrinojen biyo-mürekkep çözeltisine yerleştirilmiş astrositleri yavaşça beş mililitre plastik şırıngaya aktarmak için 1000 mikrolitre pipet kullanın, kabarcık oluşumunu önler.Steril 22 kalibrelik künt iğneyi şırıngaya bağlayın. Biyobaskıyı 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın ve ardından biyobaskıyı% 70 etanol ile silin, ardından şırınnayı biyobaskı baskı kafasına bağlayın ve kalan kabarcıkları çıkarmak için biyo mürekkeyi manuel olarak yıkayın. Biyobaskı yapmak için, biyobaskı masasına 35 milimetre kültür çanağına yerleştirin, iğnenin hareket etmesine izin vermek için iğneyi kültür çanağı yüzeyinden 0,1 milimetre uzağa yerleştirin ve Yazdır düğmesine basın.Biyobaskı bittikten sonra şırınnanın yemekten ve yakın kültür çanağından uzaklaştığından emin olun. Jelatin methacryloyl çapraz bağlama için kültür çanağı UV ışığı altına yerleştirin. Biyobaskı yapıyı 24 kuyu plakasına aktarmak için steril bir spatula kullanın.500 mikrolitre trombin kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin ve fibrin çapraz bağlanmasına izin vermek için 30 dakika bekletin. Çapraz bağlama çözeltisini çıkardıktan sonra, yapıyı iki mililitre PBS ile yıkayın, ardından PBS'yi bir mililitre astrosit kültür ortamıyla değiştirin. 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte kuluçkaya yatırın ve ortamı her üç günde bir değiştirin.Biyobaskı yapıyı 35 milimetrelik bir kültür çanağına aktarmak için bir spatula kullanın. Yapıyı bir mililitre PBS ile yıkayın. Canlı ölü reaktifin 100 mikrolitresini yapının üzerine yatırın ve ışıktan korunarak 37 santigrat derecede 30 dakika tutun.Canlı ölü reaktifi çıkardıktan sonra, yapıyı gösterildiği gibi PBS ile yıkayın. Örneği bir konfokal çanağa aktarın ve görüntü elde etmek için 488 ve 570 nanometre uyarım kullanarak konfokal mikroskop altında yapı içindeki hücreleri gözlemleyin. 3D biyobaskıdan sonra, biyobaskılı iskelenin bütünlüğü tahmin edildi ve biyomalzeme içinde yer alan hücrelerle iyi tanımlanmış bir yapının oluşumu gözlendi.Biyobaskı ve çapraz bağlama işlemlerinden sonra, yapı bir astrosit ortamı ile inkübe edildiğinde çoğu hücre yuvarlak morfoloji sundu. Biyobaskılı iskeleler yedi günlük inkübasyondan sonra bütünlüğünü korudu ve bazı yuvarlak hücreler gözlenmesine rağmen, birçok astrosit yapı boyunca yayıldı ve astrositik morfoloji ve ara bağlantı sundu. Hücre canlılığı biyobaskıdan hemen sonra değerlendirildi ve sonuçlar, daha düşük hızda, canlı hücrelerin toplam hücrelerin% 74'üne kadar temsil ettiğini ve daha yüksek hızda biyobaskıda olan hücrelerden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi.Biyobaskılı astrositlerin uygulanabilirliği 2D kültürlü astrositlere normalleştirildi ve sonuçlar yedinci günde biyobaskı astrositlerinin canlılığını önemli ölçüde artırdığını gösterdi. Biyobaskıdan hemen sonra, astrositler yuvarlak morfoloji gösterdi ve ölü testlerle yaşadılar. Bir hafta sonra, astrositler yapıya yayıldı ve 2D kültürüne benzer farklı bir hücre morfolojisi sundu.3D biyobaskı astrositleri immünoforeziksiyon ile karakterize edildi. Biyobaskı yapısında yedi günlük inkübasyondan sonra, yıldız benzeri morfolojiye sahip oldukça yoğun astrositler gözlendi. Biyobaskılı astrosit hücreleri, yedi günlük biyobaskıdan sonra astrosit fenotipinin korunmasını gösteren spesifik astrosit belirteci glial fibril asidik proteini ifade etti ve bu sonuçlar biyo-mürekkep bileşiminin astrositlerin yapışıklığını, yayılmasını ve büyümesini teşvik etmek için biyouyumlu bir mikroçevre sağladığını göstermektedir.Biyobaskılı astrositler tarafından belirli genlerin ve hücre belirteçlerinin ekspresyonunun değerlendirilmesi, belirli uyaranları takip eden astrositary reaktivitesi gibi nöro doku benzeri fonksiyonun kanıtını sağlayacaktır. Bu protokol, biyomoleküllerdeki farklı hücre türlerinden oluşan daha karmaşık nöro benzeri yapıların biyofabrikasyonuna zemin hazırlayarak belirli nörojenik nişlerin taklitini sağlar.

3d-bioprinting-murine-cortical-astrocytes-for-engineering-neural-like

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, hidrojel mikro sütunlar içinde üç boyutlu astrosit iskeleleri oluşturmak için bir yöntem gösterir. Mikro kolonların içi kollajen ile kaplanmıştır. Kollajene yapışan ve daha fazla inkübasyon ile üç boyutlu bir iskeleye kendi kendine monte edilen astrositler tanıtılır.

Hidrojel Mikro Sütunlar İçinde Astrosit İskeleleri Oluşturmak için In Vitro Bir Yöntem

Video, bir biyomürekkep çözeltisinde süspanse edilmiş astrositleri kullanarak 3D biyo-baskılı bir yapı oluşturma sürecini göstermektedir. Biyobaskılı yapı, çapraz bağlandıktan sonra, astrosit yapışmasını ve yayılmasını kolaylaştırarak nöral benzeri doku oluşturur.

Murin Kortikal Astrositlerin 3D Biyobaskısı İçin Bir Yöntem

Floklanmış, koşullu onkojenik alellerle tasarlanmış ve viral Cre aracılı rekombinasyon yoluyla transforme edilmiş farelerden toplanan fenotipik vahşi tip astrositler ve nöral kök hücreler, astrositom patogenezini modellemek için kullanılabilir in vitro ve in vivo dönüştürülmüş hücrelerin sinjeneik, bağışıklığı yetkin yavruların beyinlerine ortotopik enjeksiyonu ile.

Modelleme Astrositom Patogenez İn Vitro Ve In Vivo Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Beynin karmaşık eylemlerine ilişkin içgörü, gelişmiş araştırma araçları gerektirir. Burada, beyin benzeri mimariye benzeyen yeni bir ipek kollajen bazlı 3D mühendislik nöral doku modelini gösteriyoruz. Model, nöronal ağ montajı, aksonal rehberlik, hücre-hücre etkileşimleri ve elektriksel aktiviteyi incelemek için kullanılabilir.

Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli

Biz kendi kendine montajı, üç boyutlu demetleri boyuna hizalanmış astrositik somata ve süreçlerin bir roman biomaterial encasement içindeki gelişimi vitrin. Bunlar "yaşam iskele santimetre uzunluğunda, genişletme hizmet edebilir henüz test-yatak nörogelişimsel mekanizmaları incelemek veya yönetmenlik nöronal göç ve/veya aksonal neuroregeneration kolaylaştırmak için mikron çaplı çapı sergileyen", mühendislik kılavuz.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Burada, iPSC'den türetilen nöronların ve astrositlerin 3D biyobaskılı kokültürlerini üretmek için bir protokol sunuyoruz. 96 veya 384 oyuklu formatlarda bir hidrojel iskele içinde üretilen bu kokültür modeli, 7 gün içinde yüksek baskı sonrası canlılık ve nörit büyümesi gösterir ve her iki hücre tipi için olgunluk belirteçlerinin ekspresyonunu gösterir.

Tarama Uygulamaları için İnsan iPSC'den Elde Edilen Nöron-Astrosit Kokültürlerinin Üç Boyutlu Biyobaskısı

Üretimli kas dokusu hastalığı modeli olarak hem de eti için alternatif bir kaynak olarak, rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahiptir. Burada fare miyoblast projenitör hücreleri ve elektrik sinyalleri tarafından uyarılması, bu durumda, bir kas yapısının mühendislik açıklanmaktadır.

Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular

Bu makalede ve beraberindeki video bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşımı kullanarak, fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bizim protokol sunuyoruz.

Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği

Test sistemleri olarak insan 3D tümör dokuları oluşturmak için yöntemler tarif edilmiştir. Bu teknolojiler, decellularized Biyolojik Vaskülarize İskele (BioVaSc), primer insan hücreleri ve bir akış biyoreaktör içinde dinamik koşullar altında hem de statik altında kültürlenebilir bir tümör hücre hattı, dayanmaktadır.

İnsan 3D Doku Mühendisliği<em&gt; In vitro</em&gt; Tümör Test Sistemi

Karmaşık dokunun son derece organize yapılarının oluşturulması için, birden fazla materyal ve hücre tipini entegre bir kompozitte bir araya getirmek gerekir.  Bu kombinatoryal tasarım, güçlü bir fibröz matris tabanı içeren iki farklı biyolojik olarak türetilmiş materyal ve yeni damar oluşumunu arttırmak için endotel hücreleri ile organa özgü katmanlı hücre tabakalarını içerir.

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Keşfedin murine kortikal astrositlerin 3D biyobaskı yöntemiyle nöral benzeri doku üretimini. Bu teknik, nörolojik hastalıklarda astrosit fonksiyonlarını incelemek için gelişmiş in vitro modeller sunar.

Mühendislik Nöral Benzeri Dokular için Murine Kortikal Astrositlerin 3D Biyobaskı

Daha fazla video keşfet