Name: Lignins ve Tanenlerin Nicel 31P NMR Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T13:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Keşfedin, lignin ve tanenlerin yapısal özelliklerini nicel 31P NMR ile analiz etme yöntemini. TMDP türevleme ve spektroskopi teknikleri, polifenol araştırmalarında hidroksi gruplarının hızlı ve güvenilir nicel analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma yıllar boyunca Kanada Pulp and Paper Research Institute, McGill University Montreal, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, National Science Foundation USA, Amerika Birleşik Devletleri tarım Bakanlığı ve Solvay şirketi gibi kuruluşları içeren çeşitli finansal ödüller tarafından desteklenmiştir.

Aşağıdaki akış şeması (Şekil 6), ligninlerin ve tanenlerin 31P NMR analizini yapmak için tüm deneysel protokolü özetlemektedir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig06.jpg"> Şekil 6: Ligninlerin ve tanenlerin 31P NMR analizi için prosedür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
1. Örnek ön işlem
<ol><li>Analit (lignin veya tanen örneği) bir aliquot'u (yaklaşık 100 mg) 40 °C'de ayarlanmış bir vakum fırınında gece boyunca kurulayın. NOT: 40 °C'den yüksek sıcaklıklar incelenen polifenollerin hassas yapısını kimyasal olarak değiştirebileceğinden sıcaklık seçimine özellikle dikkat etmek gerekir.</li>
	<li>Kuruduktan sonra, numuneyi oda sıcaklığına ulaşana kadar susuz bir kalsiyum sülfat kurutucuya hızla aktarın. Bu adım, numunenin ortamdan nemi emmesi için zorunludur.</li>
</ol>2. Solvent çözeltisi hazırlama
<ol><li>Susuz piridrin ve döterlenmiş kloroformu 1,6/1 (v/v) oranında karıştırarak 20 mL numune şişesinde bir piridin/döterlenmiş kloroform çözücü karışımı hazırlayın. DİkKAT: Piridrin ve döterlenmiş kloroformu manipüle ederken dikkat edin. Bu bileşikler yanıcı, zararlı ve toksiktir. Çözeltiyi uygun eldivenler kullanarak iyi havalandırılmış bir duman davlumbazında hazırlayın ve kullanın.</li>
	<li>Su izlerini gidermek için 3,2 mm peletlere 5-8 g iyi yıkanmış ve kurutulmuş aktif 5A moleküler elek ekleyin. Ek olarak, solvent sisteminin hava teması ve nem kirlenmesini önlemek için septum kapağı kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Hazırlanan çözeltiyi karanlıkta saklayın.</li>
</ol>3. İç standart çözüm (IS) hazırlığı
<ol><li>2 mL Erlenmeyer şişesinde, daha önce hazırlanan solvent çözeltisinde 0,1 M krom (III) asetilosetonat (yaklaşık 10 mg) ve iç standart (yaklaşık 35,8 mg NHND veya 77,3 mg kolesterol) hazırlayın. DİkKAT: Krom (III) asetilosetonat zararlıdır; manipülasyonu sırasında uygun eldivenleri giyin.</li>
	<li>IS çözümüne eklenen IS'nin tam ağırlığını kaydedin.</li>
	<li>IS çözeltisini aktif moleküler elekler içeren kapalı bir kapakla donatılmış bir şişeye aktarın (bkz. nokta 2.2) ve 40 °C'de karanlıkta saklayın.</li>
</ol>4. NMR numune çözeltisi hazırlama
<ol><li>Karıştırma çubuğu ile donatılmış 2 mL'lik bir şişede ~30 mg numuneyi doğru bir şekilde tartın. Şişeyi septum kapakla kapatın.</li>
	<li>Numune şişesine solvent sistem çözeltisinin 0,5 mL'lik kısmını ekleyin.</li>
	<li>IS çözeltisinin 100 μL'lik kısmını bir mikropipette aracılığıyla numune şişesinde aktarın. Tüm lignin veya tanen çözünene kadar elde edilen dağılımı (500 rpm) manyetik olarak karıştırın ve net bir çözelti elde edin. NOT: Tam örnek çözünürlüğü zorunlu olduğundan, bu adım 12 saate kadar sürebilir.</li>
	<li>0,1 mL TMDP'yi numune çözümüne aktarın. Numuneyi güçlü manyetik karıştırmanın altına yerleştirin. Numune çözeltisini kapalı tutun. Uygun eldivenleri takarken TMDP'i iyi havalandırılmış bir duman kaputunda kullanın. DİkKAT: TMDP ve buharları aşındırıcı, zararlı ve suyla hızla etkileşime girer. NOT: Sarı çökelti oluşumu, numunedeki su izlerinden veya piridin/kloroform çözeltiden kaynaklanmaktadır. Böyle bir durumda, olası tüm nem kirlenmesinin önlenmesi sağlanarak prosedür tekrarlanmalıdır.</li>
	<li>Pasteur pipet kullanarak numune çözeltisini bir NMR tüpüne aktarın.</li>
</ol>5. NMR analizi
<ol><li>Tüpü NMR cihazına yükleyin. Bu analizi yapmak için kullanılan spektrometrenin geniş bant probuna ihtiyacı vardır.</li>
	<li>Deneysel parametreleri Tablo 1 1'degösterilen ayara göre düzeltin.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PULSE PROGRAMı</td>
			<td>Ters kapılı ayırma darbesi (zgig)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ÇEKIRDEK</td>
			<td>31P</td>
		</tr>
<tr>
<td>SPEKTRAL GENIŞLIK</td>
			<td>22:00.m.</td>
		</tr>
<tr>
<td>SATıN ALMA ZAMANı</td>
			<td>- 0,8 sn</td>
		</tr>
<tr>
<td>GEVŞEME GECIKMESI</td>
			<td>≥ 10 sn</td>
		</tr>
<tr>
<td>TARAMA NUMARASı</td>
			<td>64 veya daha fazla</td>
		</tr>
<tr>
<td>SPEKTRUM MERKEZİ</td>
			<td>140 p.m.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Derivatize ligninlerin veya tanenlerin 31 P NMR spektrumunu kaydetmek için deneysel parametreler. 
<ol start="3"><li>Döterlenmiş kloroformun rezonans frekansını kullanarak spektrometre frekansını ayarlayın, numuneyi titretin ve spektrometreyi ayarlayın. O zaman satın almaya başla.</li>
</ol>6. Spektrum işleme ve analizi
<ol><li>31P NMR ham verilerini aşağıdaki adımlara göre uygun bir standart yazılımla işleyin.<ol>
<li>Fourier dönüşümü gerçekleştirin.</li>
		<li>Aşamayı manuel faz düzeltme ile ayarlama (İşleme | Aşama Düzeltme | El ile Düzeltme).</li>
		<li>Taban çizgisini el ile düzeltin, sıfır noktalarını dikkatlice ayarlama (İşleme | Temel | Çok Noktalı Taban Çizgisi Düzeltmesi).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sinyal kalibrasyonu.<ol>
<li>Fosfatlı suyun sinyalini 132,2 ppm kimyasal kayma değerine ayarlayın (Analiz | Başvuru | Başvuru). NOT: 175 ppm'de keskin bir 31P sinyalinin varlığı TMDP'nin fazlalığından kaynaklanmaktadır. Varlığı, numunenin tam türetilmesini sağlar. Bu tepe yoksa, kapsamlı bir numune ve çözücü kurutma sağlayarak ve daha fazla TMDP ekleyerek tüm prosedürü yeniden gözden geçirmemiz gerekir. Bu garanti edildikten sonra, spektrum spektral aralıkta 132 ila yaklaşık 150 ppm yakınlaştırilir (Şekil 7).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig07.jpg"> Şekil 7: Fazla miktarda TMDP varlığını kontrol edin: eğer görülebilirse, numunenin türetilmesi tamamlanır. Spektra daha sonra analiz edilebilir. Bunu yapmak için spektral aralık 155 ile 132 ppm arasında. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="3"><li>Entegrasyon<ol>
<li>dahili standardı 1,0 olarak ayarlayarak entegrasyonu normalleştirin (Tepe | İntegral | Düzenle Normalleştirilmiş: 1.00). Aşağıdaki tablolarda bildirilen kimyasal kaymalara göre spektrum entegrasyonu gerçekleştirin. Ligninler için Tablo 2'yi ve tanenler için Tablo 3'i kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>İşlevSEL GRUP</td>
			<td>KİmYASAL KAYMA (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alifatik OH</td>
			<td>149.0-146.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fenolik OH</td>
			<td>144.0-137.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>C5 ikame fenolik OH</td>
			<td>143.0-140.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-5' fenolik OH</td>
			<td>141.7-140.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Şırındi OH</td>
			<td>143.2-142.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4-O-5' OH</td>
			<td>142.8-141.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Guaiacyl OH</td>
			<td>140.2-138.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-hidroksifenil OH</td>
			<td>138.8-137.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>COOH</td>
			<td>136.0-133.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tricin</td>
			<td>137.0-136.0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Lignin fosfatlatlı OH grupları için 31 P NMR kimyasal kaymaları. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>İşlevSEL GRUP</td>
			<td>KİmYASAL KAYMA (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">A Çal</td>
		</tr>
<tr>
<td>o-unsubstituted fenolik</td>
			<td>137.9–137.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>o-ikame PHENOLIC</td>
			<td>138.8–137.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Halka B</td>
		</tr>
<tr>
<td>Catechol OH</td>
			<td>140.2–138.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pyrogallol OH</td>
			<td>144.0–140.2</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Halka C</td>
		</tr>
<tr>
<td>AliphatiC OH</td>
			<td>146.0–145.0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Tanen fosfatlı OH grupları için 31 P NMR kimyasal kayma. 
NOT: Standart spektral işleme yazılımı kullanılarak, entegre edilecek kimyasal değişimin önceden tanımlanmış bölgelerini ayarlamak mümkündür. Bu fırsat, birkaç spektrum işlenmesi gerektiğinde avantajlıdır.
7. fonksiyonel grup nicelemesi
<ol><li>IS çözeltisinin konsantrasyonunun hesapla. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62696/62696eq1v2.png">
</li>
	<li>Belirli bir sinyalin eşdeğer miktarını hesaplayın: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62696/62696eq2v2.png"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62696/62696eq3v2.png">
</li>
</ol>

Claudia Crestini ve Dimitris S Argyropoulos, tüm yazarların (C.C., N.P., ve D.S.A.) çıkar çatışması olmamasını sağlar.

Açıklanan yöntem, Argyropoulos 37,38 , 39,40 ,41,42tarafından geliştirilen ligninlerin nitel ve nicel karakterizasyonunu amaçlayan analitik protokolün uygulanmasını ve optimizasyonunu temsil eder. Lignin yapısal aydınlatması için mevcut diğer birçok teknikle karşılaştırıldığında, yöntem en facile, hızlı ve tekrarlanabilir arasında kabul edilmiştir. Islak kimyasal yöntemlerin (örneğin, nitrobenzen, kalıcı oksidasyonlar vb.) geçerliliği, operatörün iyi deneysel becerilerine dayanır ve yöntemi sınırlı operatörlerle etkili bir şekilde sınırlar. Ayrıca, literatürde ıslak kimyasal yöntemlerin çeşitli dezavantajlarını hesaba katmak için düzeltme faktörleriyle karşılaşmak nadir değildir. Açıklanan 31P NMR protokolü, bunu kolayca uygulanabilir, kullanıcı dostu ve yaygın olarak kullanılabilir hale getiren gelişmiş deneysel beceriler gerektirmez. Diğer enstrümantal analitik yöntemlerle karşılaştırıldığında, 31P NMR ligninlerdeki farklı hidroksi gruplarını hassas bir şekilde tespit edebilen ve ölçebilen tek tekniktir. Örneğin, FTIR 1H NMR gibi çeşitli hidroksi gruplarını tanımlamak için kullanılabilir. Bununla birlikte, her iki teknik de kapsamlı sinyal çakışması sorunları nedeniyle güvenilir nicel veriler sunamadıkları için acı çeker. Yaygın olarak kullanılan bir diğer teknik, ilk olarak Goldschmid tarafından bildirilen UV-Vis spektroskopisidir. Bununla birlikte, yaklaşım, alfatik, aromatik ve karboksilikOH'lar 47arasında etkili bir şekilde ayırt edemediğinden, hidroksi gruplarının genel olarak belirlenmesi ile sınırlıdır.
Ekonomik açıdan bakıldığında, 31P NMR tekniğinin tek sınırlaması, nispeten pahalı bir reaktif olan TMDP'nin fiyatıdır. Gram başına yaklaşık 190 USD'ye mal olur; sonuç olarak, analiz maliyeti, piridin/ kloroform karışımından ve operatör zamanından türeyenler hariç olmak üzere, yalnızca TMDP fiyatına yaklaşık olarak uygulanacaksa, analiz başına yaklaşık 24 USD'dir. Bu sorunu çözmek için, birçok laboratuvar TMDP'yi sentezlemek için başvurur, böylece reaktif maliyetlerini azaltır. Bunu yapmak için, pinacol ve fosfor triklorür trietilamin varlığında reaksiyona edilir44. Teknik olarak, bu reaksiyon nispeten kolaydır; bununla birlikte, fosforlu triklorür kullanımına ve iyi kontrol edilen vakum damıtma da dahil olmak üzere çalışmasına özen göstermemiz gerekir. Talep üzerine TMDP'nin sentezi hakkında daha fazla bilgi sağlanabilir.
Bu protokol kolaylık, tekrarlanabilirlik ve hassasiyet açısından en iyiler arasında olsa da, bazı kritik noktaların vurgulanması gerekir. İlk olarak, numunenin tanımlanan piridin/ kloroform karışımında tamamen çözünmesi gerekir. Bu husus esastır, çünkü hidroksil gruplarının nicel fosfilasyon reaksiyonunun tamamen homojen koşullar altında gerçekleşmesi gerekir. Örneğin yalnızca bir kısmı çözünürse, elde edilen analiz yanlış olur. İkincisi, incelenecek numunenin nem ve solvent içermemesi gerekir, çünkü bu değişkenler analizin hassasiyetini ve genel başarısını zararlı bir şekilde etkileyecektir. Nem izleri, TMDP'nin 2-hidroksi-4,4'-5,5'-tetrametril-1,3,2-dioksifosfatolan vermesiyle reaksiyona girecektir. Bu bileşik, piridin/kloroform çözücü karışımında çözünmeyen ve yetersiz NMR sinyal alımına neden olan soluk sarı bir flokülasyon tuzudur. Bir numunenin sadece küçük bir ağırlığı (~30 mg) gerektiğinden, analizden önce kesin ağırlığının doğru bir şekilde bilinmesi için uçucu maddelerden arındırılmış olması gerekir.
Bazen, numune çözme sorunları (özellikle yüksek oksitlenmiş numuneler için) az miktarda ortak çözücü (yani, dimetilformamid) eklenerek, numunenin çözülmesine yardımcı olarak teşvik edilebilir. Prensip olarak, TMDP ile etkileşime girmeyen her çözücü, numune çözünmesine yardımcı olmak için kullanılabilir. Bir ko-çözücü seçimi, reaktifle reaksiyona girerek yanıltıcı son spektrumlara neden oldukları için labile hidroksi veya amino grupları içeren ortak çözücüleri içeremez. Özellikle, dimetilsüllfoksit ayrıca TMDP'nin ortak çözücü olarak kullanılmasını engellemesiyle de reaksiyona girer. 1-allyl-3-butylpyridinium klorür gibi piridin bazlı iyonik sıvılar, çözünürlük sorunları ortaya çıktığında kullanılabilir; ancak, iyonik sıvı bir kez daha kuru olmalıdır48. Lignosülfonatları (yüksek sülfonasyon derecesi ile karakterize bir lignin tipi) eritmek için, nötralize grupların asidik formlarına dönüştürülmesini içeren bir ön tedavinin yararlı olduğu gösterilmiştir. Lignosülfonatlar sulu ortamda asidik değişim reçineleri kullanılarak asidik koşullarına kolayca dönüştürülebilir. Elde edilen linyiolfonic asitler, spesifik reçineler (örneğin, XAD-7) üzerindeki adsorpsiyonları ve etanoldeki dezopsiyonları ile çözeltiden izole edilir. Etanolik çözeltilerin 40 °C'de azaltılmış basınç üzerinden buharlaşması, linyisültonik asitlerin izolasyonunu sağlar. Bu ligninler daha sonra protokol tarafından önerilen piridin / kloroform karışımında çözünür oldukları için 31P NMR ile karakterize edilebilir.
Hafif sıcaklıklarda uzun süreli vakumlu kurutma, her numunedeki nem miktarını ve diğer uçucuları etkili bir şekilde azaltır. Özellikle, küçük miktarlarda su son spektrumu etkilemez, çünkü TMDP fazla eklenir. Ek olarak, bazı durumlarda, az miktarda 2-hidroksi-4,4'-5,5'-tetrametril-1,3,2-dioksafosfatolan, NMR tüpünde veya numune şişesinde bulunan nemden kaynaklanabilir. Bu durumlarda, oluşan çökeltme miktarını tamamen çözmek için karıştırma yeterlidir. Yüksek miktarda 2-hidroksi-4,4'-5,5'-tetrametril-1,3,2-dioksafosfatolan oluşursa, kurutma tedavisini iyileştirerek numune hazırlığının tekrarlanması önerilir. Örneğin, kullanmadan önce, tüm cam eşyalar bir ısı tabancası ile kısa bir süre ısıtılabilir.
Spektrumu kaydetmek için kullanılan spektral aralık, farklı hidroksil gruplarıyla ilgili sinyal için ilgi alanına kıyasla geniştir. Ancak, örnek türetmenin başarıyla gerçekleşip gerçekleşmediğini anlamak için bu zorunludur. Tam örnek derivatizasyonunun onaylanması, 174 ppm civarında güçlü bir sinyalin varlığı ile verilir. Bu keskin tepe, tepkilenmemiş TMDP'den kaynaklanmaktadır ve varlığı reaktifin aşırı miktarda bulunmasını sağlar ve bu nedenle tüm hidroksil grupları türetilmiştir. Bu tepe yoksa, en olası iki neden şunlardır: (1) kullanılan TMDP miktarı numunenin tam türetme işlemini gerçekleştirmek için yetersizdir veya (2) numunede yüksek miktarda su bulunur. İlk durumda, daha yüksek miktarda TMDP kullanmak büyük olasılıkla numunenin tam türetilmesini sağlayacaktır ve 174 ppm'deki sinyal görünecektir. İkinci durumda, numune daha kapsamlı bir şekilde kurutulmalıdır. Fazla miktarda TMDP sağlandıktan sonra, tepe tümleştirmesi yapılabilir. Bu işlemden önce, ilgi sinyallerini sınırlayan daha dar bir pencereye (150 ila 132 ppm) yakınlaştırın.
Yukarıdaki deneysel protokolde bildirilen analiz edilecek örnek miktarı (~30 mg), 300 MHz NMR spektrometresi veya daha fazlası için kaliteli spektra toplamak için seçilmiştir. Bununla birlikte, 500 MHz veya daha yüksek bir alan mıknatısı kullanıldığında numune miktarını azaltmanın mümkün olduğunu gözlemledik. Örneğin, Şekil 8D'de, 7,2 mg lignin ile hazırlanan bir numunenin NMR spektrumu (700 MHz'lik bir aletten kaynaklanan) gösterilmiştir. Bu spektrumun sinyal entegrasyonu, daha yüksek miktarda lignin kullanırken elde edilenlerle aynı sonuçları sunar. Bu gerçek, küçük miktarlarda ürünün mevcut olduğu tüm araştırmalar için bu protokolün uygulanabilirliğini artıran bir gerçektir.
Genel olarak, ligninlerde ve tanenlerde bulunan çeşitli hidroksi gruplarının kökenini ve kaderini anlamak gerektiğinde bu deneysel protokol birçok araştırma ve geliştirme uygulamasına uygulanabilir. Özellikle, GPC ve HSQC verileri ile birleştiğinde, elde edilen veriler lignin veya tanen yapısı hakkında daha ayrıntılı ve spekülasyon yapma fırsatı sunar. Lignin hidroksi gruplarına veya bir tanen için kimyasal modifikasyonların uygulandığı birçok durumda, nicel 31P NMR analizleri bu değişikliklerin gerçekleşip gerçekleşmediğini ve hangi dereceye kadar gerçekleştiğini tespit etmek için son derece değerli olabilir. Örneğin, Şekil 9 aynı lignin oksidasyonundan önce ve sonra iki NMR spektrumunu gösterir. Basit bir nitel değerlendirme, oksidasyon üzerine hem alifatik hem de aromatik hidroksi gruplarının azalmasını gösterir, böylece değerli bilgi ve rehberlik sağlar.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig09.jpg"> Şekil 9: Aynı Organosolv ligninnicel 31P NMR spektrumu TMDP (A) Prior ve (B) oksidasyonunu sonrası kullanılarak türetilmiştir. Spektra 300 NMR spektrometre kullanılarak kaydedildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig09large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Sonuç olarak, bu teknik polifenolik, OH taşıyan ligninler ve tanenler (ve hatta sentetik polimerler)49, 50,51ile ilgili sorgularda en önemli ve güçlü araçlar arasında yer almanın tüm özelliklerine sahiptir, kimyadan mühendisliğe, biyolojiden polimere ve farmasötik uygulamalara kadar çeşitli alanlarda yapılması gerekir.

Yakın zamanda Nature Protocols1'de yayınlanan bu prosedür arşiv literatüründe 3.000'den fazla kez atıf aldı ve temel, hızlı ve tekrarlanabilir yapısal bilgiler sağladığı için lignin ve tanen karakterizasyonu için rutin bir ölçüm haline geldi.
Lignin ve tanenler Yeşil Kimya Paul T. Anastas ve John C. Werner2,3tarafından tanıtıldığında, genel Kimya anlayışını büyük ölçüde değiştirdi. Özellikle, petrol ve kömür gibi fosil hammaddeler yerine sürdürülebilir malzemelerin başlangıç noktası olarak istihdam etmenin önemi,2,3. Farklı biyokütle türleri arasında lignin en bol aromatik biyopolimerdir ve endüstriyel ürünler ve yüksek katma değerli ürünler için potansiyel bir kaynak olarak görülebilir4.
Lignin ikinci en bol ahşap bileşenli (selüloz birinci ve hemiselüloz üçüncü). Bitkilerdeki içeriği bitki türüne bağlı olarak değişir: örneğin yumuşak odunlara kıyasla daha düşük miktarda lignin ile karakterize sertağaçlar (% 20 ±% 4'e karşı% 28 ±% 4). Ek olarak, sebze dokusu içindeki lignin dağılımı homojen değildir: daha yüksek lignin içeriği hücre duvarında bulunabilir5,6. Lignin, kağıt/selüloz endüstrisinin yan ürünü olarak endüstriyel olarak elde edilen polifenolik bir malzemedir7. Selülozu hemiselüloz ve ligninden (Soda ve/veya Kraft işlemleri) ayırmak için öncelikle OH- ve / veya OH- + HS- iyon koşullarının varlığında işlendiği ahşap hamuru işleminden kurtarılır8,9.
Lignin eğitimi için ilk girişimler sırasıyla Payen ve Schultze tarafından 1838 ve 186510'dayapılmıştır. 1977'de Adler, o zamana ilişkin tüm ilgili bilgileri özetledi11. Şu anda lignin yapı taşlarının üç fenil-propanoid ünitesi olduğu kabul edilmektedir: p-coumaryl, iğne yapraklı ve sinapil alkoller. Bu monomerler, serbest radikal polimerizasyon işlemi sayesinde, sonunda geniş ölçüde lignin oluşturan p-hidroksifenil, guaiacyl ve sinapil ünitelerine yol açtır (Şekil 1)12. Ligninlerde birincil bir yapının olmaması, yapısal karakterizasyonu için doğal bir zorluk anlamına gelir. Buna göre, moleküler ağırlık dağılımının değerlendirilmesi her zaman biraz tartışmalı olmuştur. Öğütülmüş ahşap lignin, yaklaşık olarak protolignin10olan hafif koşullar altında izole edilen lignin, supramoleküler toplama işlemleri14 ,15ile yüksek etkileşime giren oligomerlerdenoluşur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig01.jpg"> Şekil 1: Farklı tahvil türlerinin vurgulandığı yumuşak ağaç lignin temsili bir modeli. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig01large.jpg" target="_blank">lütfen buraya tıklayın.</a>
Ligninler genellikle şunlara bağlı olarak sınıflandırılır: (a) türetildikleri ahşabın türü (örneğin, sertağaç ve yumuşak ağaç), (b) onu izole etmek için kullanılan işlem. En önemli endüstriyel lignin türleri Kraft, Lignosulfonates ve Organosolv'dir.
Lignin yapısı, kökenine ve işleme kimyasına oldukça bağlıdır. Daha spesifik olarak, lignin oldukça karmaşık ve düzensiz yapısı doğal çeşitliliği ve karmaşık işleme kimyaları ile birleşince, aşırı değişkenlik, çeşitlilik ve heterojenlik malzemesi ortaya çıkar ve kullanımını düşük değerli uygulamalarla sınırlar16. Softwood ligninleri esas olarak ihmal edilebilir miktarda p-hidroksifenil grubu (G lignin) içeren guaiacyl üniteleri (G) içerirken, sertağaç ligninleri guaiacyl ve şırıngal alt birimleri (GS lignin) tarafından çeşitli oranlarda ve çim ligninleri guaiacyl tarafından oluşur, şırınga ve p-hidroksifenil (GSH lignin) alt birimleri. İzolasyon için kullanılan ekstraktif yaklaşım, ortaya çıkan lignin yapısını önemli ölçüde etkiler17. Şekil 2, kullanılan izolasyon yaklaşımına göre farklılık gösteren üç lignin yapısını göstermektedir. Ekstraksiyon yönteminin etkisi ile ilgili bazı hususlar vurgulanabilir. İlk olarak, Kraft lignin anlaşmalı, oldukça parçalı ve yoğunlaştırılmış bir lignin iken, Organosolv lignin öğütülmüş ahşap lignin (Bjorkman yaklaşımı kullanılarak izole edilmiş)18,19,20'ye benzer bir yapıya sahiptir. Son olarak, lignosülfonatlar, ekstraktif sülfonasyon işleminin yoğunluğuna ve koşullarına bağlı olarak yüksek derecede sülfonasyon ile karakterize edilir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig02.jpg"> Şekil 2: Teknik ligninler için temsili yapılar. Bu şekilde, farklı lignin türleri arasındaki farklılıklar görülebilir. (A) Softwood Kraft lignin oldukça yoğundur, (B) lignosülfonatlar doymuş karbonlar üzerindeki sülfonik gruplarla karakterizedir ve (C) organosolv lignin öğütülmüş ahşap ligninkine benzer bir yapıya sahiptir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ligninlere benzer şekilde, tanenler bitkilerde bulunan polifenolik bileşiklerdir. Tanenlerin ekstraktif yaklaşımları ve uygulamaları hakkında yeni ve güncellenmiş bir inceleme yakın zamanda Das veark. Tanenlerin günlük yaşamdaki önemi iki örnek göz önüne alındığında vurgulanabilir: şaraplara tat ve renk kazandırırlar22; ayrıca poli-fenolik yapıları antioksidan özellikler sunar ve bronzlaşma endüstrisinde uygulama için ideal hale getirir23. Tanenler iki sınıfa ayrılır: hidroluz ve hidroluzezür değil. Hidrolize edilebilir tanenler gallik, di-galya ve ellagic asit esterlerinin polimeri olarak kabul edilebilir (Şekil 3). Bu esterler fenolik asitlerin şeker molekülleri (örneğin, glikoz, rhamnoz ve arabinoz) ile esterleşmesinden elde edilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig03.jpg"> Şekil 3: Tipik hidrolizetik tanenler: tannik asit, vescalgin. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig03large.jpg" target="_blank">lütfen buraya tıklayın.</a>
Yoğunlaşmış tanenler olarak da bilinen hidrolize edilemez tanenler, flavan-3-ols'tan türetilen polimerler ve oligomerlerdir. Flavan-3-ols arasında kateşinler ve gallocatechin en sıktır. Renksiz kristal bileşiklerdir (Şekil 4). Polimerizasyon, helikoidal bir yapı ile karakterize bir polimer oluşturur. Aromatik hidroksi grupları sarmalın dış kısmına yönlendirilirken, piren oksijenleri iç kısımdadır.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig04.jpg"> Şekil 4: Proantosianidin yapıları: R =H, OH, OCH3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
NMR kullanılarak ligninlerin ve tanenlerin karakterizasyonu Lignin veya tanen karakterizasyonunda iki tür bilgi çok önemlidir: (a) kimyasal yapı (örneğin, hidroksi grubu içeriği, doğası ve birbiriyle iç içe bağlantı sıklığı) ve (b) moleküler ağırlık ve polidisperite. Lignin üzerine yapılan ilk çalışmalardan bu yana bu hedeflere ulaşmak için farklı teknikler kullanıldı ve iki yöntem sınıfı ortaya çıktı: kimyasal ve fiziksel yöntemler.
Lignin kimyasında alkali nitrobenzen oksidasyon, derivatizasyon ve ardından indirgemesel bölünme, permanganat oksidasyon ve tiyoakidoliz gibi kimyasal yöntemler tarihsel olarak yaygın olarak kullanılmıştır24 , 25,26,27,28,29. Bununla birlikte, analitik protokoller uygulanmış ve optimize edilmiş olsa bile, zaman gerektiren, zahmetlidir ve kapsamlı deneysel beceriler gerektirir30. Alternatif olarak, enstrümantal analizin başlangıcından itibaren, lignin ve tanen karakterizasyonlarını gerçekleştirmek için fiziksel yöntemler kullanılmıştır31. Bu teknikler, lignin yapısının karakterizesini kolaylaştırarak klasik yöntemlerin sorunlarının üstesinden gelmeyi sağlar.
Nükleer Manyetik Rezonans (NMR), enstrümantal teknikler arasında lignin yapısı ve kimyasal bileşim hakkında bilgi edindirir. Özellikle, nicel mono boyutlu 1H NMR spektrumtra ve nicel 13C NMR spektrumtrasından elde edilenveriler,farklı lignin interunit bondings32, 33,34,35türleri hakkında bilgi sağlayabilir. Ne yazık ki, tek boyutlu spektrumlar sinyal çakışmasından muzdariptir, bu da sinyal entegrasyon çabalarını ciddi şekilde baltalayabilir. HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), Q-HSQC (Quantitative - Heteronuclear Single Quantum Coherence) nicel versiyonları, lignin yapısını daha iyi anlamak için kullanılmıştır ve iç bağlantılarla ilgili yararlı bilgiler sağlamıştır. Ancak, çeşitli bina birimlerini belirlemek için tam olarak kullanılamazlar13,36,37 nicel olarak.
Mono ve iki boyutlu NMR ile ilişkili sorunların üstesinden gelmek için substrat türetme göz önünde bulundurulmuştur. Bu yaklaşımın avantajları arasında, karmaşık makromolekül içinde belirli etiketlerin ortaya çıkarılabilmesi ve etiketli substratların çözüldüğü çözücüden spektral girişim sonucu olmamasıdır1. Verkade, fosfor türevlerinin, kömür türevlerinin ve ilgili bileşiklerin 31P NMR analizini gerçekleştirerek bu alanda öncü oldu38. Yayınında, farklı fosfor içeren reaktiflerin (fosfolaninler) tarandığı ve diğer etiketli bileşiklerin kimyasal kayması kaydedildi. Argyropoulos'un ekibi ilk olarak 1991 yılında lignin'deki hidroksi gruplarının nicel ve nitel analizi için derivatizasyon uygulamayagetirmiştir. Fosfor içeren reaktifler kullanarak lignin modeli bileşiklerinin türetmesini inceledikten sonra, grubu lignin kimyasında en çok kullanılan tekniklerden biri olan 31P NMR analizi39,40,41,42,43'ün önünü açtı. İncelenen farklı fosfolasinler arasında Argyropoulos, lignin analizi yapmak için en uygun olan olarak 2-kloro-4,4,5,5-tetrametril-1,3-2-dioksafosfalanın (TMDP) kullanımına geldi44. TMDP, spesifik 31P NMR kimyasal kaymaları ile karakterize fosfor içeren türevlerin nicel oluşumuna neden olan hidroksi grupları ile seçici olarak reaksiyona sokulur (Şekil 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig05.jpg"> Şekil 5: Lignin ve tanen fosfitasyon kimyası. Lignin ve tanen labile H gruplarının etiketlenme in situ reaksiyonu ile gerçekleştirilir. Etiketli polifenoller, farklı hidroksi gruplarına karşılık gelen spesifik 31P NMR bantları ile karakterize edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Numune derivatizasyonu bir piridin/kloroform (1.6:1) karışımında gerçekleştirilir; bu seçim doğru bir değerlendirmeden kaynaklanır. Pyridine'in iki avantajı vardır. İlk olarak, yaklaşık 22.1 MPa1/2 Hildebrand parametresi ile karakterize bir çözücü seçmek lignin çözünürlüğü45'ibasitleştirir ve yükselter. Sonuç olarak, Hildebrand parametresi 21.7'ye eşit olan piredin bir çözücü olarak eklenmesi bu nedenle en uygunudur. İkincisi, TMDP'nin hidroksi gruplarla reaksiyonuna, lignin-fosfolasin türevlerinin fasile oluşumuna yönelik eşlik eden olumsuz etkileri olan bir yan ürün olarak hidroklorik asit (HCl) oluşumu eşlik eder. Bu nedenle, elde edilen HCL'nin nötralize edilmesi gerekir. Önemli miktarda mevcut olduğunda, TMDP'ye göre piridin temelliği, HCl'nin nötralizasyonunu sağlar (piridin hidroklorür oluşumu yoluyla).
Önerilen piridin/döterlenmiş kloroform ikili solvent sisteminin kullanımı üç nedene dayanmaktadır. İlk olarak, örnek çözünmesini tercih eder. İkincisi, piridin hidroklorür kloroformda çözünür olduğundan, son spektrumun çökeltme ve bozulmasını önleyebilir. Üçüncü olarak, kısırlaştırılmış kloroform, satın alma işlemi sırasında NMR spektrometresinin kilitlenmesine izin vererek benzersiz singlet sinyali için seçilir. Örnek türetme, bir iç standardın varlığında gerçekleştirilir. Bu şekilde, numune ve standart türetildiğinde, numunenin tepelerinin integrallerinin ve standardın karşılaştırılması, mevcut her bir hidroksi grubu türü için miktarın ölçülmesine izin verir. Çeşitli bileşikler iç standartlar olarak kabul edilmiştir. Bu bileşikler molekül başına tek bir hidroksi grubu ile karakterize edilir ve türetme sonrası 31P NMR spektrumunda tek bir keskin sinyal sunar. Standardın seçimi dikkatlice yapılmalıdır. Sinyali türetilmiş numuneninkilerle çakışmamalıdır. Kolesterol ilk günlerde yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, alifatik hidroksi grubundan kaynaklanan sinyallerle kısmi bir örtüşama kullanımını sınırlar. Rutin analizler için N-hidroksi-5-norbornene-2,3-dikarboksid (NHND) iç standart çözümleri tercih edilir. Ancak, NHND kararsızlığı nedeniyle, standart çözümleri sadece birkaç gün saklanabilir46.

<table><tbody><tr><td>100 - 1000 ve mikro; l Eppendorf mikropipet</td><td>VWR</td><td>613-0866</td><td></td></tr><tr><td>20 - 200 & mikro; l Eppendorf mikropipet</td><td>VWR</td><td>613-0865</td><td></td></tr><tr><td>2-kloro-4,4,5,5-tetrametil-1,3-2-dioksafospholan,% 95</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>447536</td><td></td></tr><tr><td>Analitik terazi (duyarlılık &plusmn; 0.1 mg)</td><td>Precisa</td><td>LX220 A Bağlayıcı</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu Fırın</td><td>Bağlayıcı</td><td>VD53</td><td></td></tr><tr><td>Sertifikalı Flakon Kiti, Düşük Adsorpsiyon (LA), 2 mL, pk of 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29651-U</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform-d</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol, Sigma dereceli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler elekler, 4A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208604</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroksi-5-norbornen-2,3-dikarboksimid, %97</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>226378</td><td></td></tr><tr><td>NMR spektrometresi, 300 MHz</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Norell&nbsp; doğal kuvars 3 mm NMR tüpler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NORS33007</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları, 100-1000 ve mikro; L UltraFine (mavi)</td><td>VWR</td><td>613-0342</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları, 20-200 ve mikro; L Eğim Noktası (sarı)</td><td>VWR</td><td>613-0239</td><td></td></tr><tr><td>Piridin, susuz, %99,8</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td></td></tr><tr><td>Karıştırma çubukları, mikro, 3 mm uzunluk</td><td>VWR</td><td>442-0360</td><td></td></tr><tr><td>Karıştırma çubukları, mikro, 6 mm uzunluk</td><td>VWR</td><td>442-0362</td><td></td></tr><tr><td>Trifenilfosomurga oksit, %97</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T84603</td><td></td></tr><tr><td>Çevresel analiz için şişeler, WHEATON,&nbsp; 20,00 mL</td><td>DWK Yaşam Bilimleri</td><td>WHEAW224609</td><td></td></tr><tr><td>Tartı kağıdı, sınıf 531</td><td>VWR</td><td>516-0318P</td><td></td></tr></tbody></table>

lignins ve tanenlerin nicel 31p nmr analizi

Quantitative 31P NMR Analysis of Lignins and Tannins

Sürdürülebilir biyorefinery ürünlerinin geliştirilmesi, diğerlerinin yanı sıra lignin ve tanen valörizasyonu zorluğu ile karşı karşıyadır. Bu bol, yenilenebilir aromatik biyopolimerler, doğal yapısal karmaşıklıkları ve yüksek derecede değişkenlikleri ve tür çeşitliliği nedeniyle yaygın olarak kullanılmamıştır. Bu polifenoller için tanımlanmış bir birincil yapının olmaması, işleme sırasında indüklenen karmaşık kimyasal değişikliklerle daha da birleşir ve sonunda daha fazla kullanım çabası için çok çeşitli aşırı öneme sahip yapısal özellikler ortaya çıkarmaz.
Sonuç olarak, doğal polifenollerde bulunan çeşitli fonksiyonel grupların hızlı, basit ve kesin tanımlanması ve ölçülmesi için bir protokol, reaktivitelerini ve nihai yararlarını anlamak ve buna göre uyarlamak için temel bir ön koşuldur.
Nicel 31P NMR, geniş uygulama potansiyeline sahip ligninlerde ve tanenlerde unsubstituted, o-mono ikame ve o-disubstituted fenoller, alifatik OH'lar ve karboksilik asit moieties'lerini hızlı ve güvenilir bir şekilde tanımlama fırsatı sunar.
Metodoloji, uygun bir 31P içeren prob kullanılarak yerinde nicel lignin veya tanen etiketleme prosedüründen ve ardından bir iç standardın varlığında nicel 31P NMR spektrumunun alınmasından oluşur. 31P çekirdeğinin yüksek doğal bolluğu, etiketli OH gruplarının çevreleyen kimyasal ortamına oldukça bağımlı olan iyi çözülmüş 31 P sinyalleri ile az miktarda numune (~30 mg) ve kısa NMR alım süreleri (~30-120dk) sağlar.

Açıklanan protokol hem ligninlerin hem de tanenlerin analizi için uygulanabilir. Lignin kimyasında, bu yöntem temeldir, çünkü farklı hidroksi gruplarının tespit edilmesine ve nicelleştirilmesine izin verir. Şekil 8A-D, farklı frekanslarda çalışan spektrometrelerle elde edilen lignin ve tanenlerin 31P NMR spektrumu örneklerini göstermektedir. Şekil 8A'da gösterilen spektrum 300 MHz NMR spektrometre kullanılarak kaydedilirken, Şekil 8D 700 MHz NMR cihazı ile kaydedildi.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig8v2.jpg"> Şekil 8: Nicel 31P NMR spektrumu (A) softwood kraft lignin (30,8 mg lignin üzerinde 300 MHz spektrometre ile kaydedilen spektrum), (B) softwood linyitsel asit (spektrum 30,30,8 mg'da 300 MHz spektrometre ile kaydedilmiştir). Lignosülfonatın lignosulfonic aside korunmasından sonra 1 mg lignin), (C) Akasya taneni (30,3 mg numunede 300 MHz spektrometre ile kaydedilen spektrum) ve (D) softwood kraft lignin (700 MHz spektrometre ile kaydedilen spektrum) 7.2 mg lignin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig8v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu spektrumlar dikkatlice kaydedildi ve manuel olarak işlendi. Alifatik (150-145 ppm), aromatik (145-137 ppm) ve karboksilik (136-134 ppm) hidroksi grupları için tipik sinyaller çok iyi çözülür ve kolayca entegre edilir. Spektral pencere açılırsa (95 ila 190 ppm, Şekil 8),üç keskin, güçlü tepe (175, 144 ve 132 ppm) belirgindir. Bunlar sırasıyla TMDP, iç standart (kolesterol veya NHND) ve hidroksilatlı TMDP'nin (su izlerinin neden olduğu) fazlalığından kaynaklanmaktadır.
Kraft ve organosolv lignin aksine, lignosülfonatlar piridin / kloroform karışımında çözünmez. Güvenilir bir 31P NMR spektrumu elde etmek için çözünürlük zorunludur. Bu sorunun üstesinden gelmek için lignosülfonatlar türetmeden önce ilgili linyisülfonik asitlere dönüştürülebilir. Lignosülfonat çözeltilerinin güçlü asitlerle (yani sülfürik asit) veya asit değişim reçineleriyle (örneğin, güçlü bir asit katyon eşanjörü olan Dowex 1H) tedavi etmek, tüm sülfonat gruplarının asidik formlarında dönüşümünü sağlar. Elde edilen ürünler, bu protokol kullanılarak analiz edilen 60.000 u.m.a'ya kadar moleküler ağırlıklarla karakterize edilen bileşikleri izole etmek için kullanılan bir polar adsorbent olan seçici adsorptif reçineler (XAD-7) kullanılarak asidik çözeltiden çıkarılabilir. Şekil 8B, TMDP türetilmiş linyifik asidin nicel 31P NMR spektrumunun olduğunu göstermektedir. Bu durumda bile, hidroksi gruplarının farklı sinyalleri belirgindir. Şekil 8C, TMDP kullanılarak türetilen bir tanen örneğinin tipik nicel 31P NMR spektrumunun gösterildiğini göstermektedir. B halkasındaki farklı alifatik OH (Halka C), pirogallol ve katekolü ünitelerinden ve A halkasındaki ünitelerden gelen karakteristik bir sinyal iyi görülebilir.

31 P NMR, polifenollerin yapısal aydınlatıcısı için güçlü bir araçtır. Ligninler ve tanenlerdeki farklı hidroksi, fenolik ve karboksilik grupların ölçülmesini ve farklılaşmasını sağlayan bu hızlı, kolay, hassas, nicel ve son derece tekrarlanabilir analitik prosedür artık rutin bir analitik araç haline gelmiştir.

Lignins ve Tanenlerin Nicel 31P NMR Analizi

The development of sustainable biorefinery products is confronted, among others, with the challenge of lignin and tannin valorization. These abundant, ...

Nicel fosfor NMR, son otuz yılda lignin ve tanen analitik kimyasındaki en önemli atılımlardan birini temsil ediyor. Bu teknik, numunedeki çeşitli hidroksi grubu için hızlı, güvenilir ve nicel bilgiler sunar. Bu NMR yöntemleri lignanların ve tanenlerin yapısını anlamada muazzam bir değere sahiptir.Reaktif hidroksil gruplarına sahip çeşitli sistemlere de uygulanmıştır. 40 santigrat derecede bir vakum fırınında bir gecede kurutarak 100 miligram lignin veya tanen örneğini ön işleme alarak başlayın. Kuruduktan sonra, numuneyi oda sıcaklığına ulaşana kadar susuz bir kalsiyum sülfat kurutucuya hızla aktarın.Numuneyi NMR spektroskopisi için hazırlamak için, karıştırma çubuğu ile donatılmış iki mililitrelik bir şişede numunenin yaklaşık 30 miligramını doğru bir şekilde tartın. Ardından, numune şişesine taze hazırlanmış çözücü çözeltisinin 500 mikrolitresini ekleyin ve şişeyi bir kapakla kapatın. Bir mikropipette kullanarak, numune şişesine 100 mikrolitre iç standart çözelti ekleyin, ardından elde eden dispersiyonu dakikada 500 dönüşte manyetik olarak karıştırın.Numune tamamen çözüldüğünde, kaputun altında çalışırken numune çözeltisine 100 mikrolitre tetrametrin dioksifosfatolan veya TMDP aktarın ve numuneyi güçlü manyetik karıştırma için yerleştirmeden önce numune çözeltisini kapatın. Bu noktada lignin ve tanen örneklerinde belirtilen reaksiyon meydana gelir. Pasteur pipet kullanarak, numune çözeltisini analiz için bir NMR tüpüne aktarın.Numunede sarı bir çökelti görülürse, olası tüm nem kirlenmesinin önlenmesini sağlayarak prosedürü tekrarlayın. Numune tüpünü geniş bant probu ile donatılmış NMR cihazına yükleyin ve deneysel parametreleri ayarlayın. Döterlenmiş kloroformun rezonans frekansını kullanarak spektrometredeki frekansı ayarlayın.Örneği sabitle ve satın almaya başlamadan önce spektrometreyi ayarlayın. Fourier dönüşümü gerçekleştirerek P31 NMR spektroskopisinden ham verileri işlemeye başlayın. İşleme sekmesini genişleterek ve faz düzeltme ve manuel düzeltmeyi seçerek aşamayı manuel faz düzeltme ile ayarlayın.İşlemeyi tıklatıp taban çizgisi ve çok noktalı taban çizgisi düzeltmesini seçtikten sonra sıfır noktayı dikkatlice ayarlayarak taban çizgisini el ile düzeltin. Sinyal kalibrasyonu için, analiz sekmesini açarak fosforillenmiş suyun sinyalini milyonda 132,2 parça kimyasal kayma değerine ayarlayın, ardından referans sekmesinde referansı seçin. Sinyal entegrasyonu için analiz menüsünde integrali açın.Entegrasyonu normalleştirmek için, integrali düzenle'yi seçmek ve normalleştirilmiş sekmeye 1.00 değerini girmek için tepeye tıklayarak iç standardı 1.0 olarak ayarlayın, ardından makaleye bildirilen kimyasal kaymalara göre spektrum entegrasyonu gerçekleştirin. Denklemi, iç standardın veya IS'nin molar konsantrasyonunun hesaplayını hesaplamak için kullanın ve numunenin gramı başına belirli sinyalin eşdeğer miktarını tahmin etmek için hesaplanan değeri kullanın. TMDP ile türetilen yumuşak ağaç zanaat lignindeki çeşitli hidroksi gruplarının spektrum nicelemesi 300 megahertz ve 700 megahertz NMR spektrometresi kullanılarak kaydedildi.NMR spektrumunda, iç standart ve TMD'nin hidroksiilasyonu nedeniyle sırasıyla 144 ve 132 PPM'de keskin ve güçlü zirveler tespit edildi. Hidroksi gruplarının farklı sinyalleri ligninlerin tüm nicel P31 NMR spektrumlarında belirgindi. TMDP kullanılarak türetilen bir tanen örneğinin nicel P31 NMR spektrumunda, farklı alifatik OH pirogallol ve katekolü ünitelerinden karakteristik bir sinyal iyi görülebilirdi.NMR lignin spektrumu ile oksidasyon sonrası arasındaki karşılaştırma, hidroksi gruplarının zirvelerinin yoğunluğundaki azalmayı gösteren 300 megahertz NMR spektrometresi kullanılarak kaydedildi. Önemli adımlar, numunenin kurutılması ve ağırlıklandırması ve kullanılacak NMR işleme parametreleri ile ilgili adımlardır. Ve en önemlisi, elde edilen spektrumun fazsingi.Bu yöntem iki boyutlu NMR ve jel geçirgenlik kromatografisi ile birleştiğinde, doğal polifenollerin çok ayrıntılı bir resmi ortaya çıkabilir ve benzeri görülmemiş yapısal bilgiler ve yeni içgörüler sunabilir.

quantitative-31p-nmr-analysis-of-lignins-and-tannins

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve polifenolik lignin bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol açıklar.

Bitki Hücre Duvarları kapsamlı Kompozisyonel Analizi (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm I: Lignin

Etiket lignin bitki hücre duvarlarında görselleştirme ve farklı dokuları, numune veya türlerin lignification karşılaştırılması sağladığını konfokal Raman mikroskobu dayalı bir yöntem sunulmaktadır.

Etiket- In situ</emBitki Hücre Duvarlar Lignification> Görüntüleme

Bir çift sarmallı RNA girişimi (dsRNAi) tekniği mısır sinamoil koenzim alt bitki lignin içeriğine A redüktaz (ZmCCR1) geni aşağı regüle etmek için kullanılır. Lignin hücre duvarından aşağı-regülasyon mikroskopik analiz ile görselleştirilmiştir ve Klason yöntemi ile ölçülür. Yarı selüloz ve kristalin selüloz içinde Bileşim değişiklikler analiz edilmiştir.

Lignin Aşağı düzenleme<em&gt; Zea mays</em&gt; DsRNAi ve Klason Lignin Analizi ile

Bitki hücre duvarı yapısı ve kimyası özellikleri, biyoyakıtlar ve biyo-malzemeler için ideal hammaddeleri belirlemek için değerlendirilir. Standart yöntemlerin büyük veri kümelerine uygulandığında sınırlamaları vardır. Bu yüksek verimli ön arıtma, enzim sakarifikasyonu ve piroliz-moleküler ışın kütle spektrometresi yöntemleri, çok sayıda biyokütle örneğini düşük deney süresi ve maliyeti ile karşılaştırır.

Toplam Lignin, lignin Monomer ve enzimatik Şeker Yayın: Lignocellulosic Biyokütle rekalsitrantların Varyasyonları yüksek verimlilik Taraması

Bu protokol, bitki hücre duvarlarındaki lignin, selüloz ve hemiselülozun Raman görüntüleme ve çok değişkenli analizi kullanılarak görselleştirilmesi için genel bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.

Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi

Biz Brønsted asidik iyonik sıvılar (BAILs) varlığı su katalizör ile bir yenilenebilir olmayan yenilebilir lignocellulosic biyokütle (yani, jüt) C5 şekerler (ksiloz ve arabinoz) sentezi için bir iletişim kuralı mevcut. BAILs katalizör geleneksel mineral asit katalizörler daha iyi katalitik performans sergiledi (H2SO4 ve HCl).

Pentosan analizi için yeni bir yöntem mevcut Jüt biyokütle ve şeker monomerleri asidik iyonik sıvı kullanarak içine onun dönüşüm

Burada, çeşitli biyokütle kaynaklardan lignin ve etanol ayıklama gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Lignin verim ve β-O-4 içeriği ayıklama koşullardan etkisi sunulmaktadır. Seçici bozulumu yüksek aromatik monomer ürünler elde etmek için elde edilen lignins üzerinde gerçekleştirilir.

Yüksek β-O-4 içeriği ile Lignin çıkarımı hafif etanol ayıklama ve bozulumu verim üzerindeki etkisi

OrganoCat, lignoselülozun hafif koşullar altında lignin, fermente edilebilir şekerler ve selüloz hamuruna ön işlem ve fraksiyonasyonu için bir yöntemdir. Biyojenik, bifazik solvent su sisteminde ve katalizör olarak 2,5 furancarboxylic asitli 2-metiltetrahidrofuranda, OrganoCat ürünleri basit ürün geri kazanımı için yerinde ayrılır.

OrganoCat Prosesi kullanılarak Lignoselülozik Biyokütlenin Fraksiyonasyonu

Derin ötektik solvent bazlı, mikrodalga destekli ön işlem, lignoselülozik fraksiyonasyon ve yüksek saflıkta lignin geri kazanımı için yeşil, hızlı ve verimli bir süreçtir.

Olağandışı Akdeniz Lignoselülozik Kalıntılarından Ultra Hızlı Lignin Ekstraksiyonu

Burada, otsu bitki biyokütlesinde lignin içeriğinin tahmin edilmesi için değiştirilmiş bir TGA yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem lignin ile belirli tiyoether bağları oluşturarak lignin içeriğini tahmin eder ve lignin içeriği tahmini için nispeten küçük bir örnek gerektirdiğinden Klason yöntemine göre bir avantaj sunar.

Tiyoglikolik Asit (TGA) Kullanılarak Bitki Biyokütle Lignin İçeriğinin Tahmini

Biyouyumlu lignin mikro ve mikron altı partiküllerin sentezi ve karakterizasyonu için yeni, basit metodolojileri açıklıyoruz. Bu formülasyonlar, heteropolimerin kullanımı için kolay bir yaklaşımın yanı sıra biyotıp, farmasötik teknoloji ve gıda endüstrisinde potansiyel uygulanabilirliği olan çok işlevli taşıyıcı matrislerin rasyonel tasarımı için bir alternatif sağlar.

Yeni Alkali Lignin Mikro-/Submikron Partiküllerinin Yeşil Sentezi, Karakterizasyonu, Kapsüllenmesi ve Salınım Potansiyelinin Ölçülmesi

Keşfedin, lignin ve tanenlerin yapısal özelliklerini nicel 31P NMR ile analiz etme yöntemini. TMDP türevleme ve spektroskopi teknikleri, polifenol araştırmalarında hidroksi gruplarının hızlı ve güvenilir nicel analizini sağlar.

Lignins ve Tanenlerin Nicel ³¹P NMR Analizi

Daha fazla video keşfet