Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için
August 20th, 2021
Burada sunulan, mekanistik çalışmalar, hastalık modelleme ve tarama uygulamaları için uygun, çift kutuplu çok kuyulu bir plakada 48 dokudan oluşan paralel bir kültür için tasarlanmış bağ dokuları üretmek için bir protokoldür. Protokol, farklı organ ve türlerden fibroblastlarla uyumludur ve burada insan primer kardiyak fibroblastlarla örneklenmiştir.
Bu protokol, fibroblast'ın tanımlanmış mekanik koşullar altında kendi ortamlarını inşa etmelerini ve düzenlemelerini sağlar. Bunlar, hücrenin doğal ortamıyla karşılaştırılabilir sertlik ve matris bileşimlerine sahip anizotropik dokularla sonuçlanır. Bu yöntem, paralel olarak 48'e kadar koşulu karşılaştırmaya izin verir.
Kullanılan hücre tipi ve kültür koşullarına göre esnektir. Sadece birkaç iyi tanımlanmış bileşen kullanılarak laboratuvarlar arasında tekrarlanabilir. Pro-fibrotik faktörler veya antifibrotik ilaçlar uygulanarak, bu protokol her türlü fibrotik hastalıkların alttaki süreçlerini ve tedavilerini incelemek için kullanılabilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Alisa Degrave ve ben olacağım. Başlangıç olarak, kriyo ile korunmuş kardiyak fibroblastları 37 santigrat derecede bir su banyosunda, şişe sadece az miktarda buzla kalana kadar yaklaşık iki dakika çözün. Daha sonra, hücre süspansiyonunun iki mililitre serolojik pipet kullanarak damla yönünde 10 mililitre fibroblast büyüme ortamı içeren uygun bir steril santrifüj tüpüne aktarın.
En uygun hücre alımı için kriyo şişesini bir mililitre FGM ile durulayın ve santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri yavaşça yeniden biriktirin ve bir hücre kültürü şişesine aktarın. FGM'i beş gün boyunca veya hücreler% 80 izdiah edene kadar her gün yenile.
Ortamı kültürlü hücrelerden aldıktan sonra, hücreleri altı mililitre PBS ile yıkayın ve aspirat edin, ardından hücrelere altı mililitre hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin ve hücre müfrezesi görünene kadar kuluçkaya yatırın. Hücre ilişkisi reaktifinde yerinden çıkan hücrelere altı ila 12 mililitre FGM ekleyerek enzymatic aktiviteyi nötralize edin. Tek hücreli süspansiyon sağlamak ve hücreleri taze bir 50 mililitre toplama tüpüne aktarmak için 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak dört ila sekiz kez yavaşça pipet.
Üreticinin talimatlarına göre otomatik bir hücre sayacı yardımıyla verimi doğrulayın ve hücreleri aşağı doğrulayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin, peletin yerinden çıkarmak ve FGM'deki hücreleri yeniden canlandırmak için tüpü hareket ettirİn. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 40 mikrometre örgü hücre süzgecinden geçirin, ardından otomatik bir hücre sayacı kullanarak, tasarlanmış bağ dokuları veya EKT hazırlığına devam etmeden önce güvenilir hücre numaraları sağlamak için hücre sayısını ve canlılığı elektrik akımı dışlama ile değerlendirin.
EKT'ye hazırlanmak için, hücre süspansiyonu FGM ekleyerek mililitre başına 20 ila 25 santigrat derecede 8,9 milyon hücreye ayarlayın ve hücreleri buzda tutun. ECT hidrojel karışımının bireysel bileşenlerini içeren diğer tüm tüpleri buza aktarın ve karışımı hazırlamak için boş bir 50 mililitre santrifüj tüpü önceden soğutun. Hava kabarcığı oluşumunu önleyen önceden soğutulmuş 50 mililitre santrifüj tüpüne metinde açıklanan bileşenleri ekleyerek ECT hidrojel karışımını hazırlamaya başlayın.
İlk olarak, pipet asit çözünür kollajen tipi I hidrojel geniş bir delik ucu ile serolojik bir pipet içine. Uygun karıştırma için tüpü hafifçe döndürürken DMEM'i ekleyerek kollajen çözeltisinin tuz içeriğini ayarlayın. pH'ı nötralize etmek için, tüpü döndürürken 0,2 molar sodyum hidroksit ekleyin ve fenol kırmızı göstergesinin kırmızı rengini gözlemleyerek nötralizasyonunu onaylayın.
Daha sonra tüpü hafifçe döndürürken hücre süspansiyonu damla yönünde ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek ve kesme stresini en aza indirmek için geniş delikli bir uçlu serolojik pipet kullanarak süspansiyonu sadece bir kez hafifçe yukarı ve aşağı borula karıştırın. Kapsamlı karıştırma için tüpü 10 kez hafifçe döndürün.
ECT hidrojel karışımı içeren santrifüj tüpünü döküm işlemi boyunca buz üzerinde tutun. ECT hidrojel karışımında bir mililitre pipet ucu ıslatın, ardından 48 kuyulu döküm plakasının her kalıbına eşit olarak 180 mikrolitre hidrojel karışımı dağıtın, kollajen matris tertibatının bütünlüğünü etkileyebilecek aşırı kesme kuvvetlerini önleyin ve tüm plakanın 15 ila 20 dakika içinde bitmesini sağlayın. ECT karışımının süreksiz dağılımı tam bir ECT halkası oluşumunu önleyeceğinden, kalıp içinde tam bir döngü oluşmasını sağlayın.
Homojen ve fonksiyonel doku oluşumu için düzgün bir ECT hidrojel dökümü sağlamak için iç kuyuya pipetlemekten ve pipetleme sırasında kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. ECT hidrojel karışımını 15 ila 30 dakika yeniden inşa etmek için 48 kuyulu döküm plakasını hücre kültürü inkübatörünün içine dikkatlice yerleştirin. Kuluçkadan sonra jel benzeri ve opak görünür.
AİHM'nin alttan kopmasını önlemek için duvar boyunca yavaşça duvar boyunca 37 santigrat derecelik 600 mikrolitre sıcak FGM ekleyin. Analize kadar ortamı her gün 500 mikrolitre FGM ile değiştirin. İstenilen zaman noktalarında, AİHM'nin üst ve yan görünümlerinin mikroskobik görüntülerini kaydetmek için bir stereo mikroskop kullanın.
Hat tarama çözümlemesi gerçekleştirmek için görüntü işleme programı kullanın. Bir ölçek ayarlayın ve her görüntüleme düzleminde kol başına en az altı konumdaKI EKT çaplarını izlemek ve ölçmek için düz çizgi aracını kullanın. Yüksek çözünürlüklü tek renkli görüntü sensörü ve UV'ye yakın ışık kaynağı ile donatılmış sabit bir mesafeye yerleştirilmiş entegre alan tarama kamerasına sahip bir kayıt cihazının altındaki 48 kuyu döküm plakasını görüntüleyin.
Kontrastı en üst düzeye çıkarmak için floresan boya içeren kutup uçlarının otomatik algılamasını gerçekleştirin. Karanlık bir arka plan veya görüntü işleme programında yüksek kontrastlı parlak pikselleri algılamak için kaydedilen görüntüleri yazılımda çalıştırarak otomatik bir analiz kullanarak kutuplar arasındaki günlük kayıtlardan uzaklığı ölçün. ECT'yi tutma direklerinden çıkarın ve bir aktarma kancası ve EKT döngüsü takın.
Daha sonra ECT'yi sabit kola ve PBS ile dolu 37 santigrat derece temperli organ banyosu ile donatılmış uzatmalı dinamik mekanik riometrenin dönüştürücü koluna kenetlenmiş iki kancaya aktarın. Riometreyi kancalar arasındaki başlangıç mesafesinin yaklaşık %1'ine ayarlayarak sabit doğrusal hızda tek eksenli gerilim uygulayın. Tipik EKT boyutlarıyla saniyede 0,03 milimetre sabit bir esneme hızı kullanılabilir.
Dönüştürücünün kuvvetini yırtın ve esnemeyi başlatın. Ölçülen kuvveti kesitsel alanla normalleştirdikten sonra EKT yırtılma noktasına kadar kayıt yapmaya devam edin ve farklı biyomekanik parametreleri belirleyen stres-gerinim eğrisini çizin. Doku mikro kırılmaya başlamadan hemen önce, elastik bölgenin üst sınırı verim noktasına karşılık gelir ve suşu doku elastikiyetinin bir ölçüsüdür.
Plastik bölge verim noktası ile arıza noktası arasındadır. Başarısızlık noktası, dokunun yırtılmasına bağlı streste ani bir düşüşe karşılık gelir ve doku genişletilebilirliğinin bir ölçüsü olan nihai suşu tanımlar. Üçüncü ölçüm noktası, dokunun esneme sırasında kırılmadan taşıyabileceği en yüksek stresle tanımlanan maksimum güce karşılık gelir.
Eğrinin altındaki alanın verdiği esneklik ve tokluk, doku tarafından emilen enerjiye sırasıyla verim noktasına ve başarısızlık noktasına kadar karşılık gelir. Elde edilen her eğri için, elastik bölgenin doğrusal kısmının eğimi, Young'un elastik modül olarak da bilinen modülüne karşılık gelir. Dokunun sertliğini ölçen mekanik bir özelliktir.
Bu protokol kullanılarak, kontrol koşulları altında ve FCS varlığında ECT sıkıştırma ve daralma dökümden birkaç saat sonra ortaya çıktı ve özellikle beşinci güne kadar arttı. ECT, aktin polimerizasyon inhibitörü Latrunculin A ile tedavi edildiğinde, ECT sıkıştırması kontrole kıyasla önemli ölçüde daha yüksek kesit alanı tarafından belirtildiği gibi azaltıldı. Dokuların kasılması beş günlük kültür boyunca değerlendirildi.
Latrunculin A'nın yokluğunda, kasılma yavaş yavaş beşinci güne kadar artarak yaklaşık% 40 daralmaya ulaştı. Bununla birlikte, Latrunculin Bir varlığı doku kasılmasını etkiledi ve sadece% 20 maksimum kasılma ile sonuçlandı. Aksin polimerizasyon inhibisyonu, kontrol üzerindeki doku sertliğinde yaklaşık% 50'lik önemli bir azalmaya yol açtı.
Bu sonuçlar, aktin sitoskeletal bütünlüğünün ECT sıkıştırma, kasılma ve sertleşme için gerekli olduğunu göstermektedir. Güvenilir, yüksek kaliteli bir kolajen çözeltisi seçmek ve mühendislik konvektif dokuları yeniden inşa etmek için yüksek canlılığa sahip tek hücreli bir süspansiyon kullanılmasını sağlamak önemlidir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, fibroblastların kendi ortamlarını tanımlı mekanik koşullar altında inşa etmesine ve düzenlemesine olanak tanır ve doğal ortamı taklit eden anizotropik dokular ortaya çıkar. Paralel olarak en fazla 48 koşulun karşılaştırılmasını sağlar ve çeşitli hücre tipleri ve kültür koşullarına uyarlanabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bağ dokusu mühendisliği
- Fibroblast biyolojisi
- Mekizmatik çalışmalar
Arka Plan
- Fibroblastlar doku yapısı ve fonksiyonu için önemli bir rol oynar.
- Mühendislik ortamlarındaki davranışlarının anlaşılması, hastalık modellemesine katkıda bulunabilir.
- Fibrotik hastalıklar, sağlık üzerindeki etkileri nedeniyle önemli bir araştırma alanıdır.
- Mevcut yöntemler genellikle tekrarlanabilirlik ve esneklikten yoksundur.
Çalışmanın Amacı
- Mühendislik yapılmış bağ dokularının üretilmesi için tekrarlanabilir bir protokol geliştirmek.
- Fibrotik hastalıklar için mekizmatik çalışmaları ve ilaç taraması kolaylaştırmak.
- Birden fazla deneysel koşulun aynı anda karşılaştırılmasına izin vermek.
Kullanılan Yöntemler
- Dokun kültürü için çift kutuplu çok kuyuklu plaka kullanımı.
- Fibroblastlara tanımlı mekanik koşulların uygulanması.
- Pro-fibrotik faktörlerin veya antifibrotik ilaçların dahil edilmesi.
- Doku sertliği ve matris bileşiminin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Mühendislik yapılmış dokular, doğal ortamlara benzer sertlik ve matris bileşimleri sergiledi.
- Protokol, farklı hücre tipleri arasında esneklik gösterdi.
- Tekrarlanabilirlik, birden fazla laboratuvarda doğrulandı.
- İlaç uygulaması yoluyla fibrotik hastalık mekanizmaları hakkında bilgiler elde edildi.
Sonuçlar
- Bu protokol, fibrotik hastalıkların incelenmesi için değerli bir araç sağlar.
- Kontrollü koşullar altında paralel deneyler yapılmasını sağlar.
- Yöntemin uyarlanabilirliği, çeşitli araştırma uygulamaları için uygun hale getirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible generation of human-derived engineered connective tissues (ECT) in a 48-well format, providing a scalable 3D model for studying fibroblast behavior under defined biomechanical load. It supports mechanistic de-risking of antifibrotic targets by allowing parallel testing of pro-fibrotic factors and drug candidates, with quantitative readouts on tissue compaction, contraction, and stiffness. The system enhances predictive confidence in early discovery by modeling human-relevant tissue responses to pharmacological perturbations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation under controlled mechanical and biochemical conditions.
- Scientific Value: Supports functional validation of antifibrotic targets through dose-response analysis of compounds like Latrunculin A on tissue contraction and stiffness.
- Operational Value: Facilitates target de-risking by linking cytoskeletal mechanisms to tissue-level biomechanical outcomes in a human-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, high-throughput platform for screening compounds affecting tissue mechanics, with readouts on compaction, contraction, and elastic modulus.
- Operational Value: Enables parallel testing of up to 48 conditions per plate, supporting dose-response and time-course assays under consistent biomechanical loading.
- Operational Value: Uses defined, minimal components (collagen I, FGM, NaOH) to ensure reproducibility across laboratories and minimize batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human cardiac fibroblast responses in a 3D environment, improving translational relevance over 2D cultures for fibrosis mechanism studies.
- Scientific Value: Allows study of tissue-level phenotypes such as stiffness and extensibility, which correlate with pathological remodeling in fibrotic diseases.
- Operational Value: Supports longitudinal analysis of tissue dynamics over five days, enabling chronic compound exposure studies relevant to preclinical efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing a human-relevant 3D assay for mechanism-of-action confirmation and phenotypic screening in fibrosis programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of fibroblast-matrix interactions and pathway modulation under defined tensile load.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs (tissue diameter, contraction %, Young’s modulus) for hit validation and SAR progression.
- Analytics: Enables automated image-based analysis of tissue geometry and stress-strain profiling for objective, data-driven decision making.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to pathophysiological relevance by measuring tissue stiffness and failure points analogous to fibrotic remodeling.
- Enterprise Reuse: The 48-well format and minimal reagent requirements allow integration into existing screening infrastructures with low adaptation cost.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating cell-matrix contributions to tissue stiffening and contractility.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized cell preparation, hydrogel mixing, and casting parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-predictive data on antifibrotic efficacy and target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on dose-dependent effects on tissue mechanics and actin integrity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary fibroblast culture, hydrogel handling, and sterile technique to ensure cell viability and matrix integrity.
- Dependent on access to a dynamic mechanical riometer with temperature-controlled bath and automated image analysis tools for biomechanical profiling.
- Necessitates standardization of cell seeding density (8.9 million cells/mL) and collagen neutralization across users to minimize variability in tissue formation.
- Adaptation to non-cardiac fibroblasts may require optimization of culture medium and loading conditions to reflect tissue-specific phenotypes.
- Limited to endpoints assessable via tissue geometry and tensile testing; molecular readouts require parallel sampling or fixation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Primary Cardiac Fibroblast Preparation
1:39
Enzymatic Dispersion of Human Cardiac Fibroblasts
2:52
Engineered Connective Tissue Preparation
5:28
Cross-Sectional Area Measurement to Assess ECT Compaction
5:55
Pole Deflection Analysis to Monitor ECT Contraction
6:32
Destructive Tensile Measurement and Stress-Strain Analysis to Assess ECT
8:20
Results: Effect of Actin Polymerization on ECT Compaction, Contraction, and Stiffness
9:22
Conclusion
