Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda
23 Eylül 2021
Sonbahar ordu kurdunda başarılı germline dönüşümü, Spodoptera frugiperda, hiperaktif piggyBac transposase mRNA kullanılarak elde edildi.
Bu protokol, piggyBac tabanlı dönüşüm sistemi kullanılarak transgenik Sonbahar Ordu kurdu üretimini göstermektedir. Bu yöntemlerin sadece Sonbahar Ordu Kurdu'nda değil, aynı zamanda lepidopteran böceklerde de dönüşümün iyileştirilmesine fayda sağlayacağını umuyoruz. Burada açıklanan yöntem, lepidopteran haşere böceklerinin germline dönüşümini verimli hale getirir.
Prosedürü gösteren dr. Xien Chen olacak, laboratuvarımda doktora sonrası bir arkadaş. Bir kutuya 12 erkek pupa ve 12 dişi pupa yerleştirerek başlayın. Yetişkinleri beslemek için kutuya% 10 sakkaroz çözeltisi yerleştirin.
Kutuyu kağıt havluyla kaplayın. İkinci gün eklosyon sonrası, yetişkinleri bir gecede yoğun ışığa maruz bırakın. Eclosion sonrası üçüncü günde, yetişkinleri karanlık bir yere aktarın.
Embriyoları pozisyon bittikten sonra iki saat içinde toplayın. Kağıt havlunun parçasına, buz üzerinde bir Petri kabında tutulan taze yumurtalarla su damlaları ekleyin. Yumurtaları ince bir fırça ile hafifçe cam bir kaydırağa aktarın ve cam bir kaydırağa tek tek hizalayın.
Mikroenjeksiyondan önce yumurtaları buz üzerinde hizalanmış olarak cam slaytları tutun. Mikroliter piggyBac tabanlı EGFP ekspresyon plazmid, mikroliter hiperaktif piggyBac transposase mRNA başına 200 nanogram ve steril damıtılmış suyun bir karışımını otomatik mikroinjektörün kompanzasyon basıncını kullanarak yumurtalara enjekte edin. Enjekte edilen yumurtaları yumurtadan çıkana kadar 27 artı veya eksi bir santigrat derece, 60 artı veya eksi% 10 bağıl nemde tutun.
Yumurtadan çıkan larvaları yapay bir diyetle besleyin ve her larvayı erken lor ve yıldız aşamasında küçük bir kaba aktarın. Pupaları toplayın ve yaklaşık 150 dişi ve 150 erkek pupayı bir kafese yerleştirin. Yumurtaları toplamak için kafese 30 santimetreye 15 santimetre büyüklüğünde birkaç kağıt havlu parçası asın.
Kağıt havluları günlük olarak yumurtalarla toplayın ve yumurtadan çıkana kadar yumurtaları uygun koşullarda saklayın. Yenidoğan larvalarını hareketsiz hale getirmek için beş dakika boyunca dört santigrat derecede tutun ve sonra buz gibi bir tabağa aktarın. Hareketsiz yenidoğan larvalarını floresan stereo mikroskop altında tarayın.
EGFP pozitif yenidoğanları seçin, yaklaşık iki hafta içinde 27 artı veya eksi bir santigrat derecede pupal aşamasına yükseltin. Hiperaktif piggyBac transposaz mRNA sentezlenmiş in vitro%1 Agarose jel kullanılarak tespit edildi. PDS enjekte edilen embriyolarda EGFP sinyali görülmezken, EGFP ekspresyörlü plazmid ve hiperaktif piggyBac transposaz mRNA enjekte edilen embriyolarda EGP floresan gösterilmiş, bu da piggyBac konstrüksiyonun başarılı olduğunu göstermiştir.
G0 yetişkinlerinin kendi kendine çaprazından kaynaklanan yumurtalardan elde edilen G1 larvaları güçlü bir EGFP sinyali gösterdi. Organizatör ve EGFP parçasını içeren bir parça, EGFP pozitif larvalardan izole edilen genomik DNA şablon olarak kullanılarak başarıyla yükseltildi. Bununla birlikte, genomik DNA şablon olarak vahşi tip larvalardan izole edildiğinde aynı parça tespit edilmedi.
Mikroenjeksiyon için yumurtalar mümkün olduğunca taze olmalı ve gelişimlerini yavaşlatmak için mikroenjeksiyondan önce her zaman buzda tutulmalıdır. Bu teknik, araştırmacıların haşere böcek fonksiyonel genomiklerindeki soruları yanıtlamalarının ve bu küresel haşere için genetik kontrol yöntemleri geliştirmelerinin yolunu açmaktadır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, piggyBac tabanlı bir transformasyon sistemi kullanarak, güz ordusu tırtılı Spodoptera frugiperda üzerinde başarılı bir germ hattı transformasyonu için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, lepidoptera zararlılarda transformasyon verimliliğinin artırılmasını vaat etmekte ve bu organizmalarda fonksiyonel genomik araştırmaları geliştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Zararlı böceklerde genetik mühendisliği
- Transformasyonel biyoloji teknikleri
- Fonksiyonel genomik uygulamaları
Arka Plan
- Güz ordusu tırtılı önemli bir tarım zararlısıdır.
- piggyBac transpozon sistemi, gen aktarımındaki verimliliği ile bilinmektedir.
- Germ hattı transformasyonunun iyileştirilmesi, zararlı kontrol stratejileri için kritik öneme sahiptir.
Kullanılan Yöntemler
- Yumurtalara piggyBac plazmidi ve mRNA mikroenjeksiyonu
- Biyolojik model olarak Spodoptera frugiperda
- Transgenik larvaların taranması için floresan mikroskopi
Ana Sonuçlar
- Transgenik larvalarda EGFP'nin başarılı ekspresyonu, piggyBac sisteminin işlevselliğini göstermiştir.
- EGFP ekspresyonu, transgenik larvaları vahşi tip larvalardan ayırmak amacıyla genomik DNA amplifikasyonu ile doğrulanmıştır.
- Transformasyon tekniğinin, genetiği değiştirilmiş zararlı böceklerin üretimi için etkili olduğu kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, Spodoptera frugiperda için güçlü bir germ hattı transformasyon yöntemi oluşturmaktadır.
- Bulgular, tarımsal zararlılar için genetik kontrol önlemlerinin geliştirilmesine katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Güz ordusu tırtılı gibi tarımsal zararlılarda etkin germ hattı transformasyonunun sağlanması, hedef doğrulaması ve zararlı kontrol hatlarında mekanistik risk azaltma için fonksiyonel genomik çalışmalarına olanak tanır. Bu protokol, gen fonksiyonlarını sorgulamak ve hastalıkla ilişkili bir böcek modelinde fenotipik sonuçları değerlendirmek için ölçeklenebilir bir sistem sunarak erken keşif süreçlerini destekler. Başarılı transgenez, genetik zararlı yönetimi stratejileri için aşağı akış taramalarını ve biyobelirteç keşfini kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Genetik kontrol stratejileri için hedeflerin doğrulanması amacıyla zararlı genlerinin fonksiyonel sorgulamasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Tutarlı hedef değerlendirmesi için transgenik hatlar oluşturmaya yönelik tekrarlanabilir bir sistem sunar.
- Öngörücü Değer: Gen bozulmasını bir zararlı modelindeki fenotipik etkilerle ilişkilendirerek mekanistik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Genetik perturbasyonların yüksek kapasiteli taraması için floresan raporcu hatlar oluşturur.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış PCR tabanlı genotiplemeyi ve insersiyon bölgesinin doğrulanması için TAIL-PCR'ı mümkün kılar.
- Analiz Hazırlığı: Bileşik taraması ve fenotipik analizler için uygun, stabil transgenik suşlar üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Keşif aşamasındaki gen doğrulamasını, genetik kontrol mekanizmalarının preklinik değerlendirmesiyle ilişkilendirir.
- Riske Göre Ayarlanmış İlerleme: Saha uygulaması öncesinde gen esansiyelliğinin ve fenotipik etkinin değerlendirilmesini kolaylaştırır.
- Biyobelirteç Uyumu: Duyarlılık veya direnç özellikleriyle ilişkili genetik belirteçlerin tanımlanmasını destekler.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem; transgenez yoluyla hedef doğrulamasını mümkün kılarak, fenotipik tarama aracılığıyla öncü bileşik tanımlamasını destekleyerek ve stabil genetik modeller üzerinden preklinik kararlara veri sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Hedef uygunluğunu değerlendirmek amacıyla sonbahar ordu kurdunda gen nakavtı veya aşırı ekspresyona olanak tanıyarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Genetik veya kimyasal modülatörlerin tekrarlanabilir taraması için standartlaştırılmış transgenik hatlar oluşturur.
- Analitikler: Transgen entegrasyonunu ve ekspresyon seviyelerini ölçmek için kantitatif PCR ve floresan okumaları sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Gen fonksiyonu keşfini, genetik zararlı kontrol yaklaşımlarının preklinik değerlendirmesine bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Portföy genelinde hedef validasyonu için lepidopteran zararlı türleri genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir transgenez platformu kurar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Bir zararlı modelinde doğrudan genetik manipülasyon yoluyla hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış mikroenjeksiyon ve tarama protokolleri ile ölçeklenebilir, tekrarlanabilir bir transgenezis sistemi sunar.
- Stratejik Değer: Hedef gerekliliğindeki biyolojik belirsizliği azaltarak karar verme (go/no-go) süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Bir zararlı modelindeki in vivo fenotipik doğrulamaya dayalı olarak hedeflerin risk ayarlı önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Böcek embriyolojisi ve mikroenjeksiyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Doğrulama için otomatik mikroenjektör, floresan stereo mikroskop ve PCR ekipmanı gereklidir.
- Ekipler arasında embriyo toplama, enjeksiyon koşulları ve transgenik tarama için standartlaştırılmış protokoller gerektirir.
- Farklı lepidoptera türleri için sıcaklık, nem ve diyet protokollerinin uyarlanmasını gerektirir.
- Embriyo kalitesine ve tazeliğine bağlıdır; mikroenjeksiyon verimliliği gelişimsel zamanlamadan etkilenir.
