Name: Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Öğrenin, hiperaktif piggyBac transposase kullanarak Spodoptera frugiperda'da germline dönüşümü protokolünü. Bu yöntem, lepidopteran zararlılarda genetik mühendislik ve fonksiyonel genomik araştırmaları için verimli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rapor edilen araştırma Ulusal Bilim Vakfı I/UCRC tarafından desteklenmektedir, Eklembacaklı Yönetim Teknolojileri Merkezi, Grant No IIP-1821936 ve endüstri ortakları tarafından, Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi Rekabetçi Hibe No. 2019-67013-29351 ve Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, ABD Tarım Bakanlığı (2019-67013-29351 ve 2353057000).

1. hyPBase mRNA'nın in vitro sentezi
NOT: HyPBase dizisinin tam kodlama dizisi sentezlendi ve bir pTD1-Cas9 vektörüne eklendi (bkz. Malzeme Tablosu)pTD1-hyPBase yapısı üretmek için, hyPBase ifade kaseti içeren, T7 promotörü: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polihedrin-3' UTR: poli (A). pTD1-hyPBase yapının tam sırası Tamamlayıcı Malzeme'de sağlanmıştır.
<ol><li>In vitro sentez için şablonun hazırlanması<ol>
<li>İleri astar, 5'- atgcggtgtgaaataccgcagatgcg-3' ve ters astar 5'- tagaggccccaaggttatgctag-3', yüksek kaliteli polimeraz ve şablon olarak pTD1-hyPBase plasmid kullanarak hyPBase ifade kasetini yükseltmek için bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin. NOT: PCR reaksiyonu (50 μL'lik son hacim) 5,0 μL 10x Reaksiyon tamponu içerir, 4,0 μL 10 mM deoksinükleozit trifosfat (dNTP), 1,0 μL plazmid (50 μg/μL), 1,0 μL yüksek kaliteli polimeraz, 10 μM ileri ve ters astarların her biri 1,0 μL, ve 33 μL çekirdeksiz su. Ayarlar şu şekildeydi: 3 dakika boyunca 95 °C'lik bir başlangıç inkübasyonu, ardından 10 s için 98 °C'lik 35 döngü, 15 s için 60 °C ve 2 dakika için 68 °C.</li>
		<li>PCR ürününü taze Tris-asetat-etilenediamin tetraasetik asit (TAE) tamponunda 120 V'ta %1 agarose jel üzerinde 30 dakika boyunca kontrol edin ve jel ekstraksiyon kiti ile ürünü arındırın. NOT: PCR ürün arıtma kitini kullanmayın. pTD1-hyPBase plazmidinin bir iz miktarı bile in vitro sentezin verimliliğini önemli ölçüde azaltır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ticari bir kit kullanarak hyPBase mRNA'nın in vitro sentezi<ol>
<li>Donmuş reaktifleri tamamen çözün, enzimi ve 2x NTP/CAP çözeltisini buzda tutun ve çözülmüş 10x Reaksiyon tamponu oda sıcaklığında bırakın.</li>
		<li>Aşağıdaki bileşenleri ekleyerek reaksiyonun oda sıcaklığında bir araya getirilmiştir: 2x NTP/CAP çözeltisi: 10 μL; 10x Reaksiyon tamponu: 2 μL; Şablon DNA'sı: 0.1-0.2 μg; Enzim karışımı: 2 μL; 20 μL'ye kadar nükleaz içermeyen su.</li>
		<li>Karışımı hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyarak reaktifleri iyice karıştırın ve 2-4 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sentezlenmiş mRNA'nın lityum klorür çökeltimi ile geri kazanımı<ol>
<li>30 μL LiCl Çökeltme Çözeltisi ekleyin, tüpü hafifçe vurarak iyice karıştırın ve ardından ≥ 30 dakika boyunca -20 ° C'de tutun.</li>
		<li>Maksimum hızda 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>Peletı bir kez% 70 etanol 1 mL ile yıkayın, yeniden santrifüjlayın ve üstnatantı dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>Peletin oda sıcaklığında 1-2 dakika kurutun ve ardından peletin 20-40 μL çekirdeksiz su ile yeniden depolayın.</li>
		<li>1 μL mRNA çözeltisi ile 9 μL çekirdeksiz su ile seyreltin. mRNA konsantrasyonu belirlemek için 2 μL alın ve 40 dakika boyunca taze TAE tamponunda 100 V'ta% 1 agarose jel üzerinde mRNA kalitesini kontrol etmek için 8 μL kullanın.</li>
		<li>mRNA çözeltisini aliquotlayın ve bir yıla kadar -70 °C'de dondurulmuş olarak saklayın. NOT: mRNA peletini tamamen kurutmayın; suda eritmek daha zor olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mikroenjeksiyon
<ol><li>Yumurta koleksiyonu<ol>
<li>15 cm x 15 cm x 10 cm'lik bir kutuya 12 erkek pupa ve 12 dişi pupa yerleştirin. Kutuyu kağıt havluyla kaplayın. Yetişkinleri beslemek için kutuya% 10 sakkaroz çözeltisi yerleştirin.</li>
		<li>2. gün eklosyon sonrası, yetişkinleri bir gecede yoğun ışığa maruz bırakın.</li>
		<li>3. gün eklosyon sonrası, yetişkinleri adım 2.1.2'den karanlık bir yere aktarın. Yumurtlamadan sonra embriyoları 2 saat içinde toplayın.</li>
		<li>Buz üzerinde bir Petri kabında tutulan taze yumurtalarla kağıt havlu parçasına damla su ekleyin. Yumurtaları ince bir fırça ile hafifçe cam bir kaydırağa aktarın ve cam bir kaydırağa tek tek hizalayın. Mikroenjeksiyondan önce cam slaytları hizalanmış yumurtalarla buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroenjeksiyon kurulumu<ol>
<li>Transgenik gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ifade edici plazmid (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL) karışımı enjekte edin ve otomatik mikroenjektörün kompanzasyon basıncını kullanarak yumurtalara steril damıtılmış su enjekte edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Enjekte edilen yumurtaları yumurtadan çıkana kadar 27 ± 1 °C, 60 ± % 10 bağıl nemde tutun.</li>
		<li>Yumurtadan çıkan larvaları yapay bir diyetle besleyin ve her larvayı erken 3rd başlangıç aşamasında (~ 6 mm uzunluğunda ve vücut rengi siyaha döner) küçük bir kaba aktarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Floresan tarama ve genetik geçiş
<ol><li>Pupaları toplayın ve ~150 dişi pupa ve ~150 erkek pupayı 35 cm x 35 cm x 35 cm kafese yerleştirin. Yumurtaları toplamak için kafese birkaç parça kağıt havlu (~30 cm x 15 cm) asın.</li>
	<li>Kağıt havluları günlük yumurtalarla toplayın ve yumurtaları yumurtadan çıkana kadar 27 ± 1 °C, 60 ±% 10 bağıl nemde tutun.</li>
	<li>Yenidoğan larvalarını hareketsiz hale getirmek için 5 dakika boyunca 4 °C'de tutun ve ardından buz gibi bir tabağa aktarın.</li>
	<li>Hareketsiz yenidoğan larvalarını floresan stereomikroskop altında tarayın. EGFP pozitif yenidoğanları seçin, 27 ± 1 ° C'de ~ 2 hafta içinde pupal aşamasına yükseltin ve ventral karın segmentlerindeki fenotip farklılıklarına göre cinsiyete göre ayırın. NOT: Dişi pupa sekizinci karın segmentinde yarık benzeri bir genital açıklığa ve dokuzuncu ve onuncu segmentlerin sefalik kenar boşlukları genital açıklığa doğru kıvrılır. Erkek pupanın genital açıklığı dokuzuncu karın segmentinde hafif bir yüksekliğe sahiptir.</li>
	<li>EGFP pozitif pupaları ve karşı cinsin vahşi tip pupalarını bir erkeğe yerleştirin: bir kafese 1:1 kadın oranı. Sib- sonraki nesilleri üretmek için EGFP ifade yetişkinleri çapraz.</li>
</ol>4. Transgenik yerleştirmenin PCR tespiti
<ol><li>Üreticinin talimatlarını takip eden herhangi bir ticari genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak vahşi tip ve EGFP pozitif bireysel larvalardan genomik DNA çıkarın.</li>
	<li>Genomik DNA'yı şablon olarak kullanarak pcr reaksiyoni gerçekleştirin; ie1 organizatör bölgesinde bulunan 5'- acgtacgctcctcggttccgttcc-3' ileri astar; ve dönüşüm vektörün EGFP bölgesinde bulunan 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' ters astar.</li>
	<li>Her PCR reaksiyonu (40 μL'lik son hacim) 20 μL polimeraz karışımı, 1,0 μL genomik DNA (40 μg/μL), 10 μM ileri ve ters astarın her biri 1,0 μL ve 17 μL çekirdeksiz su içerecek şekilde ayarlayın. Aşağıdaki ayarları kullanın: 3 dakika boyunca 95 °C'lik bir başlangıç inkübasyonu, ardından 20 s için 95 °C,20 s için 56 °C ve 40 s ayar için 68 °C'lik 35 döngü.</li>
	<li>PCR ürünlerini 30 dakika boyunca 120 V'te% 1 agarose jel üzerinde kontrol edin.</li>
</ol>5. Transgenik ekleme bölgesinin belirlenmesi
<ol><li>EGFP pozitif böceklerde transgene eklemenin entegrasyon alanını belirlemek için şablon olarak genomik DNA kullanarak yüksek verimli TAIL-PCR gerçekleştirin.<ol>
<li>PCR reaksiyonlarını başka bir yerde açıklanan adımları izleyerekgerçekleştirin 9.<ol>
<li>Üç astar kullanın, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', ve P3: 5'-atgtcctaaatgcagcgacggattcgcgct-3', piggyBac vektörüne özgü, 3 tur PCR reaksiyonunda.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tümleştirme sitesini belirlemek için son PCR ürünlerini sıralayın.</li>
</ol>

<ol><li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li>
<li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).</li>
<li>Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+sexing+system+for+Ceratitis+capitata+%28Diptera%3A+Tephritidae%29+based+on+female-specific+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transformation+with+piggyBac%3A+getting+the+number+of+injections+just+right%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right.</a> Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).</li>
<li>Otte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+transformation+rates+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving genetic transformation rates in honeybees.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16534(2018).</li>
<li>Eckermann, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+transposase+improves+transformation+efficiency+in+diverse+insect+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).</li>
<li>Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+systemic+RNA+interference+defective+protein+1+enhances+RNAi+efficiency+in+a+lepidopteran+insect%2C+the+fall+armyworm%2C+in+a+tissue-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner.</a> RNA Biology. , 1-9 (2020).</li>
<li>Liu, Y. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+thermal+asymmetric+interlaced+PCR+for+amplification+of+unknown+flanking+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.</a> Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Xu, H., O'Brochta, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+technologies+for+genetically+manipulating+the+silkworm+Bombyx+mori%2C+a+model+Lepidopteran+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487(2015).</li>
<li>Wu, S. C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+is+a+flexible+and+highly+active+transposon+as+compared+to+sleeping+beauty%2C+Tol2%2C+and+Mos1+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li>
<li>Dreyfus, M., Régnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28A%29+tail+of+mRNAs%3A+bodyguard+in+eukaryotes%2C+scavenger+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Transpozisyon oranının düşük olması ve transgenik bileşenleri taze embriyolara ulaştırmanın zorluğu, özellikle sipariş olan Lepidoptera'dan gelen birçok model olmayan böcekte germline dönüşümünün başarısını sınırlar. Germline dönüşüm oranını artırmak için, en yaygın kullanılan piggyBac transposase'nin (hyPBase) hiperaktif bir sürümü geliştirildi7,10. Bugüne kadar, lepidopteran böceklerde başarılı germline dönüşümü esas olarak model böcek ipekböceği, ...

Sonbahar ordu kurdu (FAW), Spodoptera frugiperda, Amerika'nın tropikal ve subtropikal bölgelerine özgüdür. Şu anda, bu dünya çapında 100'den fazla ülkede yıkıcı bir böcek otobur1. FAW larvaları, bazı önemli temel gıda bitkileri de dahil olmak üzere 350'den fazla konak bitki ile beslenir2. FAW yetişkinlerinin güçlü göç yeteneği, Amerika'dan diğer yerlere hızla yayılmasına katkıda bulunur1,2. Sonuç olarak, bu böcek şimdi uluslararası gıda güvenliğini tehdit ediyor. Yeni teknolojilerin uygulanması FAW'da ileri çalışmaları kolaylaştırabilir ve bu zararlıyı yönetmek için yeni stratejiler sağlayabilir.
Böcek germline dönüşümü gen fonksiyonunu incelemek ve genetik kontrolde kullanılmak üzere transgenik böcekler üretmek için kullanılmıştır3,4. Böceklerde genetik dönüşümü sağlamak için kullanılan çeşitli yöntemler arasında, piggyBac element tabanlı yöntem en çok kullanılan yöntemdir5. Bununla birlikte, düşük transpozisyon oranı nedeniyle, model olmayan böceklerde transgenez yapmak hala zordur. Son zamanlarda, piggyBac transposase 'nin (hyPBase) hiperaktif bir sürümü geliştirildi6,7. Germline dönüşümü FAW'da yakın zamanda elde edildi8Lepidopteran böceklerinde hyPBase'i kullanan ilk rapordur. Bu raporda, transgenik FAW oluşturmada hyPBase mRNA kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi açıklanmıştır. Burada açıklanan yöntem, diğer lepidopteran böceklerinin dönüşümini sağlamak için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>1.5" Dental Pamuk Ruloları</td><td>PlastCare USA</td><td>8542025591</td><td>YETİŞTİRME</td></tr><tr><td>1 oz Sufle Kabı Kapakları</td><td>DART</td><td>PL1N</td><td></td></tr><tr><td>1 oz Sufle Kapları</td><td>DART</td><td>P100N</td><td>YETİŞTİRME</td></tr><tr><td>48 oz Plastik Şarküteri Kapları</td><td>Genpack</td><td>AD48</td><td>YETİŞTİRME</td></tr><tr><td>Eklenti Filtre Seti (Yeşil)</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-BLFS-GR</td><td>TARAMA</td></tr><tr><td>Borosilikat Cam</td><td>Sutter Aletleri</td><td>BF100-50-10</td><td>ENJEKSİYON</td></tr><tr><td>Borosilikat Cam</td><td>SUTTER CİHAZI</td><td>BF-100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Kapsamı</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td>TARAMA</td></tr><tr><td>Tüy Siklet Forseps</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>YETİŞTİRME</td></tr><tr><td>Oluk Koruması</td><td>ThermWell Ürünler</td><td>VX620</td><td>YETİŞTİRME</td></tr><tr><td>Ters Çevrilmiş Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>ENJEKSİYON</td></tr><tr><td>Mikroenjektör</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td>ENJEKSİYON</td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aletleri</td><td>P-1000</td><td>ENJEKSİYON</td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>VWR</td><td>16004-22</td><td>ENJEKSİYON</td></tr><tr><td>NightSea Tam Sistem NightSea</td><td>LLC</td><td>SFA-RB-DIM</td><td>Tarama</td></tr><tr><td>Azot Gazı</td><td>AWG/ Scott-Gross</td><td>NI 225</td><td>ENJEKSİYON</td></tr><tr><td>Kağıt Havlu</td><td>Bounty</td><td>&nbsp; 43217-45074</td><td>YETİŞTİRME</td></tr><<tr><td>em>Spodoptera frugiperda Yapay Diyet</td><td>Southland Products, Inc</td><td>N/A [İstek Tür/Miktar]</td><td>YETİŞTİRME</td></tr><<tr><td>em>Spodoptera frugiperda Eggs</td><td>Benzon Research, Inc</td><td>N/A [İstek Tür/Miktar]</td><td>YETİŞTİRME</td></tr><tr><td>Taq MasterMix</td><td></td><td></td><td>polimeraz karışımı</td></tr></tbody></table>

hiperaktif piggybac transposase aracılı germline dönüşümü sonbahar ordu kurdu, spodoptera frugiperda

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Genetik kargonun transpoze edilebilir elementler kullanılarak böcek genomlarına istikrarlı bir şekilde yerleştirilmesi, fonksiyonel genomik çalışmalar ve genetik haşere yönetim stratejileri geliştirmek için güçlü bir araçtır. Böcek dönüşümünde en çok kullanılan transpoze edilebilir element piggyBacve piggyBactabanlı germline dönüşümü model böceklerde başarıyla gerçekleştirildi. Bununla birlikte, bu teknolojiyi tarım zararlılarını içeren model olmayan böceklerde çalıştırmak hala zordur. Bu makale, hiperaktif piggyBac transposase (hyPBase) kullanılarak küresel bir tarım zararlısının, sonbahar ordu kurdunun (FAW), Spodoptera frugiperda'nıngermline dönüşümini rapor ediyor.
Bu çalışmada hyPBase mRNA embriyo mikroenjeksiyonlarında yardımcı plazmid yerine üretilmiş ve kullanılmıştır. Bu değişiklik, transgenik FAW'ın başarılı bir şekilde üretilmesine yol açtı. Ayrıca transgenik hayvanların taranması, transgene yerleştirmenin PCR tabanlı hızlı tespiti ve entegrasyon sahasının termal asimetrik interlaced PCR (TAIL-PCR) tabanlı belirlenmesi yöntemleri de açıklanmıştır. Bu nedenle, bu makale FAW ve diğer lepidopteran böceklerde domuzbactabanlı transgenez kolaylaştıracak transgenik FAW üretmek için bir protokol sürmektedir.

HyPBase içeren T7 promotörünün ifadesi için bir yapı: polihedrin-5'UTR: hyPBase: polihedrin-3'UTR: poli (A) sinyali oluşturuldu (Şekil 1A) ve hyPBase mRNA in vitro sentezlemek için ~2.2 kb PCR parçası olarak yükseltildi (Şekil 1B). Daha sonra hyPBase mRNA üretildi ve agarose jel elektroforezise tabi tutuldu. Beklenen boyuttaki mRNA (~1,1 kb bant) %1 agarose jel üzerinde tespit edildi (Şekil 1C).
...

Sonbahar ordu kurdunda başarılı germline dönüşümü, Spodoptera frugiperda, hiperaktif piggyBac transposase mRNA kullanılarak elde edildi.

Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Bu protokol, piggyBac tabanlı dönüşüm sistemi kullanılarak transgenik Sonbahar Ordu kurdu üretimini göstermektedir. Bu yöntemlerin sadece Sonbahar Ordu Kurdu'nda değil, aynı zamanda lepidopteran böceklerde de dönüşümün iyileştirilmesine fayda sağlayacağını umuyoruz. Burada açıklanan yöntem, lepidopteran haşere böceklerinin germline dönüşümini verimli hale getirir.Prosedürü gösteren dr. Xien Chen olacak, laboratuvarımda doktora sonrası bir arkadaş. Bir kutuya 12 erkek pupa ve 12 dişi pupa yerleştirerek başlayın. Yetişkinleri beslemek için kutuya% 10 sakkaroz çözeltisi yerleştirin.Kutuyu kağıt havluyla kaplayın. İkinci gün eklosyon sonrası, yetişkinleri bir gecede yoğun ışığa maruz bırakın. Eclosion sonrası üçüncü günde, yetişkinleri karanlık bir yere aktarın.Embriyoları pozisyon bittikten sonra iki saat içinde toplayın. Kağıt havlunun parçasına, buz üzerinde bir Petri kabında tutulan taze yumurtalarla su damlaları ekleyin. Yumurtaları ince bir fırça ile hafifçe cam bir kaydırağa aktarın ve cam bir kaydırağa tek tek hizalayın.Mikroenjeksiyondan önce yumurtaları buz üzerinde hizalanmış olarak cam slaytları tutun. Mikroliter piggyBac tabanlı EGFP ekspresyon plazmid, mikroliter hiperaktif piggyBac transposase mRNA başına 200 nanogram ve steril damıtılmış suyun bir karışımını otomatik mikroinjektörün kompanzasyon basıncını kullanarak yumurtalara enjekte edin. Enjekte edilen yumurtaları yumurtadan çıkana kadar 27 artı veya eksi bir santigrat derece, 60 artı veya eksi% 10 bağıl nemde tutun.Yumurtadan çıkan larvaları yapay bir diyetle besleyin ve her larvayı erken lor ve yıldız aşamasında küçük bir kaba aktarın. Pupaları toplayın ve yaklaşık 150 dişi ve 150 erkek pupayı bir kafese yerleştirin. Yumurtaları toplamak için kafese 30 santimetreye 15 santimetre büyüklüğünde birkaç kağıt havlu parçası asın.Kağıt havluları günlük olarak yumurtalarla toplayın ve yumurtadan çıkana kadar yumurtaları uygun koşullarda saklayın. Yenidoğan larvalarını hareketsiz hale getirmek için beş dakika boyunca dört santigrat derecede tutun ve sonra buz gibi bir tabağa aktarın. Hareketsiz yenidoğan larvalarını floresan stereo mikroskop altında tarayın.EGFP pozitif yenidoğanları seçin, yaklaşık iki hafta içinde 27 artı veya eksi bir santigrat derecede pupal aşamasına yükseltin. Hiperaktif piggyBac transposaz mRNA sentezlenmiş in vitro%1 Agarose jel kullanılarak tespit edildi. PDS enjekte edilen embriyolarda EGFP sinyali görülmezken, EGFP ekspresyörlü plazmid ve hiperaktif piggyBac transposaz mRNA enjekte edilen embriyolarda EGP floresan gösterilmiş, bu da piggyBac konstrüksiyonun başarılı olduğunu göstermiştir.G0 yetişkinlerinin kendi kendine çaprazından kaynaklanan yumurtalardan elde edilen G1 larvaları güçlü bir EGFP sinyali gösterdi. Organizatör ve EGFP parçasını içeren bir parça, EGFP pozitif larvalardan izole edilen genomik DNA şablon olarak kullanılarak başarıyla yükseltildi. Bununla birlikte, genomik DNA şablon olarak vahşi tip larvalardan izole edildiğinde aynı parça tespit edilmedi.Mikroenjeksiyon için yumurtalar mümkün olduğunca taze olmalı ve gelişimlerini yavaşlatmak için mikroenjeksiyondan önce her zaman buzda tutulmalıdır. Bu teknik, araştırmacıların haşere böcek fonksiyonel genomiklerindeki soruları yanıtlamalarının ve bu küresel haşere için genetik kontrol yöntemleri geliştirmelerinin yolunu açmaktadır.

hyperactive-piggybac-transposase-mediated-germline-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

RNAi spesifik mRNA transkript 1-2 demonte model organizmalar, transgenesis gen işlevleri işleyebilirsiniz. Bu protokol, necromenic nematod içine stably iletilen DNA ve geçici çift iplikli RNA tanıtmak için gerekli teknikleri göstermek için...

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) dünya çapında bir tarım zararlısıdır. Biyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılması, medfly popülasyonlarını kontrol etmenin ve böylece ekonomik etkiyi azaltmanın anahtarıdır. Embriyo mikroenjeksiyonu, bu türde hem germ hattı transformasyonuna hem de ters genetik çalışmalara olanak sağlayan temel bir araçtır.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile böcek embriyonlarından morfojenezini Görüntüleme tekniğin durumu haline gelmiştir. Bu protokol ana hatlarıyla ve Tribolium castaneum embriyolar için uygun üç montaj teknikleri karşılaştırır, canlı görüntüleme için uygun iki yeni ısmarlama transjenik çizgileri sunar, önemli bir kalite kontrol anlatılır ve mevcut deney sınırlamaları gösterir.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

Burada iletişim kuralları için toplama ve microinjecting precellular Batı Mısır rootworm embriyo germline dönüştürme ve CRISPR/Cas9-genom düzenleme gibi fonksiyonel genomik deneyleri yapmak amacıyla mevcut.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

Burada kriket yumurtaları enjekte etmek için bir protokol salıyoruz, kriketteki birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere.

Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta

Genom düzenlemeden sonra mutant suşları oluşturmak ve sürdürmek için yumurtaların yetiştirilmesi, mikroenjeksiyonu ve ateş aşındırıcı Thermobia domestica'nın verimli çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo'daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Parazitik nematodlar Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti için fonksiyonel genomik araç seti transgenez, CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez ve RNAi'yi içerir. Bu protokol, transgenleri ve CRISPR bileşenlerini S. stercoralis ve S . ratti'ye tanıtmak için intragonadal mikroenjeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterecektir.

Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi

Öğrenin, hiperaktif piggyBac transposase kullanarak Spodoptera frugiperda'da germline dönüşümü protokolünü. Bu yöntem, lepidopteran zararlılarda genetik mühendislik ve fonksiyonel genomik araştırmaları için verimli bir araç sunar.

Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda

Daha fazla video keşfet