Name: pHa duyarlı Floresan Lipid Analog ND6 ile Membran Lipid Devir Hızının Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Öğrenin canlı hücrelerde ND6 floresan lipid probu kullanarak ekzositoz ve endositoz dinamiklerini izleme yöntemini. Bu teknik sinir hücrelerinde membran lipid trafiğinin doğrudan ölçümünü sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Florida Atlantik Üniversitesi Lisans Araştırma ve Araştırma Ofisi hibesi (MJS), Florida Sağlık Bakanlığı Ed ve Ethel Moore Pilot Hibesi 20A17 (QZ), Alzheimer Derneği hibesi AARG-NTF-19-618710 (QZ) ve NIA R21 hibesi AG061656-01A1 (QZ) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıdaki protokol şunları içerir: (1) iyi kurulmuş bir protokole dayalı fare hipokampal ve kortikal kültürleri oluşturmak için basitleştirilmiş bir prosedür22, (2) canlı nöronlar için bir epifloresan mikroskop kurulumuna kısa bir giriş, (3) fare nöronlarında ND6'nın yüklenmesi ve görüntülenmesinin ayrıntılı bir açıklaması, (4) ND6 sinyali ile membran trafiğinin ölçülmesi hakkında bir tartışma. Tüm prosedürler Florida Atlantic Üniversitesi'ndeki biyogüvenlik ve IACUC yönergelerini takip eder. ND6'nın sentezi daha önce20 olarak tanımlanmıştır.
1. Fare hipokampal ve kortikal kültürlerinin hazırlanması
NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm adımlar biyogüvenlik seviyesi 2 laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir. Tüm alet ve malzemeleri sterilize edin.
<ol><li>Cam lamelleri çok kuyulu kültür plakalarına yerleştirmek için 5 numara forseps kullanın. NOT: Örneğin, 24 oyuklu bir plaka 12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> lameller için idealdir.</li>
	<li>Hücre kültürü yüzeyini kaplamak için uygun hacimde hücre dışı matrisler ekleyin (örneğin, 12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> lamel başına 75 μL bazal membran matris çözeltisi; Malzeme Tablosuna bakınız)</li>
	<li>Hazırlanan plakaları, bazal membran matrisinin çapraz bağlanmasına izin vermek için doku kültürü inkübatörüne (%5 CO2, 0 nem ve 37 ° C) 1-4 saat yerleştirin.</li>
	<li>Hayvanları kurban edin, kafatasını açın ve tüm beyni% 20 fetal sığır serumu (H + 20) içeren 3 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) içeren 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Beyni orta hat boyunca kesin ve kontaminasyonu azaltmak için korteksleri ve hipokampusları laminer akışlı bir diseksiyon başlığında ayırın.</li>
	<li>Dokuları küçük parçalara (~1 mm3) kesmek için mikromakas kullanın. Bu dokuları 5 mL H+20 içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Dokuları üç kez 5 mL H+20 ve üç kez 5 mL HBSS ile yıkayın.</li>
	<li>Etilendiamin tetraasetik asit ile 1.5 mL %1 tripsin ekleyin ve enzim sindirimi için 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Adım 1.6'yı tekrarlayın ve sonunda HBSS'yi aspire etmek için vakum kullanın.</li>
	<li>Ateşle parlatılmış bir cam pipet kullanarak dokuları 2.95 g / L MgSO4 • 7H2O içeren 1 mL HBSS'de mekanik olarak ayırın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 400 × g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve ~ 10.000.000 hücre / ml'lik bir konsantrasyon elde etmek için hücreleri uygun bir hacimde kültür ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri ~ 1.000.000 hücre /cm2'de kaplayın ve hücrenin cam lamellere bağlanmasını kolaylaştırmak için kültürü inkübatöre (%5CO2, 0 nem ve 37 °C) 1-4 saat yerleştirin.</li>
	<li>Uygun hacimde kültür ortamı ekleyin (ör., 24 oyuklu bir plaka için oyuk başına 1 mL). 1 hafta sonra aynı hacimde kültür ortamı ekleyin. 2 hafta sonra, mevcut kültür ortamının yarısını her hafta yeni ortamla değiştirin.</li>
</ol>2. Canlı hücre floresan görüntüleme için mikroskop kurulumu
NOT: Örnek bir görüntüleme kurulumu (Şekil 5) en azından ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu (Malzeme Tablosuna bakın), otomatik deklanşörlü floresan ışık kaynağı, floresan filtre setleri (örneğin, ND6 görüntüleme için, uyarma için 405/10 BP, dikroik için 495 LP ve emisyon için 510/20 BP kullanın) ve tümü görüntü elde etme yazılımı (Malzeme Tablosu) tarafından kontrol edilen yüksek hassasiyetli bir kamera (Malzeme Tablosu) içerir.
<ol><li>Canlı hücre floresan görüntüleme için sıcaklık kontrolüne ve çözelti giriş/çıkışına izin veren bir görüntüleme odası hazırlayın. NOT: Örneğin, bu protokolde bir ısıtma platformuna sabitlenmiş modifiye edilmiş bir açık banyo görüntüleme odası kullanılmıştır (Şekil 6).</li>
	<li>Perfüzyon solüsyonlarını değiştirmek ve görüntüleme sırasında tanımlanmış zaman noktalarında elektrik uyarıcısı vermek için programlanabilir bir cihaz kurun. NOT: Kantitatif analizler için donanım ve yazılım senkronizasyonu gereklidir (Şekil 7). Örneğin, bu protokolde, çok kanallı bir perfüzyon sistemini ve bir kare nabız stimülatörünü kontrol eden otomatik bir anahtarlama cihazını kontrol eden bir bilgisayar programını başlatmak için görüntüleme kamerasından bir tetik çıkışı kullanıldı.</li>
	<li>İki veya daha fazla floresan raportörü birlikte görüntülemek için, filtre setlerini sırayla değiştirerek veya aynı anda farklı floresan emisyonlarını bölerek ve aynı kameraya yansıtarak çok kanallı floresan görüntüleme gerçekleştirin.</li>
</ol>3. Nöronal kültürlerde ND6'nın yüklenmesi ve görüntülenmesi
<ol><li>Uygun miktarda ND6'yı tartın, dimetilsülfoksit (DMSO) içinde çözün ve oda sıcaklığında çözünmesine izin verin; kısaca sonicate (örneğin, 3 dakika). Büyük boya agregalarını çıkarmak için 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak ham stok çözeltisini filtreleyin. Filtrasyondan sonra, ε = 10.700 M-1 cm-1 kullanarak geleneksel veya mikro hacimli bir spektrofotometre kullanarak 405 nm'de absorpsiyon spektroskopisi ile boya konsantrasyonunu belirleyin.</li>
	<li>Uygulamadan önce, banyo solüsyonunu kullanarak stok çözeltisini 1 μM konsantrasyona seyreltin. Stok çözeltisini karanlıkta oda sıcaklığında tutun.</li>
	<li>Endozomların ve sinaptik veziküllerin etiketlenmesi<ol><li>Endozomlar gibi endositozlu membran bölmelerini her yerde etiketlemek için, ND6 stok çözeltisini (örneğin, DMSO'da 1 mM) 1 μM'lik son konsantrasyonda kültür ortamına ekleyin ve% 5 CO2,% 100 nem ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. SV etiketlemesinin kapsamını azaltmak için, spontan nöronal aktiviteyi farmakolojik olarak baskılayın. Örneğin, aksiyon potansiyellerini bloke etmek için tetrodotoksin veya uyarıcıiletimi inhibe etmek için 2,3-diokso-6-nitro-1,2,3,4-tetrahidrobenzo[f]kinoksalin-7-sülfonamid (NBQX) ve D-(-)-2-amino-5-fosfonopentanoik asit (D-AP5) kullanın.</li>
		<li>SV'leri seçici olarak etiketlemek için, presinaptik ekzo-/endositozu uyandırmak için kısa ama güçlü bir stimülasyon kullanın. İlk olarak, kültür lamel(ler)ini oda sıcaklığında 2 mL normal Tyrode çözeltisi içeren 35 mm'lik <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> bir Petri kabına aktarın. İkinci olarak, ND6 stok çözeltisini yüksek K+ Tyrode çözeltisi (90 mM KCl) içinde 1 μM'lik son konsantrasyonda seyreltin. Üçüncüsü, Petri kabındaki normal Tyrode solüsyonunu ND6 içeren yüksek K+ Tyrode solüsyonu ile değiştirin ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>ND6 etiketli hücre kültürünü, 10 μM NBQX ve 10 μM D-AP5 içeren önceden ısıtılmış normal Tyrode çözeltisi ile doldurulmuş görüntüleme odasına aktarın.</li>
	<li>Perfüzyon hızını ~ 0.2 mL / s'ye ayarlayın (yani, saniyede 1 damla) ve kültürdeki aşırı ND6'yı gidermek için NBQX ve D-AP5 içeren önceden ısıtılmış normal Tyrode çözeltisinin perfüzyonunu başlatın.</li>
	<li>Odağı ayarlayın ve bağlı nöritler taşıyan sağlıklı ve iyi yayılmış nöronları içeren uygun görüş alanını bulun. Çözülmemiş boya kolloidleri içeren alanlardan kaçının.</li>
	<li>En iyi görüntüleme ayarlarını belirlemek için ND6 yüklü hücreleri farklı pozlama süreleriyle görüntülemeyi deneyin. NOT: En iyi pozlama süresi için, ortaya çıkan görüntüdeki en yüksek piksel floresan yoğunluğu, bit aralığının yaklaşık yarısıdır (örneğin, 16 bitlik bir görüntü için bit aralığı 0 ila 65.535 arasındadır), bu da asidik banyo çözeltisi uygulandığında floresanda daha fazla artışa izin verecektir. Seçilen pozlama süresi tüm ND6 görüntüleme için kullanılmalıdır.</li>
	<li>Stimülasyon ve perfüzyon protokolünü, çerçeve aralığını ve toplam süreyi ayarlayın. Örneğin, aşağıdaki protokolde, 30 s'lik bir taban çizgisi, 10 s'lik 30 Hz'lik bir elektrik alan stimülasyonu, 50 s'lik bir geri kazanım, 120 s'lik 90 mM K+, 60 s'lik geri kazanım, 50 mM NH4Cl ile 60 s'lik Tyrode çözeltisi, pH 5.5'te 60 s'lik Tyrode çözeltisi ve 3 s'lik bir çerçeve aralığı kullanın.</li>
	<li>Senkronize stimülasyon ve perfüzyon eşliğinde görüntü alımını başlatın. Görüntüleme sırasında simülasyonu ve çözüm alışverişini izleyin.</li>
	<li>Görüntüleme bittikten sonra perfüzyonu durdurun, lamel çıkarın ve bir sonraki deneme için görüntüleme odasını temizleyin.</li>
</ol>4. ND6 floresansındaki bir değişiklikle membran kaçakçılığının ölçülmesi
<ol><li>Tüm görüntü dosyalarını yedekleyin ve/veya elektronik bir kopyasını alın.</li>
	<li>Veri çıkarma için bir analiz programı seçin, örneğin ImageJ24 ve/veya FIJI25 gibi açık kaynaklı bir görüntü analiz yazılımı.</li>
	<li>Bir görüntü yığınını açın veya analiz programına aktarın.</li>
	<li>İlk görüntüyü referans olarak ayarlayın ve geri kalanını, xy sürüklenmesinden kaynaklanan artefaktları azaltacak olan Rigid Registration26 gibi işlevleri/eklentileri kullanarak ona hizalayın. Örnek görüntüler için Şekil 8'e bakın.</li>
	<li>Bir referans görüntü oluşturmak için 30 sn ön taban çizgisi sırasında elde edilen tüm görüntülerin ortalamasını alın. İleride başvurmak üzere bu resmin bir kopyasını saklayın.</li>
	<li>Temel ortalaması alınan görüntüden ikili bir görüntü oluşturmak için yoğunluk eşiğini ayarlayın.</li>
	<li>Bağlanan nöritleri veya hücreleri ayırmak için ImageJ'deki Watershed'i veya başka bir programdaki benzer işlevleri kullanın.</li>
	<li>Hücre zarlarına, endozomlara, lizozomlara veya sinaptik butonlara karşılık gelen ilgi alanlarını (ROI'ler) istemek için uygun alan boyutu ve dairesellik ile Parçacığı Analiz Et işlevini kullanın. Seçilen tüm ROI'leri kaydedin.</li>
	<li>Görüş alanı içindeki hücresiz bölgelerde dört arka plan ROI'si seçin.</li>
	<li>Görüntü yığınının her karesindeki her bir ROI için ortalama piksel yoğunluklarını ölçün ve sonuçları istatistiksel analiz için dışa aktarın.</li>
	<li>Arka plan ROI'lerinin ortalama yoğunluğunu, her ROI için ortalama piksel yoğunluklarından çıkarılacak olan temel gürültü olarak hesaplayın.</li>
	<li>Normalizasyon için 0 olarak tanımlanan maksimum floresan yoğunluğunu elde etmek için pH 5.5 Tyrode çözeltisinin uygulanması sırasında seçilen her ROI için en yüksek üç ortalama yoğunluğun ortalamasını alın.</li>
	<li>Normalizasyon için %0 olarak tanımlanan minimum floresan yoğunluğunu ayarlamak için 50 mM NH4Cl uygulaması sırasında seçilen her ROI için en düşük üç ortalama yoğunluğun ortalamasını alın.</li>
	<li>Her ROI için bağıl floresan değişikliklerini kendi %0 ve 0 yoğunluklarına göre hesaplayın. Bireysel ROI verilerinden ortalama floresan değişikliklerini, değişiklik kinetiklerini ve diğer değerleri/grafikleri türetin.</li>
</ol>

<ol><li>Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).</li>
<li>Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+membranes+and+beta-amyloid%3A+a+harmful+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Pept+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection.</a> Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).</li>
<li>Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis%3A+proteins+and+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Exocytosis: proteins and perturbations.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).</li>
<li>Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+in+regulated+exocytosis%3A+what+are+they+doing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Lipids in regulated exocytosis: what are they doing.</a> Frontiers in Endocrinology. 4, 125(2013).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112 (4), 519-533 (2003).</li>
<li>Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+cellular+membranes%3A+a+convergence+with+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386(2017).</li>
<li>Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+pHluorin+for+quantitative%2C+kinetic+and+high-throughput+analysis+of+endocytosis+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587(2016).</li>
<li>Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+vesicle+cycling+in+presynaptic+terminals+using+the+genetically+encoded+probe+synaptopHluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li>
<li>Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+biophysical+properties+of+lipid+membranes+by+environment-sensitive+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).</li>
<li>Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+recycling+by+staining+and+destaining+vesicles+with+FM+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).</li>
<li>Gaus, K., Zech, T., Harder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+membrane+microdomains+by+Laurdan+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy.</a> Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).</li>
<li>Kahms, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pH-sensitive+lipid+based+exo-endocytosis+tracers+reveal+fast+intermixing+of+synaptic+vesicle+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18(2018).</li>
<li>Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+of+molecular+probes+based+on+the+fluorophore+4-amino-1%2C8-naphthalimide%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Chemical+Letters%22%5BJournal%5D)">New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide.</a> Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).</li>
<li>Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l%2C8-Naphthalimide+based+DNA+intercalators+and+anticancer+agents.+A+systematic+review+from+2007+to+2017%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).</li>
<li>Ulla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+emitting+1%2C8-naphthalimides+with+electron+transport+properties+for+organic+light+emitting+diode+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications.</a> Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).</li>
<li>Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+and+fluorescent+anion+sensors%3A+An+overview+of+recent+developments+in+the+use+of+1%2C8-naphthalimide-based+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors.</a> Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).</li>
<li>Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+intramolecular+charge+transfer+%28ICT%29+process+in+push-pull+systems%3A+Effect+of+nitro+groups%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups.</a> RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvatochromic+and+pH-sensitive+fluorescent+membrane+probes+for+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells.</a> ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).</li>
<li>Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+breadth+of+4-amino-1%2C8-naphthalimide+photophysical+properties+through+substitution+of+the+naphthalimide+core%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+-+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core.</a> Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).</li>
<li>Liu, G. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+synaptic+transmission+at+single+hippocampal+synaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons.</a> Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).</li>
<li>Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+provide+an+optical+signal+specific+to+full+collapse+fusion+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).</li>
<li>Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium+chloride+alters+neuronal+excitability+and+synaptic+vesicle+release%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5061(2017).</li>
<li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).</li>
<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).</li>
<li>DelBove, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+modulation+between+amyloid+precursor+protein+and+synaptic+membrane+cholesterol+revealed+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging.</a> Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).</li>
<li>Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+sterols+are+essential+for+synaptic+vesicle+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling.</a> Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200(1992).</li>
<li>Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis-endocytosis+with+pH-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

1,1′-dioktadesil-3,3,3′,3′-tetrametilindokarbosiyanin (DiI) ve 3,3′-Dioktadesilinoksakarbosiyanin perklorat (DiO) gibi lipid bazlı boyalar, hücre morfolojisini göstermek ve nöronların akson projeksiyonları gibi hücresel süreçleri izlemek için uzun süredir kullanılmaktadır. FM1-43 gibi stiril boyalar, ekzositoz34 çalışması için icat edilmiş ve başarıyla kullanılmıştır. Düşük membran afiniteleri nedeniyle, plazma membranında kalan boyalar sürekli perfüzyonla yıkanırken, sıkıştıkları endositozlu vezi...

Lipid çift tabakası, en yaygın biyomolekül düzeneklerinden biridir ve tüm hücreler için vazgeçilmezdir. Hücrelerin dışında, hücreleri ve çevrelerini birbirine bağlayan plazma zarını oluşturur; Hücrelerin içinde, belirlenmiş işlevler için özelleşmiş çeşitli organelleri bölümlere ayırır. Durgundan ziyade dinamik olan lipid zarları, biyomateryal taşınımı, organel reformunu, morfoloji değişimini ve hücresel iletişimi aracılık eden sürekli olarak füzyon ve fisyon yaşar. Kuşkusuz, lipid zarı hemen hemen tüm hücresel süreçlerin fiziksel temelidir ve işlev bozukluğu, kanser1'den Alzheimer hastalığı2'ye kadar çeşitli bozukluklarda çok önemli bir rol oynar. Lipid molekülleri proteinlerden çok daha az çeşitli olmasına rağmen, şimdiye kadar yapılan zar araştırmaları esas olarak protein merkezli olmuştur. Örneğin, protein makineleri hakkında ekzositozdaki lipitlerden çok daha fazla şey bilinmektedir 3,4,5. Ayrıca, yüzey ve hücre içi zarlar boyunca lipitlerin organizasyonu, dağılımı, dinamikleri ve homeostazı, zar proteinlerine kıyasla büyük ölçüde keşfedilmemiş kalmaktadır6.
Mutajenez gibi modern moleküler biyoloji teknikleri, lipitlerden ziyade proteinleri incelemek için metodolojik bir avantaj sağladığından, bu şaşırtıcı değildir. Örneğin, pH'a duyarlı yeşil floresan proteinin (diğer adıyla pHluorin) veziküler proteinlere transgenik olarak etiketlenmesi, ekzo-/endositoz 7,8,9 sırasında veziküler protein devir miktarının ve hızının kantitatif ölçümünü kolaylaştırır. Bununla birlikte, membran lipidlerini in vivo olarak genetik olarak değiştirmek neredeyse imkansızdır. Ayrıca, protein miktarlarının ve dağılımlarının kalitatif ve hatta kantitatif manipülasyonları, lipitlerinkinden çok daha uygundur10. Bununla birlikte, doğal ve sentetik floresan lipidler, endojen membran lipidlerini in vitro ve in vivo11 simüle etmek için izole edilmiş ve geliştirilmiştir. Yaygın olarak kullanılan floresan lipitlerin bir grubu, membranla geliştirilmiş floresan sergileyen ve nöronlarda sinaptik vezikül (SV) salınımını incelemede güçlü bir araç olan FM1-43 gibi stiril boyalardır12. Son zamanlarda, çevreye duyarlı lipid boyalar icat edildi ve zar potansiyeli11, faz sırası13 ve sekresyon14 dahil olmak üzere çeşitli hücre zarı özelliklerini incelemek için yeni bir raportör sınıfı olarak yaygın olarak kullanıldı.
Floresansı hem pH'a duyarlı (örneğin, pHluorin) hem de membrana duyarlı (örneğin, FM1-43) olan yeni bir lipid mimetiği sınıfı, plazma zarındaki ve endozomlar/lizozomlardaki lipid dağılımını ve ekzo-/endositoz sırasındaki lipid trafiğini doğrudan ölçmek için geliştirilmiştir. Bu amaçla, molekül içi yük transferine bağlı itme-çekme özellikleri gösteren iyi bilinen solvatokromik floroforlar seçilmiştir. Mevcut solvatokromik floroforlar arasında, 1,8-naftalimid (ND) iskelesinin değiştirilmesi nispeten kolaydır, etiketleme için çok yönlüdür ve foto-fiziktebenzersizdir 15 ve bu nedenle DNA interkalatörlerinde, organik ışık yayan diyotlarda ve biyomolekül sensörlerindekullanılmıştır 16,17,18.
ND iskelesinin C4 konumuna elektron veren bir grubun bağlanması, elektron yoğunluğunuuyarılmış durumda 19,20 yeniden dağıtarak artan bir dipol momentine yol açan bir itme-çekme yapısı oluşturur. Böyle bir molekül içi yük transferi, büyük kuantum verimleri ve Stokes kaymaları üreterek parlak ve kararlı floresan21 ile sonuçlanır. Bu grup yakın zamanda ND iskelesine dayalı bir dizi solvatokromik lipid analoğu geliştirmiş ve bunları iyi sentetik verimlerleelde etmiştir 20.
Spektroskopik karakterizasyon, bu ürünler arasında ND6'nın en iyi floresan özelliklerine sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 1)20. İlk olarak, floresein izotiyosiyanat, rodamin veya GFP gibi popüler floroforlara kıyasla iyi ayrılmış uyarma ve emisyon tepe noktalarına (yani, Şekil 2A, B'de sırasıyla ~400 nm ve ~520 nm) sahiptir, bu da onu spektral olarak onlardan ayrılabilir hale getirir ve bu nedenle çok renkli görüntüleme için kullanışlıdır. İkincisi, ND6 floresansı, misellerin varlığında floresansında sekiz kattan fazla bir artış sergiler (Şekil 2C), bu da güçlü bir membran bağımlılığını düşündürür. Farklı hücre tipleri ile yapılan önceki canlı hücre floresan görüntüleme çalışmaları, ND620 ile mükemmel membran boyaması göstermiştir. Üçüncüsü, çözeltinin pH'ı 7.5'ten (genellikle hücre dışı veya sitozolik ortamlarda bulunur) 5.5'e (genellikle endozomlarda ve lizozomlarda bulunur) düşürüldüğünde, ND6 floresanda yaklaşık iki kat artış gösterir (Şekil 2D), pH duyarlılığını gösterir. Ayrıca, moleküler dinamik simülasyonu, ND6'nın, fosfolipid baş grupları ile güçlü etkileşimler gösteren membran ve piperazin kalıntısından dışarı bakan ND iskelesi ile lipid çift tabakasına kolayca entegre olduğunu göstermektedir (Şekil 3). Toplamda, bu özellikler ND6'yı ekzo-/endositoz sırasında membran lipid döngüsünü görselleştirmek ve ölçmek için ideal bir floresan lipid analoğu yapar.
Bu makale, kültürlenmiş fare hipokampal nöronlarını kullanarak SV lipidlerinin devir hızını ve dinamiklerini incelemek için bir yöntem sunmaktadır. Yüksek K+ Tyrode çözeltileri ile nöronları uyararak, SV'ler ve plazma membranı ND6 ile yüklendi (Şekil 4A,B). Daha sonra, nöronlar farklı uyaranlarla yeniden uyarıldı, ardından NH4Cl içeren ve pH 5.5 Tyrode çözeltileri izledi (Şekil 4D). Bu protokol, farklı koşullar altında birleştirilmiş ekzositoz ve endositoz oranlarının kantitatif ölçümünü kolaylaştırır (Şekil 4C).

<table><tbody><tr><td>Digidata 1440A Veri Edinme Sistemi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Digidata 1440A</td><td>Senkronize stimülasyon ve çözelti değişimi için</td></tr><tr><td>Çift Kanallı Sıcaklık Kontrol Cihazı</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td>Canlı hücre görüntüleme için</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>OMEGA Scientific</td><td>FB-01</td><td>Diseksiyon ve doku kültüründe kullanılan H+20 solüsyonu yapmak için</td></tr><tr><td>Hamamatsu Flash4.0 sCOMS kamera</td><td>Hamamatsu Inc.</td><td>C13440-20CU</td><td>yüksek hassasiyetli kamera</td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td>Diseksiyon ve doku kültüründe kullanılan H+20 solüsyonunu yapmak için</td></tr><tr><td>Isıtmalı Platform</td><td>Warner Instruments</td><td>PH-1</td><td>Canlı hücre görüntüleme için</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Doku kültürü için</td></tr><tr><td>Micro-G Titreşim İzolasyon Masası</td><td>TMC</td><td>63-564</td><td>Canlı hücre görüntüleme için</td></tr><tr><td>Mikro yönetici</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>NA</td><td>Görüntü elde etme kontrolü için</td></tr><tr><td>Çok Hatlı Hat İçi Çözüm Isıtıcı</td><td>Warner Instruments</td><td>SHM-6</td><td>Canlı hücre görüntüleme için</td></tr><tr><td>Neurobazal Plus Medium</td><td>THermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Doku kültürü için</td></tr><tr><td>Nikon Ti-E Ters Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti-E/B</td><td>Canlı hücre görüntüleme için</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 Dijital CMOS kamera</td> Canlı <td>hücre görüntüleme için</td><td>Hamamatsu</td><td>C1340-20CU</td></tr><tr>Canlı <td>hücre görüntüleme için</td><td>Perfüzyon Odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td></tr><tr><td>Altı Kanallı Valf Kontrol Perfüzyon Sistemi</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td>Çözelti değişimi için</td></tr><tr><td>Kare Nabız Stimülatörü</td><td>Çim Aleti</td><td>SD9</td><td>Elektrik alanı stimülasyonu için</td></tr></tbody></table>

ph'a duyarlı floresan lipid analog nd6 ile membran lipid devir hızının Ölçülmesi

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Ekzo-/endositoz, hücreler ve çevreleri arasında ve farklı hücreler arasında biyomolekül alışverişine aracılık eden yaygın bir süreçtir. Özel hücreler bu işlemi, β hücrelerden insülin salgılanması ve kimyasal sinapslardan nörotransmitter salınımı gibi hayati vücut fonksiyonlarını yerine getirmek için kullanır. Fizyolojik önemi nedeniyle, ekzo-/endositoz hücre biyolojisinde en çok çalışılan konulardan biri olmuştur. Bu süreci gen ve protein düzeyinde incelemek için birçok araç geliştirilmiştir, çünkü bu sürece katılan protein mekanizması hakkında çok şey bilinmektedir. Bununla birlikte, ekzo-/endositozun fiziksel temeli olan membran lipid döngüsünü ölçmek için çok az yöntem geliştirilmiştir.
Bu makale, pH'a bağlı floresan sergileyen yeni floresan lipid analoglarının bir sınıfını tanıtmakta ve plazma membranı ile salgı vezikülleri arasındaki lipid geri dönüşümünü izlemek için kullanımlarını göstermektedir. Basit pH manipülasyonları ile desteklenen bu analoglar, yüzey ve hücre içi zar bölmeleri boyunca lipid dağılımının ölçülmesine ve ayrıca ekzo-/endositoz sırasında lipid devir hızının ölçülmesine de izin verir. Bu yeni lipid muhabirleri, hücre biyolojisi ve sinirbilim gibi çeşitli biyolojik araştırma alanlarına büyük ilgi duyacaktır.

SV'ler, uyarılmış ekzo-/endositoz27 yoluyla nörotransmitter salınımı için uzmanlaşmıştır. SV'ler, ND6 için ideal olan yüksek asidik lümene (yani pH 5.5) sahiptir. ND6'nın SV'ye erişmesine izin vermek için SV ekzo-/endositozu uyandırmak için yüksek K+ stimülasyonu kullandık. Beklendiği gibi, yüklemeden sonra nöronal süreçler boyunca parlak yeşil floresan punkta ortaya çıktı (Şekil 9A). Şekil 4B'de gösterilen çizgi profili, ND6 (yeşil eğri) v...

Bu protokol, hücre ekzositozu ve endositoz döngüsü sırasında lipid membran trafiğini izlemek için pH'a duyarlı lipid florofor sınıfı kullanan bir floresan görüntüleme yöntemi sunar.

pH'a duyarlı Floresan Lipid Analog ND6 ile Membran Lipid Devir Hızının Ölçülmesi

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Bu protokol, araştırmacıların canlı hücrelerde ekzo ve endositozu izlemesine olanak tanıyan, hücre zarlarına özgü, pH'a duyarlı yeni bir floresan lipid probunun karakterizasyonunu ve uygulamasını açıklar. Membran proteini ile ilgili önceki raporların çoğu, dolaylı olan pH'a duyarlı yeşil floresan proteinine dayanmaktadır. Bir lipid taklitçisi olarak ND6, hücre zarına entegre olur ve böylece lipid zarı trafiğini aslına uygun olarak rapor eder.ND6 probu sadece biyolojik membran ortamına gömüldüğünde floresan olur. Bu probun floresan yoğunluğu, piperazin kafa grubunun protonasyonu ve protondan arındırılması ile ilişkilidir. Böylece, daha düşük pH'ta çok daha güçlü floresan verir.Ekzositoz ve endositoz, birçok sinyal molekülünün salgılanmasının ve alınmasının altında yatan her yerde bulunan süreçlerdir. Bu nedenle, ND6, hücre biyolojisi ve biyomedikal bilimlerdeki bazı temel soruları incelemek için kullanılabilir. Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan öğrenciler olan Haley, Oliver ve Jonathan olacak.Canlı hücre floresan görüntüleme için sıcaklık kontrolüne ve çözelti giriş çıkışına izin veren bir görüntüleme odası hazırlayarak başlayın. Perfüzyon solüsyonlarını değiştirmek ve görüntüleme sırasında tanımlanmış zaman noktalarında elektrik uyarıcısı vermek için programlanabilir bir cihaz kurun. Uygun miktarda ND6 tartın.Dimetil sülfoksit içinde çözün ve oda sıcaklığında çözünmesine izin verin. Sonra çözeltiyi kısaca sonikleştirin. Büyük boya agregalarını çıkarmak için 0,22 mikrometrelik bir filtre kullanarak ham stok çözeltisini filtreleyin.Konvansiyonel veya mikro hacimli bir spektrofotometre kullanarak, 405 nanometrede boya konsantrasyonunu belirleyin. Uygulamadan önce, banyo çözeltisini kullanarak stok çözeltisini mililitre başına bir miligram konsantrasyona seyreltin. Stok çözeltisini karanlıkta oda sıcaklığında tutun.Mikrolitre başına bir mikrogramlık son konsantrasyonda kültür ortamına ND6 stok çözeltisi ekleyin ve endozomlar gibi endositozlu membran bölmelerini her yerde etiketlemek için inkübe edin. Sinaptik vezikül etiketlemesinin kapsamını azaltmak için, spontan nöronal aktiviteyi farmakolojik olarak baskılayın. Sinaptik vezikülleri el yazmasında tarif edildiği gibi seçici olarak etiketledikten sonra, hücreleri içeren kapak fişini görüntüleme odasına monte edin.Sıcaklık sensörünü, perfüzyon girişini ve vakum ucunu görüntüleme odasına bağlayın. Perfüzyon hızını saniyede yaklaşık 0.2 mililitreye ayarlayın ve kültürdeki aşırı ND6'yı gidermek için NBQX ve DAP5 içeren önceden ısıtılmış normal tiroz çözeltisinin perfüzyonunu başlatın. Odağı ayarlayın ve bağlı nöritler taşıyan sağlıklı ve iyi yayılmış nöronları içeren uygun görüş alanını bulun.Çözülmemiş Dikolloidler içeren alanlardan kaçınmak. En iyi görüntüleme ayarlarını belirlemek için ND6 yüklü hücreleri farklı pozlama süreleriyle görüntülemeyi deneyin. Metin yazısındaki bilgileri kullanarak stimülasyon ve perfüzyon protokolünü, çerçeve aralığını ve toplam süreyi ayarlayın.Senkronize stimülasyon ve perfüzyon eşliğinde görüntü alımını başlatın. Görüntüleme sırasında stimülasyonu ve çözelti değişimini izleyin. Görüntüleme bittikten sonra perfüzyonu durdurun.Kapak fişini çıkarın ve bir sonraki deneme için görüntüleme odasını temizleyin. Tüm görüntü dosyalarını yedekleyin ve elektronik bir kopyasını alın. Veri ayıklama için analiz programını seçin ve açın.Bir görüntü yığınını açın veya analiz programına aktarın. İkili bir maske oluşturduktan sonra, hücre zarlarına, endozomlara, lizozomlara veya sinaptik butonlara karşılık gelen ilgilenilen bölgeleri veya ROI'leri istemek için uygun alan boyutu ve dairesellik ile parçacığı analiz etme işlevini kullanın. Görüş alanı içindeki hücresiz bölgelerde dört arka plan ROI'si seçin.Ardından seçilen tüm ROI'leri kaydedin. ND6 zaman atlamalı görüntü yığınlarındaki tüm kareleri hizalayın. İlk görüntüyü referans olarak ayarlayın ve geri kalanını katı kayıt kullanarak hizalayın, bu da XY kaymasından kaynaklanan artefaktları azaltacaktır.Ardından, hizalanmış görüntü yığınlarını kaydedin. Kaydedilen ROI'leri hizalanmış ND6 görüntü yığınlarına uygulayın. Görüntü yığınının her karesindeki her ROI için ND6 floresansının ortalama piksel yoğunluklarını ölçün.Ardından sonuçları istatistiksel analiz için dışa aktarın. Seçilen tüm ROI'lerden çıkarılacak olan temel gürültüyü elde etmek için arka plan ROI'lerinin ortalama yoğunluğunu hesaplayın. Normalizasyon için %100 olarak tanımlanan maksimum floresan yoğunluğunu elde etmek için pH 5.5 tiroz çözeltisinin uygulanması sırasında seçilen her ROI için en yüksek üç ortalama yoğunluğun ortalamasını alın.Normalizasyon için %0 olarak tanımlanan minimum floresan yoğunluğunu ayarlamak için 50 milimolar amonyum klorür uygulaması sırasında seçilen her ROI için en düşük üç ortalama yoğunluğun ortalamasını alın. Her ROI için kendi %0 ve %100 yoğunluklarına göre bağıl floresan değişikliklerini hesaplayın. Bireysel ROI verilerinden ortalama floresan değişikliklerini, değişiklik kinetiğini ve diğer değerleri veya grafikleri türetin.Nöronal süreçler boyunca parlak yeşil floresan punkta, nöronal hücrelere ND6 yüklendikten sonra görülebildi. ND6 ve FM464 floresan yoğunlukları arasında güçlü bir korelasyon da ND6 ile sinaptik vezikül boyamasını önerdi. Hem elektrik stimülasyonuna hem de yüksek potasyum stimülasyonuna yanıt olarak ND6 floresansında bir azalma gözlendi, bu da ND6'nın sinaptik vezikül zarında bulunduğunu ve salım sırasında sinaptik vezikül lümeninin nötralize olduğunu düşündürdü.Kapsamlı bir elektrik stimülasyonu altında, M beta CD tedavisi, ND görüntüleme ile ölçülen sinaptik vezikül salınımını ve alımını önemli ölçüde azalttı, bu da membran kolesterolün sinaptik vezikül ekzositozunu ve endositozu kolaylaştırdığını düşündürdü. Baf A1, alınan sinaptik veziküllerin yeniden asitlenmesini akut olarak bloke ederek stimülasyondan sonra ND6 floresan geri kazanımını önledi. Floresan mikroskobunun temel anlayışı bir zorunluluktur.Canlı hücre görüntülemeyi desteklemek için fizyolojik koşulların dikkatli bir şekilde planlanması çok önemlidir. ND stok çözeltisinin konsantrasyonunu kesin olarak belirlemek çok önemlidir. Mümkünse, her kullanımdan önce stok çözelti konsantrasyonunu yeniden ölçün.Fotoğraf ağartmasını ve prob ayrışmasını önlemek için lütfen doğrudan güneş ışığından uzak tutun.

measuring-membrane-lipid-turnover-with-ph-sensitive-fluorescent-lipid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz gramicidin kanal aktivitesinin bir ölçüsü olarak floresan su verme hızı monitörleri hızlı bir floresan bazlı analiz tanıtmak. Gramicidin kanalları, çift katlı kapsayan proteinler tarafından algılanan, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri izlemek için moleküler kuvvet dönüştürücüler olarak kullanılır.

Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

in vivo görüntüleme için floroforların kullanımı, opsonizasyon, hızlı klirens, düşük saptama hassasiyeti ve konakçı üzerindeki sitotoksik etkiler nedeniyle büyük ölçüde sınırlanabilir. Floroforların lipozomlardaki film hidrasyonu ve ekstrüzyon ile kapsüllenmesi, floresan söndürme ve korumaya yol açar, bu da yüksek algılama hassasiyeti ile in vivo görüntülemeyi mümkün kılar.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme İn Vivo Optik Görüntüleme

Bir damlacık tek tabakasını düz bir monotabaka üzerine birleştirerek sıvı-akışkan arayüzünde yüzey aktif bir türün yanal difüzyonunu ölçmek için yeni bir teknik sunuyoruz.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

Opsin ile sulandırılmış büyük unilameller lipozomlarda fosfolipid karıştırmayı ölçmek için floresan bazlı bir test tarif ediyoruz.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Bu protokol, küçük açılı nötron saçılma ölçümü sırasında birden fazla sıvı çözeltisini yerinde hızlı bir şekilde karıştırmak ve nanometre uzunluk ölçeklerinde ve ikinci zaman ölçeklerinde kinetik süreçleri incelemek için durdurulmuş akışlı bir numune ortamının kullanımını sunar.

Nano Ölçekli Malzemelerin Zaman-Evrimini Durdurulmuş Akış ve Küçük Açılı Nötron Saçılması ile Ölçme

Lipofaji, lipid damlacıklarının bozulmasını içeren seçici bir otofaji şeklidir. Bu süreçteki işlev bozuklukları kanser gelişimi ile ilişkilidir. Bununla birlikte, kesin mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, otofaji, lipid metabolizması ve kanser ilerlemesi arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için kantitatif görüntüleme yaklaşımlarını açıklar.

Lipofaji Yoluyla Lipid Damlacık Katabolizmasının Düzenlenmesinin Araştırılması

Plazma zarının lipitleri ile eksojen lipitler arasındaki değişime aracılık etmek için siklodekstrin kullanmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu teknik, lipid sal benzeri ortamlarda, sal benzeri olmayan ortamlarda olduğundan farklı davranan transmembran proteinleri inceleyen deneylerle eşleştirilebilir.

Canlı Hücrelerde Lipid Değişim Testi

Bu protokol, uzun zincirli ve çok uzun zincirli doymuş yağ asitlerinin BODIPY-C12 ve BODIPY-C16 floresan analogları ile stimülasyon üzerine endotel hücrelerinde hücresel lipid alımını ölçmek için bir in vitro testi detaylandırır. Bu yöntem verimlidir ve diğer hücre tiplerine uyarlanabilir ve lipid metabolizmasını incelemek için yararlı bir yaklaşım sunar.

Floresan Yağ Asidi Analogları Kullanılarak Endotelyal Yağ Asidi Alımının Miktar Tayini

Öğrenin canlı hücrelerde ND6 floresan lipid probu kullanarak ekzositoz ve endositoz dinamiklerini izleme yöntemini. Bu teknik sinir hücrelerinde membran lipid trafiğinin doğrudan ölçümünü sağlar.

pH'a duyarlı Floresan Lipid Analog ND6 ile Membran Lipid Devir Hızının Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet