pH'a duyarlı Floresan Lipid Analog ND6 ile Membran Lipid Devir Hızının Ölçülmesi
July 29th, 2021
Bu protokol, hücre ekzositozu ve endositoz döngüsü sırasında lipid membran trafiğini izlemek için pH'a duyarlı lipid florofor sınıfı kullanan bir floresan görüntüleme yöntemi sunar.
Bu protokol, araştırmacıların canlı hücrelerde ekzo ve endositozu izlemesine olanak tanıyan, hücre zarlarına özgü, pH'a duyarlı yeni bir floresan lipid probunun karakterizasyonunu ve uygulamasını açıklar. Membran proteini ile ilgili önceki raporların çoğu, dolaylı olan pH'a duyarlı yeşil floresan proteinine dayanmaktadır. Bir lipid taklitçisi olarak ND6, hücre zarına entegre olur ve böylece lipid zarı trafiğini aslına uygun olarak rapor eder.
ND6 probu sadece biyolojik membran ortamına gömüldüğünde floresan olur. Bu probun floresan yoğunluğu, piperazin kafa grubunun protonasyonu ve protondan arındırılması ile ilişkilidir. Böylece, daha düşük pH'ta çok daha güçlü floresan verir.
Ekzositoz ve endositoz, birçok sinyal molekülünün salgılanmasının ve alınmasının altında yatan her yerde bulunan süreçlerdir. Bu nedenle, ND6, hücre biyolojisi ve biyomedikal bilimlerdeki bazı temel soruları incelemek için kullanılabilir. Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan öğrenciler olan Haley, Oliver ve Jonathan olacak.
Canlı hücre floresan görüntüleme için sıcaklık kontrolüne ve çözelti giriş çıkışına izin veren bir görüntüleme odası hazırlayarak başlayın. Perfüzyon solüsyonlarını değiştirmek ve görüntüleme sırasında tanımlanmış zaman noktalarında elektrik uyarıcısı vermek için programlanabilir bir cihaz kurun. Uygun miktarda ND6 tartın.
Dimetil sülfoksit içinde çözün ve oda sıcaklığında çözünmesine izin verin. Sonra çözeltiyi kısaca sonikleştirin. Büyük boya agregalarını çıkarmak için 0,22 mikrometrelik bir filtre kullanarak ham stok çözeltisini filtreleyin.
Konvansiyonel veya mikro hacimli bir spektrofotometre kullanarak, 405 nanometrede boya konsantrasyonunu belirleyin. Uygulamadan önce, banyo çözeltisini kullanarak stok çözeltisini mililitre başına bir miligram konsantrasyona seyreltin. Stok çözeltisini karanlıkta oda sıcaklığında tutun.
Mikrolitre başına bir mikrogramlık son konsantrasyonda kültür ortamına ND6 stok çözeltisi ekleyin ve endozomlar gibi endositozlu membran bölmelerini her yerde etiketlemek için inkübe edin. Sinaptik vezikül etiketlemesinin kapsamını azaltmak için, spontan nöronal aktiviteyi farmakolojik olarak baskılayın. Sinaptik vezikülleri el yazmasında tarif edildiği gibi seçici olarak etiketledikten sonra, hücreleri içeren kapak fişini görüntüleme odasına monte edin.
Sıcaklık sensörünü, perfüzyon girişini ve vakum ucunu görüntüleme odasına bağlayın. Perfüzyon hızını saniyede yaklaşık 0.2 mililitreye ayarlayın ve kültürdeki aşırı ND6'yı gidermek için NBQX ve DAP5 içeren önceden ısıtılmış normal tiroz çözeltisinin perfüzyonunu başlatın. Odağı ayarlayın ve bağlı nöritler taşıyan sağlıklı ve iyi yayılmış nöronları içeren uygun görüş alanını bulun.
Çözülmemiş Dikolloidler içeren alanlardan kaçınmak. En iyi görüntüleme ayarlarını belirlemek için ND6 yüklü hücreleri farklı pozlama süreleriyle görüntülemeyi deneyin. Metin yazısındaki bilgileri kullanarak stimülasyon ve perfüzyon protokolünü, çerçeve aralığını ve toplam süreyi ayarlayın.
Senkronize stimülasyon ve perfüzyon eşliğinde görüntü alımını başlatın. Görüntüleme sırasında stimülasyonu ve çözelti değişimini izleyin. Görüntüleme bittikten sonra perfüzyonu durdurun.
Kapak fişini çıkarın ve bir sonraki deneme için görüntüleme odasını temizleyin. Tüm görüntü dosyalarını yedekleyin ve elektronik bir kopyasını alın. Veri ayıklama için analiz programını seçin ve açın.
Bir görüntü yığınını açın veya analiz programına aktarın. İkili bir maske oluşturduktan sonra, hücre zarlarına, endozomlara, lizozomlara veya sinaptik butonlara karşılık gelen ilgilenilen bölgeleri veya ROI'leri istemek için uygun alan boyutu ve dairesellik ile parçacığı analiz etme işlevini kullanın. Görüş alanı içindeki hücresiz bölgelerde dört arka plan ROI'si seçin.
Ardından seçilen tüm ROI'leri kaydedin. ND6 zaman atlamalı görüntü yığınlarındaki tüm kareleri hizalayın. İlk görüntüyü referans olarak ayarlayın ve geri kalanını katı kayıt kullanarak hizalayın, bu da XY kaymasından kaynaklanan artefaktları azaltacaktır.
Ardından, hizalanmış görüntü yığınlarını kaydedin. Kaydedilen ROI'leri hizalanmış ND6 görüntü yığınlarına uygulayın. Görüntü yığınının her karesindeki her ROI için ND6 floresansının ortalama piksel yoğunluklarını ölçün.
Ardından sonuçları istatistiksel analiz için dışa aktarın. Seçilen tüm ROI'lerden çıkarılacak olan temel gürültüyü elde etmek için arka plan ROI'lerinin ortalama yoğunluğunu hesaplayın. Normalizasyon için %100 olarak tanımlanan maksimum floresan yoğunluğunu elde etmek için pH 5.5 tiroz çözeltisinin uygulanması sırasında seçilen her ROI için en yüksek üç ortalama yoğunluğun ortalamasını alın.
Normalizasyon için %0 olarak tanımlanan minimum floresan yoğunluğunu ayarlamak için 50 milimolar amonyum klorür uygulaması sırasında seçilen her ROI için en düşük üç ortalama yoğunluğun ortalamasını alın. Her ROI için kendi %0 ve %100 yoğunluklarına göre bağıl floresan değişikliklerini hesaplayın. Bireysel ROI verilerinden ortalama floresan değişikliklerini, değişiklik kinetiğini ve diğer değerleri veya grafikleri türetin.
Nöronal süreçler boyunca parlak yeşil floresan punkta, nöronal hücrelere ND6 yüklendikten sonra görülebildi. ND6 ve FM464 floresan yoğunlukları arasında güçlü bir korelasyon da ND6 ile sinaptik vezikül boyamasını önerdi. Hem elektrik stimülasyonuna hem de yüksek potasyum stimülasyonuna yanıt olarak ND6 floresansında bir azalma gözlendi, bu da ND6'nın sinaptik vezikül zarında bulunduğunu ve salım sırasında sinaptik vezikül lümeninin nötralize olduğunu düşündürdü.
Kapsamlı bir elektrik stimülasyonu altında, M beta CD tedavisi, ND görüntüleme ile ölçülen sinaptik vezikül salınımını ve alımını önemli ölçüde azalttı, bu da membran kolesterolün sinaptik vezikül ekzositozunu ve endositozu kolaylaştırdığını düşündürdü. Baf A1, alınan sinaptik veziküllerin yeniden asitlenmesini akut olarak bloke ederek stimülasyondan sonra ND6 floresan geri kazanımını önledi. Floresan mikroskobunun temel anlayışı bir zorunluluktur.
Canlı hücre görüntülemeyi desteklemek için fizyolojik koşulların dikkatli bir şekilde planlanması çok önemlidir. ND stok çözeltisinin konsantrasyonunu kesin olarak belirlemek çok önemlidir. Mümkünse, her kullanımdan önce stok çözelti konsantrasyonunu yeniden ölçün.
Fotoğraf ağartmasını ve prob ayrışmasını önlemek için lütfen doğrudan güneş ışığından uzak tutun.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, hücre ekzositozu ve endositozu sırasında lipid zar trafiğini izlemek için pH'a duyarlı lipid probları kullanan bir floresan görüntüleme yöntemi açıklamaktadır. ND6 lipid taklidi, hücre zarına entegre olarak, canlı hücrelerde bu dinamik süreçler hakkında gerçek zamanlı bilgiler sağlamaktadır.
Ana Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Floresan Mikroskopi
- Hücre Biyolojisi
- Sinirbilim
Arka Plan
- ND6 probu pH'a duyarlıdır ve özellikle hücre zarları için tasarlanmıştır.
- Yeşil floresan proteinler kullanan önceki yöntemler dolaylıdır, ND6 doğrudan ölçüm sağlar.
- Floresan yoğunluğu, baş grubunun protonasyonu ve deprotonasyonu ile ilişkilidir.
- Ekzositoz ve endositozu araştırmak, hücresel sinyallemayı anlamak için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Canlı hücrelerde lipid zar dinamiklerini doğrudan gözlemlemek için bir yöntem geliştirmek.
- Hücre biyolojisinin temel süreçlerinin incelenmesini kolaylaştırmak.
- Nöral aktivite sırasında vezikül trafiği ve zar etkileşimi mekanizmaları hakkında bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışma, kültürlenmiş nöronal hücrelerde floresan değişikliklerini izlemek için canlı hücre görüntülemeyi kullanmaktadır.
- Anahtar prosedürler arasında bir görüntüleme odasının hazırlanması, ND6'nın solüsyon haline getirilmesi ve kontrollü perfüzyon bulunmaktadır.
- Görüntü alımı, elektriksel stimülasyon ve perfüzyon protokolleri ile senkronize edilmiştir.
- İstatistiksel analiz, göreceli floresan değişimlerinin hesaplanmasını ve ilgi bölgeleri için ikili maskelerin oluşturulmasını içermektedir.
Ana Sonuçlar
- ND6 puanlarından gelen parlak floresans, başarılı sinaptik vezikül etiketlemesini gösterir.
- ND6 floresansındaki değişiklikler, stimülasyon sırasında sinaptik vezikül dinamiği ile ilişkilidir.
- Deneyler, kolesterol ve sinaptik vezikül trafiği arasındaki etkileşimleri ortaya çıkarmıştır.
- Baf A1 tedavisi, ND6 floresansının iyileşmesini etkileyerek, vezikül yeniden asidiklenmesinde pH'ın rolünü vurgulamıştır.
Sonuçlar
- Bu protokol, canlı nöronlarda lipid zar trafiğinin ayrıntılı araştırmalarına olanak tanımaktadır.
- Bu yöntemden elde edilen bilgiler, ekzositoz ve endositozun temel mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
- Bulgular, hücresel sinyalleşme ve sinir biyolojisi için önemli etkilere sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Measuring membrane lipid turnover provides direct insight into the physical basis of exo-/endocytosis, a process central to cellular signaling and vesicle trafficking. The pH-sensitive fluorescent lipid analog ND6 enables real-time, quantitative tracking of lipid recycling between plasma membrane and intracellular compartments, supporting mechanistic de-risking in target validation and assay development. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by linking lipid dynamics to functional outcomes in secretion and uptake pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid membrane trafficking as a therapeutic hypothesis in secretion-related pathways.
- Operational Value: Provides direct readout of lipid turnover, reducing reliance on indirect protein-based reporters.
- Predictive Value: Supports functional target validation by correlating lipid dynamics with vesicle release and retrieval.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts proportional to lipid membrane dynamics during stimulation.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible measurement of exo-/endocytosis kinetics in live cells.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for compound screening and pathway modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects lipid turnover measurements to disease-relevant systems such as neuronal secretion and insulin release.
- Mechanistic De-risking: Clarifies role of membrane cholesterol and pH in vesicle trafficking, informing target safety and efficacy.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking lipid dynamics to functional secretory outputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical validation by providing direct, quantitative readouts of lipid membrane dynamics that inform mechanistic understanding and functional screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lipid-mediated mechanisms in exocytosis and endocytosis pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs for evaluating compound effects on lipid turnover.
- Analytics: Enables derivation of mean fluorescence changes, kinetics, and normalization metrics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects lipid dynamics to secretory function in neuronal and endocrine cells, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for monitoring lipid membrane trafficking across cell types and stimulation paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides direct, quantitative measurement of lipid membrane turnover, reducing mechanistic ambiguity in secretion pathways.
- Operational Value: Enables standardization and reproducibility of lipid trafficking assays through pH-based normalization and ROI analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking lipid dynamics to functional vesicle release and retrieval.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in membrane trafficking and secretory processes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, live cell imaging, and pH-sensitive probe handling.
- Needs instrumentation for controlled perfusion, temperature regulation, and synchronized stimulation during imaging.
- Demands cross-team standardization of probe concentration, dilution, and imaging settings for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different cell types, membrane compositions, and stimulation protocols.
- Includes practical limitations such as photobleaching risk, need for dark storage, and optimization of exposure times and pH solutions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:13
Microscope Setup, Loading and Imaging ND6 in Neuronal Cultures
4:17
Quantification of Membrane Trafficking by a Change in ND6 Fluorescence
6:44
Results: Membrane Lipid Turnover with the pH‐Sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6
8:00
Conclusion
