Name: Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Öğrenin, mezenkimal kök hücrelerin makrofaj fagositozunu pH duyarlı floresan parçacıklarla nasıl düzenlediğini. Bu yöntem, doğuşal bağışıklıktaki hücre etkileşimlerini yüksek verimli analizlerle aydınlatır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NSF Büyük Araştırma Aracı mekanizması tarafından hibe sayıları 1626093 ve 1919583 altında desteklendi.

<ol><li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Mesenchymal+stem%2Fmultipotent+stromal+cells%3A+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li>
<li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+sensors+and+switchers+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li>
<li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4%28%2B%29+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li>
<li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988(2011).</li>
<li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li>
<li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65(2013).</li>
<li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+paradigm%3A+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088(2010).</li>
<li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E%282%29-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li>
<li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252(2010).</li>
<li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive%2Fanti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li>
<li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages%3A+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li>
<li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56(2015).</li>
<li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1%2FM2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).</li>
<li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257(2017).</li>
<li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li>
<li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).</li>
<li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c%2FEBP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li>
<li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li>
<li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li>
<li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye%2C+pHrodo-SE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

PH'a duyarlı bir boyaya konjuge edilen biyopartiküller kullanılarak fagositozun analizi, geleneksel floresan etiketli parçacıklara göre avantajlı olduğu kanıtlanmış nispeten yeni bir araçtır12,19,20. Geleneksel floresan etiketli parçacıklarda, sadece uç nokta analizi mümkündür. Tespit, fagosit tarafından alınmamış parçacıkları yıkadıktan veya söndürtükten sonra floresan mikroskopi ve/veya spektroflorometri ile gerçekleştirilir. ...

Mezenkimal kök hücreler (MSC) bağ dokusu hücrelerine yol açan progenitör hücrelerdir. MSC yetişkin memeli dokularında bulunur ve kemik iliği1'denizole edilebilir. İmmünomodülatör özellikleri nedeniyle, bu hücreler yaygın olarak incelenir2. T hücrelerinin MSC regülasyonuna odaklanan ilk çalışmalar3,4,5,6, ancak daha yakın zamanda, doğuştan gelen bağışıklığın önemli bir hücresel bileşeni olan makrofaj hücrelerinin (MΦ) düzenlenmesi, 7 , 8 , 9,10,11,12,13,14'ün dikkatini çekmiştir. . Msc-MΦ etkileşiminin enflamatuar hastalığın tedavisindeki önemi, monositlerin / makrofajların tükenmesinin MSC'nin hayvan modellerinde terapötik etkilerini kırdığı gerçeği ile altı çizilmiştir8. Burada, odak noktası MSC'nin MΦ ile hücre teması etkileşimidir. MSC, enflamatuar yanıtlardan antienflamatuar yanıtlara geçişi teşvik ederek MΦ'nin fenotipini düzenleme kapasitesine sahiptir ve doku onarım faaliyetlerine yol açarak 8,9,10,11ve bu düzenleyici mekanizmaları göstermek için çok şey yapılmıştır. Diğer durumlarda, MSC MΦ güdümlü enflamatuar yanıt12,13'ü destekleyebilir veya şiddetlendirebilir ve MΦ fagositik aktivitesiniartırabilir 14,15. Bununla birlikte, MSC'nin MΦ fagositik etkinliğini düzenlediği mekanizmaları ve koşulları tanımlayan kritik bir mevcut veri eksikliği vardır.
MΦ, fenositoza yol açan opsonize (antikor veya tamamlayıcı kaplamalı) veya opsonize olmayan patojenleri tanıyan reseptör ailelerine sahiptir16. İkincisinin aktivasyonu ve aktivitesi daha az iyi çalışılmıştır17. İnflamatuar olmayan bir in vitro ortamda, MSC opsonize olmayan patojenlerin MΦ fagositozunu geliştirir13. Bununla birlikte, uyarlanabilir bir immün yanıt sırasında lenfositler tarafından üretilen enflamatuar bir ortama maruz kaldıktan sonra opsonize olmayan patojenlerin MΦ tarafından tanınması azaltılabilir. Doğal öldürücü hücreler ve efektör lenfositler tarafından salınan IFN-γ, opsonize olmayan parçacıkların MΦ fagositozu üzerinde inhibitör bir etkiye sahiptir18. MSC'nin MΦ fagositozunun doğrudan temas regülasyonunun mekanizmalarını incelemek için bir ortak kültür modeli geliştirilmiştir. Burada sunulan deneyin amacı, MSC'nin MΦ'nin IFN-γ maruz kaldıktan sonra opsonize olmayan patojenlerin MΦ fagositozunu düzenleyip düzenlemediğini belirlemektir (Şekil 1).

<table><tbody><tr><td>96 Kuyulu Siyah Polistiren Mikroplaka</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>%0.4 tripan mavisi çözeltisi</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ve 50 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj Tüpleri</td><td>ThermoFisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>4 Kuyulu Odacıklı Kapak Camı, çıkarılabilir olmayan kuyular</td><td>ThermoFisher</td><td>155382PK</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik (100X)&nbsp; Gibco</td><td>ThermoFisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Axiobserver 7 Görüntüleme Sistemi</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8806-1G</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kaldırıcı</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3008-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Kültür şişeleri, doku kültürü ile muamele edilmiş, yüzey alanı 75&nbsp; cm2, eğimli boyun, kapaklı, filtreli</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7231-120EA</td><td></td></tr><tr><td>D1 ORL UVA [D1]</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>Fare MSC Hücre Hattı</td></tr><tr><td>DMEM, Yüksek Glikozlu</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısıyla inaktive</td> edilmiş <td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>FisherScientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>I-11.15</td><td>ATCC</td><td>CRL-2470</td><td>Fare M&Phi; Hücre Hattı</td></tr><tr><td>LADMAC Hücre Hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td>LADMAC hücreleri, büyüme faktörü koloni uyarıcı faktör 1'i (BOS-1) salgılar.</td></tr><tr><td>Canlı Hücre Görüntüleme çözümü</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green Zymosan Biyopartiküller Konjuge</td><td>ThermoFisher</td><td>P35365</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin IFN-&gama;</td><td>Preprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax i3X</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril Tek Kullanımlık Vakum Filtre Üniteleri, 250 mL, 0.2 & m</td><td>ThermoFisher</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Steril şırınga filtreleri, 0,2 mikrometre</td><td>ThermoFisher</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kapları, 100 mm x 20 mm</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430167-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızısı</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

makrofaj fagositozun mezenkimal kök hücre regülasyonu; nicellik ve görüntüleme

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mezenkimal kök hücreler (MSC) geleneksel olarak rejeneratif özellikleri için çalışılmıştır, ancak daha yakın zamanda immünoregülatör özellikleri ön plandadır. Bağışıklık hücresi aktivitesi ile etkileşime girerler ve düzenlerler. Bu çalışmanın odak noktası makrofaj fagositik aktivitesinin MSC düzenlemesidir. Makrofaj (MΦ) fagositozu, enfeksiyona doğuştan gelen bağışıklık sistemi yanıtının önemli bir parçasıdır ve MSC'nin bu yanıtı modüle ettiği mekanizmalar aktif olarak incelenmektedir. Burada sunulan, MSC ile ortak kültürdeyken pH'a duyarlı bir floresan molekülüne konjuge edilen opsonize olmayan zymosan parçacıklarının MΦ fagositozunu incelemek için bir yöntemdir. Fagositik aktivite arttıkça ve etiketli zymosan parçacıkları fagolyozomların asidik ortamına dahil edildikçe, pH'a duyarlı molekülün floresan yoğunluğu artar. Uygun ekscitasyon ve emisyon dalga boyları ile fagositik aktivite floresan spektrofotometre kullanılarak ölçülür ve kinetik veriler 70 dakikalık bir süre içinde göreceli floresan ünitelerde değişiklik olarak sunulur. Bu nicel verileri desteklemek için, fagositik aktivitedeki değişiklik dinamik görüntüleme kullanılarak görselleştirilir. Bu yöntemi kullanan sonuçlar, ortak kültürde MSC'nin hem naif hem de IFN-γ tedavi edilen MΦ'nin opsonize edilmemiş zymosan'ının MΦ fagositozunu artırdığını göstermektedir. Bu veriler, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin MSC düzenlemesi hakkındaki mevcut bilgi birikimine katkıda bulunur. Bu yöntem, alttaki hücresel ve moleküler mekanizmaları tam olarak tanımlamak için gelecekteki araştırmalarda uygulanabilir.

Her grup için ortalama ± SEM her zaman noktasında hesaplandıktan sonra, veriler Y ekseni ile Göreli Floresan Yoğunluğu ve X ekseni Zaman olarak çizgi grafik biçiminde sunulur. Tamamlayıcı Dosya 1, 96 kuyu plakasının elektronik tablo biçimindeki kinetik okumasından ham veri örneği sağlar.
Bu çalışmada, Şekil 3Ave Tablo 3'te sunulan en uygun sonuçlar, 1) MSC ile ortak kültürün makrofajın fagositik aktivitesini artırdığını, 2) IFN-y ...

Burada sunulan, pH'a duyarlı bir floresan moleküle konjuge edilen opsonize olmayan maya (zymosan) parçacıklarının makrofaj (MΦ) fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) aracılı regülasyonunun dinamik görüntülerini ölçmek ve üretmek için bir protokol sunulmaktadır.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Bu ortak kültür yöntemi, makrofaj fagositozun mezenkimal kök hücre düzenlemesinin arkasındaki hücre temas mekanizmalarını çevreleyen önemli soruların cevaplandırılmasına yardımcı olacak ve bu nedenle MSC'nin doğuştan gelen bağışıklığı düzenlemedeki rolünü aydınlatacaktır. Bu teknik yüksek verimli analizlerde uygulanabilir. Biyopartiküller sadece asidik fagolyozom ortamlarında pH'a duyarlı boyalar floresanlarına konjuge edildi.Bu nedenle, yıkama ve söndürme gereklidir. Bu yöntem nötrofiller ve diğer fagositleri içeren çeşitli ortak kültür modellerine de uygulanabilir. Prosedürü gösteren ethan Chetkof olacak, şu anda laboratuvarımda bir lisans öğrencisi.Başlangıç olarak, kültürlü mezenkimal kök hücrelerin birleştiği yer. % 70-80 izdiah elde edildiğinde, 100 milimetrelik bir tabakta kültürlü hücrelerden büyüme ortamını epire edin ve beş mililitre PBS ekleyin. PBS'yi aspire ettikten sonra, iki mililitre % 0.05 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri üç dakika kuluçkaya bırakın.Üç dakika sonra, ters bir mikroskop kullanarak hücre müfrezesini kontrol edin. Ve hücreler ayrılmazsa, tekrar bir ila iki dakika kuluçkaya yatırın. Tüm hücreler ayrıldıktan sonra, plakaya beş mililitre taze büyüme ortamı ekleyin.Trypsin orta karışımını kullanarak plakayı durulamadan sonra, hücreleri temiz, steril 50 mililitre konik bir tüpe toplamak için steril bir serolojik pipet kullanın. Daha sonra, hücreleri santrifüjleme ile aşağı doğru pelet. Süpernatantı aspire ettikten sonra, hücre peletini hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile 10 mililitre taze büyüme ortamında yeniden canlandırın.Hücre sayımı için, %0,4 Trypan Blue çözeltisinin 30 mikrolitresini içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin, ardından hemositometre sayım odasının kapaklarının altına 10 mikrolitre karışım ekleyin. Ters veya Brightfield mikroskobu altında, 10X objektif lens ve dört bir milimetrelik odacık kullanarak ulaşılamayan uygulanabilir hücreleri sayın ve hücre numarasını metin el yazmasında açıklandığı gibi hesaplayın. Hücre süspansiyonunun mililitre başına beşinci hücrelere bir kez 10'luk son konsantrasyonda hazırlanması için gereken taze orta ve hücre süspansiyonunun istenen hacmini belirlemek için C1V1 eşittir C2V2 denklemini kullanın.Plaka tasarımına göre 96 kuyulu bir plakanın kuyularına hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini eklemek için çok kanallı bir mikropipetter kullanın. Plaka tasarımına göre oda kaydırağının her birine 530 mikrolitre hücre süspansiyonu eklemek ve bir gecede kuluçkaya yatmak için bir mikropipette kullanın. Makrofaj hücrelerini bir 100 milimetrelik tabakta etkinleştirmek için mililitre başına 250 nanogram konsantrasyonda interferon gama içeren 10 mililitre aktivasyon ortamı hazırlayın.Büyüme ortamını makrofaj hücre kültürlerinden ayırın ve hücreleri interferon gamasından yoksun aktivasyon ortamının beş mililitresi ile durulayın. Deneysel çanaktaki durulama ortamını epire ettikten sonra interferon gama ile desteklenmiş 10 mililitre aktivasyon ortamı ekleyin. Ve kontrol kabına interferon gaması olmadan 10 mililitre aktivasyon ortamı ekleyin, ardından hücreleri 16 ila 24 saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkanın sonunda, ortak kültürleri hazırlamak için, aktivasyon ortamını makrofaj hücrelerinden çıkarın ve beş mililitre taze büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri hafifçe kazımak ve hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe toplamak için bir hücre kaldırıcı kullanın. Daha sonra, Trypan Blue dışlama ve hemositometri kullanarak hücreleri sayın, ardından kontrol hazırlığı ve tedavi makrofaj hücresi süspansiyonları mililitre başına iki kez 10 ila beşinci hücreler konsantrasyonda mezenkimal kök hücreler için daha önce gösterildiği gibi.Mezenkimal kök hücreler içeren deneysel kuyulardan ortamı hafifçe aspire edin. Tedavi edilen 100 mikrolitreyi eklemek ve plaka tasarımına göre uygun deneysel kuyularda makrofaj hücresi süspansiyonlarını kontrol etmek için çok kanallı bir mikropipette kullanın ve gösterildiği gibi bir gecede kuluçkaya yatırın. Mezenkimal kök hücreler içeren dört duvarlı oda kaydıraktan ortamı hafifçe aspire edin.Tasarıma göre uygun kuyulara 530 mikrolitre makrofaj hücresi süspansiyonu eklemek ve bir gecede kuluçkaya yatmak için bir mikropipette kullanın. Bir miligram Zymosan parçacığı içeren şişeye bir mililitre canlı hücre görüntüleme ortamı ekleyin ve orta parçacık karışımını bir cam kültür tüpüne toplayın. Şişeyi ek bir mililitre görüntüleme çözeltisi ile duruladıktan sonra, durulanmış görüntüleme ortamını cam tüpe aktarın, ardından mililitre Zymosan parçacık süspansiyonu başına 0,2 miligram elde etmek için üç mililitre ek görüntüleme çözeltisi ekleyin.Vortex the Zymosan süspansiyonu 30 ila 60 saniye boyunca hızlı darbeler kullanarak, ardından süspansiyonu 60 hızlı darbe ile sonicate etmek için bir prob sonicator kullanın. Ortamı aspire ettikten sonra, deneysel kuyuları ve reaktif boş kuyuları 100 mikrolitre canlı hücre görüntüleme çözeltisi ile durulayın. Daha sonra, canlı hücre görüntüleme solüsyonını kuyulardan epire edin ve Zymosan süspansiyonunun 100 mikrolitresini ekleyin.Dokunmatik yüzey arayüzünü kullanarak floresan okuyucunun plaka tepsisini açın. Tabağı sol üst köşede A1 kuyusu ile tepside kapaksız olarak ayarlayın. Dokunmatik yüzeyi kullanarak tepsiyi kapatın ve üst menüdeki yeşil okuma düğmesine tıklayın.Fagositoz testini yapmak için, görüntüleme ortamının 750 mikrolitresi ile ilk deneysel kuyuyu durulamadan sonra, kalan kuyuları büyüme ortamında bırakarak Zymosan süspansiyonunun 400 mikrolitresini ekleyin. Ardından, slaydı görüntüleme sisteminin inkübe edilmiş aşamasına yerleştirin. Görüntüleme yazılımını kullanın.Bul sekmesinin altındaki Brightfield seçeneğini belirleyin ve göz merceği simgesine tıklayın. 10X hedefiyle, hücrelere odaklanmak için göz merceği ve odaklama düğmesini kullanın. Edinme sekmesini seçin.Deneme açılır menüsünü açın ve pH'a duyarlı boyanın 509 nanometresini ekscitasyon ve 533 nanometre emisyon dalga boylarını barındıracak EGFP filtre setini içeren bir dalga boyları kümesi seçin. Zamanlayıcıda yaklaşık iki dakika kaldığında, hedefi 20X olarak değiştirmek için nesnel menüdeki 20X simgesine tıklayın, ardından kanallar menüsüne tıklayın, EGFP filtrelerini seçin ve pozlama menüsünde pH'a duyarlı yeşil floroforu tespit etmek için pozlama süresini 400 milisaniye olarak ayarlayın ve ardından canlı yayına tıklayın. Odağı ayarladıktan sonra, ışığı kapatmak için dur'a tıklayın ve üst zaman atlamalı deneysel ayarın yanındaki kutuyu işaretleyin.Odaklama stratejisi menüsünde, yazılım otomatik odaklama'yı seçin ve açılır menüden, otomatik odaklama çalışırken ışığa maruz kalma süresini azaltmak için akıllı ve çekirdek ayarları seçin. Zaman atlamalı menüde, istenen alım sayısını 30 ila 60, aralık süresini bir dakika olarak ayarlayın ve ardından edinmeye başlamak için denemeyi başlat düğmesine tıklayın. Interferon gamanın ortak kültür üzerindeki etkisi incelenmiştir.Temsili sonuçlar, makrofajların mezenkimal kök hücrelerle ortak kültürünün makrofajın fagositik aktivitesini artırdığını göstermektedir. Interferon gama tedavisi makrofajın aktivitesini azaltır. Ancak mezenkimal kök hücrelerin varlığında makrofaj fagositik aktivitesi kısmen kurtarıldı.Bu çalışmalarda optimal hücre yoğunlukları kritik öneme sahiptir. Makrofaj hücreleri çok düşük yoğunlukta kaplandığında floresan yoğunluğunda değişiklikler tespit edildi. Makrofaj hücreleri yüksek yoğunlukta kaplandığında, floresan yoğunluğu tüm gruplarda hızla yükselmiş ve farklılıklar farkedilmemektedir.Bu işlem sırasında en önemli şeylerden biri, hücre yoğunluklarının optimize edilmesini ve deneyler arasında tutarlı tutulmasını sağlamaktır.

mesenchymal-stem-cell-regulation-macrophage-phagocytosis-quantitation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Makrofajlar sıçan karaciğer hücrelerinin primer kültür elde etmek için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, plastik tabaklar, seçici eklenti kültür matara ve arıtma sallayarak kültürün yayılması, makrofajlar kullanır. Bu teknik, karmaşık ekipman ve becerileri verimli olmadan karaciğer makrofajlar sağlar.

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Bu video, bir ko-kültürde makrofaj fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) regülasyonunu incelemek için yapılan bir testi göstermektedir. MSC'nin makrofajlarla birlikte kültürlenmesi üzerine, pH'a duyarlı bir florofora konjuge edilmiş opsonize olmayan zimozan partikülleri, makrofajlar tarafından fagosite edilmek üzere eklenir. Fagositozdaki artışla birlikte, floresan yoğunluğu artar ve fagositik aktivitenin MSC aracılı regülasyonunun belirlenmesine izin verir.

Mezenkimal Kök Hücreler ile Makrofaj Fagositozunun Düzenlenmesini İncelemek İçin Bir Test

Bu makale, kolayca kolay uyarlanabilir...

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

Biz birincil fare kemik iliği türevi makrofajlar fluorescently etiketli miyelin enkaz ve hücre içi lipid damlacık boyama kullanarak fagositik kapasitesini değerlendirmek için yöntemler mevcut.

Vitro Fagositoz miyelin enkaz kemik iliği türevi makrofajlar tarafından

Burada fare modellerinde kan monositlerinin kemotaktik aktivitesini ölçmek, beslenme, farmakolojik ve genetik müdahalelerin kan monositi üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve kan monositlerinden elde edilen makrofajları karakterize etmek için bir protokol sıyoruz. monosit-kemoattractant protein-1 (MCP-1) yüklü bazal membran kaynaklı jel fişleri kullanarak fare modelleri.

İn Vivo Monosit Kemotaktik Aktivitenin Ölçülmesi ve Kan Monosit Türevi Makrofajların Karakterizasyonu

Bu çalışmada kanser hücrelerine karşı makrofaj fagositik aktivite, özellikle 4T1 fare meme karsinom hücreleri görüntülendi. Canlı hücre kokültür modeli floresan ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kombinasyonu kullanılarak oluşturulmuş ve gözlenmiştir. Bu değerlendirme, çok noktalı hızlandırılmış video geliştirmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak görüntülendi.

Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden makrofajların sağlam nesil açıklar, ve sonraki karakterizasyonu için yöntemler. Hücre yüzeyi belirteç ekspresyonu, gen ekspresyonu ve fonksiyonel tahliller bu iPSC kaynaklı makrofajların fenotip ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır.

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Makrofajlarının Üretimi ve Karakterizasyonu

Bu protokol, monositler, mikroglia, makrofajlar ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere belirli oküler mononükleer fagositik popülasyonları tanımlamak için çok parametreli akış sitometrik analizi amacıyla tüm gözleri tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için bir yöntem sağlar.

Mononükleer Fagositlerin Çok Parametreli Akış Sitometrik Analizi için Tüm Fare Gözlerinin Sindirimi

Nörodejeneratif hastalıklar düzensiz mikroglia fonksiyonları ile ilişkilidir. Bu makalede, iPSC-makrofajlar tarafından nöroblastom hücrelerinin fagositozunun in vitro bir tahlili özetlenen bir makale verilmiştir. Nicel mikroskopi okumaları hem canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme hem de sabit hücreli yüksek içerikli görüntüleme için açıklanmıştır.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Öğrenin, mezenkimal kök hücrelerin makrofaj fagositozunu pH duyarlı floresan parçacıklarla nasıl düzenlediğini. Bu yöntem, doğuşal bağışıklıktaki hücre etkileşimlerini yüksek verimli analizlerle aydınlatır.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Daha fazla video keşfet