Name: Methanojenik Saf Kültürlerden ve Çevre örneklerinden Poliglutamat Kuyruk Uzunluğunun Analizi için Cofactor F420 Ekstraksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Öğrenin, metanojenik saf kültürlerden ve çevre örneklerinden kofaktör F420 ekstraksiyonu ve poliglutamat kuyruk uzunluğu analizi için optimize edilmiş bir yöntem. Bu teknik, prokaryotik metabolizmadaki rolünü anlamak için hayati önem taşır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Arınmış kofaktör F420'ye destek için Prof. Colin Jackson'a minnettarız. Bu araştırma Tirol bilim fonu (TWF) ve Universität Innsbruck (Publikationsfonds) tarafından desteklenmiştir. GPS, HK, SB, GG ve HB'nin desteğini büyük ölçüde kabul ediyoruz.

NOT: Kofaktör F420'nin ekstraksiyonu ve analizi, numune lizisi, katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile kofaktör ön saflaştırma ve floresan algılamalı iyon eşleştirilmiş-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) ile kofaktör algılama dahil olmak üzere üç adımlı bir süreçtir. Başlamadan önce, malzemeleri ve reaktifleri Tablo 1'de belirtildiği gibi hazırlayın.
1. Örnek liziz
<ol><li>Uygun tüplere (örneğin, 50 mL konik tüpler) 5 g'a kadar numune ekleyin.</li>
	<li>Numunelere 5 mL lizis tamponu (2x stok çözeltisi, Tablo 1) ekleyin.</li>
	<li>0,5 g·mL-1'lik son konsantrasyona ulaşmak için damıtılmış su ile 10 mL'lik son hacme getirin.</li>
	<li>20 s için seyreltilmiş örnekleri girdap.</li>
	<li>121 °C'de 30 dakika otoklav.</li>
	<li>Orman toprağı gibi kuru numuneler için, seyreltilmiş numuneyi otoklavladıktan ve girdapladıktan sonra damıtılmış su ile 20 mL'lik son hacme getirin. DİkKAT: Otomatik kapanma sırasında sıcaklık artışı tüplerin patlamasına neden olabilir.</li>
</ol>2. Katı fazlı ekstraksiyon (SPE) ile kofaktör F 420'nin ön saflaştırılması
NOT: SPE'nin tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilir
<ol><li>Numuneleri oda sıcaklığına kadar soğutun.</li>
	<li>Otomatik kapatılmış numuneleri 11.000 x g'da 5 dakika santrifüj edin.</li>
	<li>100 mg zayıf anion karışık mod polimerik sorbent ile dolu 5 mL SPE sütunları hazırlayın.</li>
	<li>Anion eşanjörü 3 mL metanol ile koşullandırılmıştır (durum çözeltisi, Tablo 1).</li>
	<li>Anion eşanjörü 3 mL damıtılmış su ile dengelenin (denge çözeltisi, Tablo 1).</li>
	<li>Santrifüjlü lisattan SPE sütununa 9,0 mL'ye kadar süpernatant yükleyin.</li>
	<li>Safsızlıkları 5 mL 25 mM amonyum asetatla yıkayın (SPE yıkama çözeltisi 1, Tablo 1).</li>
	<li>Safsızlıkları 5 mL metanol ile yıkayın (SPE yıkama çözeltisi 2, Tablo 1).</li>
	<li>F420 kofaktörini 1,0 mL elution tamponunda (Tablo 1) elüte edin. NOT: Taze elution tamponu hazırlayın. Uygulanan vakum ve elution tamponunun yüksek buhar basıncı nedeniyle, elüsyon hacimleri numuneden numuneye farklılık gösterebilir. Tüm numunelerde aynı son hacmin sabitlenebilmesi için, toplama kaplarının elution öncesi ve sonrası tartılması ve etkili elüasyon hacminin hesaplanması önerilir. Elution tamponu eklenerek farklılıkları dengeleyin.</li>
</ol>3. Cofactor F420'nin tespiti
<ol><li>Fırını 40 °C'ye ve floresan dedektörünü 420 nm yok olma dalga boylarına ve 470 nm emisyon dalga boylarına ayarlayın. A ve B mobil aşamalarını kullanarak degrade modu ile ayırmayı elde edin (Tablo 1): 0-3 dk: % 26 B; 3-24 dk: %26-%50 B; 24-25 dk: %50 B; 25-27 dk: %50-%26 B; 27-35 dk: 0,75 mL·dk-1 akış hızında %26 B. NOT: Sütunu en az %74 mobil faz A ve %26 mobil faz B'nin 3 sütun hacmiyle temizlenerek numune enjekte etmeden önce sütun koşullarının dengesini garanti edin (Tablo 1).<ol>
<li>0,22 μm gözenek boyutuna sahip bir PTFE filtresi kullanarak SPE'den elde edilen örnekleri HPLC şişelerine filtreleyin. NOT: Gözenek boyutu 0,22 μm olan PTFE filtreleri önerilir.</li>
		<li>Kofaktör F420 bileşimini ve konsantrasyonunu analiz etmek için HPLC sistemine 50 μL eluted numune enjekte edin. NOT: Bu protokolde nicel standart kullanılmadıkça, numunelerin ve varyantların pik alanla karşılaştırılması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451(2019).</li>
<li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+F420%3A+an+expanded+view+of+its+distribution%2C+biosynthesis%2C+and+roles+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li>
<li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li>
<li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li>
<li>Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li>
<li>Lin, X. -L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li>
<li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis%3A+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li>
<li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea%2C+in+particular+the+genus+Methanosarcina%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li>
<li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li>
<li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species%2C+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li>
<li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li>
<li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li>
<li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+production%2C+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li>
<li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F%28420%29+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).</li>
<li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), Cambridge, England. 11208-11211 (2018).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).</li>
<li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li>
<li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li>
<li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed%5BTitle%5D)+AND+%22BioFactors%22%5BJournal%5D)">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), Oxford, England. 139-145 (1994).</li>
<li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coenzyme+F%28420%29+in+Mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li>
<li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic%2Fanoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).</li>
<li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li>
<li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+acetate%3A+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%2C+preservation%2C+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li>
<li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803(2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Metanojenik saf kültürlerden kofaktör F420'nin değerlendirilmesi için, ilgili mikroorganizmaların büyümesini ve aktivitesini (floresan mikroskopi) görselleştirmek için mikroskobik bir değerlendirme yapılabilir (Şekil 1). Doğal ortamlardan türeyen numuneler için, F420'yi tespit etmek veya ölçmek için mikroskopi kullanımı, diğer floresan mikroorganizmalar, organik ve inorganik parçacıklarla yapılan girişimler nedeniyle sınırlıdır. Bu bağlamda, F420'nin çıkarılm...

F420, hem Archaea hem de Bacteria1,2'nin birincil ve ikincil metabolik süreçlerinde zorunlu iki elektronlu hidrit taşıyıcısı olarak işlev gören yaygın ancak genellikle ihmal edilen bir kofaktördür. F420, 5 deazaflavindir ve yapısal olarak flavinlere benzer, böylece kimyasal ve biyolojik özellikleri NAD+ veya NADP + ile daha karşılaştırılabilir. İzoalloksiazin halkasının 5 pozisyonunda karbonlu azot ikamesi nedeniyle, güçlü bir redüktanttır, böylece -340 mV1,3 düşük standart redoks potansiyeli sergiler. F420, 5-deazaflavin halkası ve 2 fosfo-L-laktat bağlayıcıdan (F420-0) oluşur. Moleküle (F420-n+1)4 n+1 glutamat monomerleri içeren bir oligaoglutamat kuyruk takılabilir.
Uzun zamandır, cofactor F420 sadece Archaea ve Actinobacteria ile ilişkilendirilmiştir. Bu büyük ölçüde devrildi. Son analizler, F420'nin phyla Proteobacteria, Chloroflexi ve potansiyel olarak Firmicutes'in çeşitli anaerobik ve aerobik organizmaları arasında dağılmayan toprak, göl ve insan bağırsağı gibi sayısız habitatta yaşadığını ortaya koydu1,5. 2019'da Braga ve ark.6, proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica'nın çeşitli habitatlarda yaygın olabilecek 2 fosfolactate kuyruk yerine 3 fosfolycerat içeren benzersiz bir F420 türevi ürettiğini gösterdi. Archaea etki alanında, F420 metanojenik7, metanotrofik8,9 ve sülfat azaltıcı siparişler10 dahil olmak üzere çeşitli soylarda bulunmuştur ve Thaumarchaeota11'de üretilmesi beklenmiştir. F420 en iyi hidrojenotrofik ve methylotrofik metanogenezde temel bir redoks koenzim olarak bilinir. F420'nin (F420H2) azaltılmış formu, metilennetetrahydromethanopterin (metilen-H4MPT, Mer) ve metilen-H4MPT12,13'ün azaltılması için bir elektron donörü olarak işlev görse de işlev görsedir. Sitokrom içeren metanojenlerin H2 bağımsız elektron taşıma yollarında elektron taşıyıcı olarak da kullanılabilir12,14. Ayrıca, F420'nin oksitlenmiş formu, metanojenlerin mikroskobik olarak tespitini kolaylaştıran 420 nm'de eksize edilen karakteristik bir mavi-yeşil floresan vardır (Şekil 1). Düşük redoks potansiyeli nedeniyle, F420 (i) aksi takdirde recalcitrant veya toksik organik bileşiklerin geniş bir spektrumunun eksojen azaltılmasını kolaylaştırır, (ii) streptomisitlerde (phylum Actinobacteria) tetrasiklin ve linkozarit antibiyotiklerinin veya fitokoksinlerin sentezi ve (iii) mikobakterilerde oksidatif veya nitrosatif strese veya diğer elverişsiz durumlara karşı direnç (phylum Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Sonuç olarak, F420 bağımlı oksidoreductases, endüstriyel ve farmasötik amaçlar için ve kontamine ortamların biyo-işletimi için biyokatalistler vaat ediyor1,23. Bu son bulgulara rağmen, kofaktör F420'nin kesin rolleri Actinobacteria veya diğer bakteriyel phyla'da hala marjinal olarak bilinmektedir.
F420 biyosentezi için en az üç yol vardır2,6,24. Başlangıçta, biyosentez yolu 5-deazaflavin biyosentez ve 2 fosfolactate metabolizma dalı olarak ayrılır. F420 molekülünün reaktif kısmı, tirozin ve 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione substratları kullanılarak FO-synthase yoluyla sentez edilir. Sonuç riboflavin seviyesi kromofor FO'dur. Şu anda kabul edilen laktat metabolizması dalında, L-laktat bir L-laktat kinaz (CofB) tarafından 2 fosfo-L-laktata ile fosforilasyon edilir; 2-fosfor-L-laktat, sırayla, 2-fosfor-L-laktat guanylyltransfeaz (CofC) tarafından L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine guanylated edilir. Bir sonraki adımda, L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine, F420-02'yi oluşturmak için 2 fosfo-L-laktat transferaz (CofD) ile FO'ya bağlanır. Son olarak, F420-0:ɣ-glutamil ligaz (CofE) enzimi glutamat monomerlerini F420-0'a bağlar ve son kofaktör6'yı değişen sayılarda oluşturur23,25. Farklı organizmalar, ekli glutamat kalıntılarının sayısında farklı desenler gösterir ve metanojenler için mikobakterilere göre daha kısa kuyruklar bulunur2,25,26. Genellikle, metanojenler kuyruk uzunluklarını iki ila üç arasında gösterir, asetoklastik metanojende beşe kadar, Methanosarcina sp., Mycobacterium sp.'de bulunan kuyruk uzunlukları ise beş ila yedi glutamat kalıntısı arasında değişmektedir2,25,26,27. Bununla birlikte, son bulgular, uzun zincirli F420'nin kısa zincirli F420'den daha yüksek bir benzeğe sahip F420 bağımlı oksitodikozlara bağlandığını göstermiştir; ayrıca, bağlı uzun zincirli F420, substrat benzeşimini arttırır, ancak ilgili enzimlerin ciro oranını azaltır23.
Kofaktör F420'nin tespiti genellikle floresansına dayanır. Böylece, oligo glutamat türevleri ters faz (RP)-HPLC27,28 kullanılarak ayrıldı. Son zamanlarda, Ney ve arkadaşları RP-HLPC'deki ayrımı başarıyla artırmak için negatif yüklü glutamat kuyruğu için iyon eşleştirme reaktifi olarak tetrabutylammonium hidroksit kullandılar5. Burada, sadece saf kültürlerden değil, aynı zamanda farklı çevresel örneklerden (yani topraklar ve digester çamuru) numunelerin hazırlanması, sonraki liziz, ekstraksiyon, saflaştırma, ayırma ve koordinasyon için bir yöntem sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Gradyan modül, fırın ve floresan dedektörü ile donatılmış</td><td></td><td></td>otoklav Biyouyumlu HPLC sistemi Shimadzu <td></td> HPLC sistemi</tr><tr><td></td> 50 mL için santrifüj ve rotor "<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Şahin" tüpler (11.000 rcf) ve uygun tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC Sütunu: Gemini NX C18, 5 & mu; m, 150 x 3 mm</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>HPLC kolon</td></tr><tr><td>PTFE filtre (gözenek boyutu 0.22 ve mikro; m) SPE için HPLC analizinden</td><td></td><td></td><td></td>önce partikül maddeyi uzaklaştırmak</tr><tr><td>için Reçine: Strata-X-AW 33 & mu; zayıf anyon karışık modlu polimerik sorbent olarak m</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>zayıf anyon karışık modlu polimerik sorbent</td></tr><tr><td>SPE ve uygun toplama tüpleri için vakum manifoldu</td><td></td><td></td><td>SPE ekipmanı</td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methanojenik saf kültürlerden ve Çevre örneklerinden poliglutamat kuyruk uzunluğunun analizi için cofactor f420 ekstraksiyonu

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

Kofaktör F420 , birçok bakteriyel ve arkeal taksonun birincil ve ikincil metabolizmasında hidrit taşıyıcısı olarak merkezi bir rol oynar. Kofaktör en çok termodinamik olarak zor reaksiyonları kolaylaştırdığı metanogenezdeki rolü ile bilinir. Poliglutamat kuyruk farklı organizmalar arasında uzunluk olarak değiştiğinden, uzunluk profili analizleri çeşitli habitatlardaki farklı grupları ve yolları ayırt etmek ve karakterize etmek için güçlü bir araç olabilir. Burada protokol, kültürel veya moleküler biyolojik yaklaşımlardan bağımsız olarak yüksek performanslı sıvı kromatografi analizi ile birlikte katı faz ekstraksiyonu uygulanarak kofaktör F420 tespitinin ekstraksiyonunu ve optimizasyonunu açıklar. Yöntem, topraklardaki mikrobiyal topluluklardan, anaerobik çamurlardan ve saf kültürlerden kofaktör F420'nin ifadesi hakkında ek bilgi edinmek için uygulandı ve dikenli deneylerle değerlendirildi. Böylece çalışma, kontrollü metanojenik saf kültürlerde hidrojenotrofik ve asetoklastik metanojenlerin yanı sıra anaerobik sindirici çamur ve topraklar gibi çevresel örneklerden farklı F420 kuyruk uzunluğu profilleri üretmeyi başardı.

Her ikisi de termofilik metanojenik Arkea olan Methanosarcina thermophila ve Methanoculleus thermophilus'un saf kültürleri, daha önce açıklandığı gibi uygun medyada yetiştirildi29,30. Metanosarcina thermophila için metanol enerji kaynağı olarak kullanılırken, H2/CO2'de Metanoculleus thermophilus yetiştirildi. Büyüme mikroskobik değerlendirme ile kontrol edilirken, aktivite daha önce açıklandığı gi...

Saf kültürlerden kofaktör F420'nin çıkarılması için bir yöntem, saf kültür ve çevre örneklerinde F420 kuyruk uzunluğunun sıvı kromatografik ayrımı ve analizi için optimize edildi.

Methanojenik Saf Kültürlerden ve Çevre örneklerinden Poliglutamat Kuyruk Uzunluğunun Analizi için Cofactor F420 Ekstraksiyonu

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

Kofaktör F420, birçok prokaryotların birincil ve ikincil metabolizmasında önemli bir rol oynar. Bu molekülün çevresel örneklerde ölçülmesi, yaygınlığının ve işlevinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Bu teknik, koktorun çamur ve toprak gibi zor numune malzemelerinde analizini sağlar.Böylece malzemenin lizisi ve analizden önce ön saflaştırma merkezi adımlardır. Protokol, örnek hazırlama sırasında farklı adımlar içerir. Bu adımlar, numune işlemeye başlamadan önce çok iyi planlanmış ve hazırlanmalıdır.Örneğin, taze tamponların hazırlanması önemlidir. Örnek lizise başlamak için, numunenin beş gramını 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Daha sonra numunelere beş mililitre 2X lizis tamponu ekleyin ve mililitre başına 0,5 gramlık son konsantrasyona ulaşmak için hacmi damıtılmış su ile 10 mililitreye getirin.Seyreltilmiş örnekleri 20 saniye boyunca girdaplayın ve ardından 121 santigrat derecede 30 dakika boyunca otomatik olarak kaplayın. Orman toprağı gibi kuru numuneler için, otomatik kapanmadan sonra damıtılmış su ile 20 mililitrelik son hacme getirin ve seyreltilmiş numuneyi gösterildiği gibi 20 saniye boyunca tekrar girdaplayın. Numuneler soğuduktan sonra, numuneyi 11.000 x g'da beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın.100 miligram zayıf anion karışık mod polimerik sorbent şartlandırma ile dolu beş mililitrelik katı faz ekstraksiyonu veya SPE sütunu hazırlayın. Daha sonra, anion eşanjörünü üç mililitre damıtılmış su ile dengelayın. Santrifüjlü lisattan spe sütununa dokuz mililitreye kadar süpernatan yükleyin.Sütundaki safsızlıkları beş mililitre 25 milimolar amonyak asetat ve beş mililitre metanol ile ardışık olarak yıkayın. Yıkadıktan sonra, kofaktör F420'yi bir mililitre elution tamponu ile elüte edin. Fırını 40 santigrat dereceye ayarlayın ve floresan dedektörünü 420 nanometre yok olma dalga boylarına ve 470 nanometre emisyon dalga boylarına ayarlayın.Ardından, 0,22 mikron gözenek boyutuna sahip bir PTFE filtresi kullanarak SPE'den elde edilen örneği HPLC şişelerine filtreleyin. Filtrelenmiş numunenin 50 mikrolitresini HPLC sistemine enjekte edin ve el yazmasında açıklandığı gibi mobil aşamaların bir kombinasyonunu kullanarak degrade modu ile kofaktör F420'yi ayırın. Cofactor F420 bileşimini ve konsantrasyonunu analiz edin.Metanojenlerin saf kültürlerinin büyümesi mikroskopi ile doğrulandı. Faz kontrastlı mikroskopide, kofaktör F420 ultraviyole ışıkla heyecanlandığında mavimsi bir ışık yayan metanojenlerin aglomeraları görülebilir. Methanoculleus thermophilus kültürlerinin farklı hacimlerine sahip SPE'den sonra kurtarılan kofaktör F420'nin tepe alanı analiz edildi.Otomatik kapanma parçalama stratejisi, basınç sıcaklığı tedavisi kullanarak maksimum ekstraksiyon verimliliğini sonuçlandırarak en yüksek tepe alanına ulaştı. Kuyruk uzunluğu dağılımının analizi, kofaktör F420'nin genel konsantrasyonundaki farklılıkları ve saf metanojenik kültürlerin F420 kuyruk uzunluğunun çevresel örneklerde dağılımını ortaya koydu. Bu yordamı uygularken, elution arabelleğinin toplam hacmini tamamen toplamayı veya akış hacmini tam olarak kaydetmeyi unutmayın.Bu teknik, kofaktör F420'nin topraklar ve çamurlar gibi daha karmaşık örneklerde araştırılmasının önünü açmakta ve bu molekülün ekolojik etkisi hakkında daha derin içgörüler sağlamaktadır.

extraction-cofactor-f420-for-analysis-polyglutamate-tail-length-from

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Biz, ATP-kapılı P2X2 reseptörlerinin tam uzunlukta C terminus bağlamak beyin proteinleri tespit etmek için basit bir protokol açıklar. Bu yaklaşımın uzantısı ve sistematik bir uygulama tüm p2x reseptörlerine p2x reseptör sinyal daha iyi anlaşılmasına yol açması bekleniyor.

P2X2 Ligandla Gated Katyon Kanalları ile etkileşimde Proteinler tanımlamak için Proteomik

Protein ekstraksiyonu mantar türlerinde proteomik analizleri için en az bir proteomik deney (MIAPE) kuralları hakkında bilgi göre, başarılı olmak için standardizasyon yüksek düzeyde gerektirir. Biz toksin indüksiyon ve protein izolasyonu sırasında deneysel önyargı en aza indirmek için bir prosedür içeren bir video protokol...

Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp.</emProteomik Araştırmalar> Kültürler

Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama...

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

Fosfolipid yağ asitleri toprak mikrobiyal toplulukların yapısı hakkında bilgi vermek. Bu tek fazlı kloroform karışımı, bir katı faz ekstraksiyon kolonları kullanılarak ekstre lipidlerin fraksiyonasyonu ve kılcal gaz kromatografisi ile analiz edilir yağlı asit metil esterlerinin üretilmesi için metanoliz toprak örneklerinden çıkarılması için yöntemler sunmak.

Ekstraksiyon ve Topraklarda Mikrobiyal Fosfolipid Yağ Asitleri Analizi

Makale, birçok numuneyle yapılan çalışmalarda toprak mikrobik topluluk yapısını belirlemek için hem toplam lipidlerin hem de gösterge lipidlerinin göreceli olarak bolluğunun karakterize edilmesinde kullanılmak üzere, mikroorganizmaların hücre membranlarından lipidlerin ekstraksiyonu için çaba ve doğruluğu denkleştirirken, verimliliği arttıran bir yöntemi açıklıyor.

Çok Örnekli Deneylerde Toprak Mikroplarını Karakterize Etmek İçin Bir Lipid Ekstraksiyon ve Analiz Metodu

Bir iletişim kuralı aynı anda metabolitleri, proteinler ve yağlar bir tek toprak örneğinden ayıklanması, azaltılmış örnek hazırlama kez izin ve multi-omic kütle spektrometresi analizleri ile sınırlı miktarda örnekleri etkinleştirme için sunulmaktadır.

Toprak örnekleri Multi-omic analizleri için karmaşık iletişim kuralı

Bu iletişim kuralı tek bir üretim için doğal organik madde ve mikrobiyal proteomik farklı ekosistemleri içinde tam olarak eşleştirilmiş karakterizasyonu sonuçlanan tamamlayıcı analitik ve omics teknikleri açıklar. Bu yaklaşım sağlam karşılaştırmalar metabolik yollar ve sera gazı üretim tanımlamak ve çevresel değişimin yanıt tahmin için önemli dönüşümleri tanımlamak için izin verir.

Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler

Fumarilasetoasetik hidrolaz etki alanı içeren proteinlerin ifade ve arıtma örnekleri ( E. coli, FPLC ifadesi) ile açıklanmıştır. Arıtılmış proteinler kristalizasyon ve antikor üretimi için kullanılır ve enzim asdında istihdam edilir. Seçilen fotometrik asdalar, oxaloasetat dekarboksilaz ve acylpyruvate hydrolase olarak FAHD1 Multi-functionality görüntülemek için sunulmaktadır.

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Bu protokol, sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi kullanılarak analiz edilmeden önce trikloroasetik asit (TCA) protein çökeltmesi ve asit hidrolizi yoluyla biyolojik matrislerden protein olmayan amino asitlerin ekstraksiyonunu açıklamaktadır.

Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi Analizi için Siyanobakterilerden Protein Dışı Amino Asitlerin Ekstraksiyonu

Burada, müsinlerden O-glikanların salınması ve ardından MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak tuzdan arındırma, permetilasyon ve analiz için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi Kullanılarak Permetillenmiş Müsin O-glikanlarının Profillenmesi

Bu protokol, düşük girdili fare dışkı örneklerinden kısa zincirli yağ asitlerini türetme olmadan izole etmek için iki fazlı asit-çözücü ekstraksiyon yöntemini tanımlar.

Fare dışkısından kısa zincirli yağ asitlerinin iki fazlı asit-çözücü yöntemiyle ekstraksiyonu

Öğrenin, metanojenik saf kültürlerden ve çevre örneklerinden kofaktör F420 ekstraksiyonu ve poliglutamat kuyruk uzunluğu analizi için optimize edilmiş bir yöntem. Bu teknik, prokaryotik metabolizmadaki rolünü anlamak için hayati önem taşır.

Methanojenik Saf Kültürlerden ve Çevre örneklerinden Poliglutamat Kuyruk Uzunluğunun Analizi için Cofactor _F420 Ekstraksiyonu

Daha fazla video keşfet