Zebra Balığı Embriyolarında Hızlı Kardiyak Dinamiklerin Işık Tabakası Mikroskopisi

Protokolümüz zebra balığı kalbi in vivo incelemek için optimize edilmiş bir araç sunar ve kardiyak görüntüleme için veri toplama ve analiz boru hattı ile birlikte hareketsizleştirme tekniklerini gömmeyi açıklar. Zebra balığı, ilaç ekranı gibi uygulamalar için büyük bir potansiyele sahip bir kardiyak model sistemidir. Kalp hastalıkları incelerken fizyolojik koşullar altında nazik görüntülemeyi sağlayan protokol çok önemlidir.

Burada sunulan iş akışı zebra balığı embriyonik kalp görüntülemeye odaklanır, ancak değiştirilmiş bir versiyon kalamar, solucan ve hidra da dahil olmak üzere diğer çeşitli örneklere ve deneylere uygulanabilir. İstenilen transgenik çizgilerin üremesinden elde edilen embriyoları toplayarak başlayın. Embriyoları E3 balık ortamı ile dolu bir Petri kabında 28 santigrat derecede tutun.

Bir mikromanipülatöre monte edilmiş ve bir piko enjektöre bağlı bir delikli cam iğne kullanarak balığı hareketsiz hale getirmek için bir veya iki hücre evre embriyosunun sarısına 30 adet alfa-bungarotooksin mRNA enjekte edin. Yumurtaları E3 ortamı ile dolu bir Petri kabında 28 santigrat derecede tutun ve yumurtaları her 24 saatte bir görüntülemeye kadar taze E3 ortamı içeren yeni bir tabağa aktarın. Pigment oluşumunu önlemek için, zebra balığı arka planı albino değilse, gübrelemeden 25 saat sonra balıkları PTU olarak da bilinen 0,2 milimole tyrosinaz inhibitörü 1-fenil 2-tiyotirea ile E3 ortamı içeren yeni bir yemeğe aktarın.

Florlu etilen propilen tüpünü düzeltmek için tüpü, polimer tüplere uyacak şekilde doğru iç çapa sahip bir cam veya çelik otoklav güvenli boruya yerleştirin ve iki saat boyunca 180 santigrat derecede otoklav yapın. Tüpler oda sıcaklığına ulaştığında, düzleştirilmiş polimer tüpü çıkarın. Tüpü temizlemek için, tüpü bir azı dişi sodyum hidroksitle iki kez yıkamak için 50 milimetrelik bir şırıng kullanın.

Tüpü 50 mililitre santrifüj tüpü boyutuna kesin, 0,5 molar sodyum hidroksit ve ultrasonicate ile dolu bir santrifüj tüpüne 10 dakika yerleştirin. Florlu etilen propilen tüpünü çift damıtılmış su ile yıkayın ve ardından% 70 etanol. Transfer tüpleri taze bir santrifüj tüpü 10 dakika boyunca% 70 etanol ve ultrasonicate içeriyordu.

Ultrasonication sonra, çift damıtılmış su ile son kez tüp yıkayın ve çift damıtılmış su içeren bir santrifüj tüp içinde saklayın. E3 ortamında düşük erime noktası agarose erittikten sonra erimiş agarose bir ila iki milimetrelik bir ceket yapmak için bir cam veya plastik Petri kabına dökün. Agarose katılaştıktan sonra, kurumayı önlemek için E3 ortamını agarın üzerine hafifçe dökün.

Plakayı parafin filmi ile kapatın ve dört santigrat derecede saklayın. Trikainin stok çözeltisini çözün ve gömme ortamı olarak kullanmak için metil mavisi olmadan E3 ortamına% 0.02 trikain ekleyin. Balıkları gömme ortamına aktarmak için tek kullanımlık bir cam pipet kullanın.

Balığın hareket etmeyi bıraktığını ve kalbin kontrole kıyasla benzer bir hızda attığını doğrulayın. Florlanmış etilen propilen tüpünü jiletle ideal uzunlukta kesin. Künt uçlu bir kanonla şırınna hazırlayın.

Şırıngayı havayla doldurun, ardından tüpü iğneye monte edin ve şırıngayı boşaltarak kalan suyu hafifçe boşaltın. Daha sonra, bir şırıncaya monte edilmiş florlu etilen propilen tüpünü medya ile doldurun. Tüpe bir embriyo yerleştirin, balık kafasını tüp ucuna yakın tutun, kabarcık oluşumunu önleyin.

Bir jilet kullanarak, tüpü künt uç kanül veya iğnenin kenarında dikkatlice kesin. Agar kaplı kabın üstüne herhangi bir sıvı attıktan sonra, tüpü doğrudan ağar içine daldırın. Tüpü döndürün ve fişi agarose yatağından çıkarmak için dışarı alın.

Tüpün ucundaki agar fişinin varlığını doğrulayın. Uzun süreli görüntüleme için, tüpün eksenine dik bir jilet yerleştirerek balığın ucundan en az beş milimetre yukarıda, her kardinal yönde tüpe üç ila beş delik kesin ve montaj ortamına ulaşana kadar 30 derecede tüpe bir kesi yapın. Ardından, bir delik oluşturmak için 180 derecede ikinci bir kesi yapın ve kesimleri net bir şekilde görselleştirmek için tüpü yuvarlayın.

Monte edilen embriyoyu, görüntüye hazır olana kadar gömme ortamı içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü numune tutucusuna monte edin ve görüntüleme odasını gömme ortamı ile doldurun. Numune tutucuyu, numune hazneye dalarak sahneye yerleştirin.

Kalp atış hızını görsel olarak değerlendirerek gömülü balıkların sağlığını kontrol edin ve kalp atışı çok yavaşsa örneği atın. Tekrarlanabilir görüntüleme için her zaman aynı örnek konumunu kullanın ve balığı döndürün, böylece her iki göz de odak düzlemindedir. Daha sonra, gübreleme görüntülemeden sonra 48 saat boyunca balığı saat yönünün tersine yaklaşık 20 ila 30 derece döndürün.

Balık lazer gücüne adapte olduğunda, en iyi görüntü kalitesini veren aydınlatma tarafını seçin. Her Z düzlemsinde, saniyede 300 kare veya daha fazla hızda dört ila beş kalp atışı kaydedin. Atan kalbi kaydetmek için numuneyi ışık tabakası boyunca adım adım hareket ettirin ve kalbin tüm derinliğini kapatmak için bir ila iki mikrometrelik bir Z aralığı kullanın.

Verileri keşfetmek ve işlenmiş zebra balığı kalbinin filmlerini oluşturmak için 4D dosyayı bir 3D render yazılımına yükleyin. Döllenmeden 48 saat sonra kalp döngüye girdi ve ventrikül ve atriyum olmak üzere iki sine sahip, ancak henüz kapakçıkları geliştirmedi. Ventrikül, atriyoventriküler kanal, atriyum, giriş yolu ve çıkış yolu gibi farklı kalp yapıları kolayca ayırt edilebilir.

Veriler kesin atım olduğunu gösterdi ve kalbin iki hücre katmanı, miyokard, tek hücreli kas tabakası kasma ve güç üretme gücü ile kalbi vaskülasyona bağlayan tek bir hücre tabakası olan endokardyum arasındaki karmaşık etkileşimleri ortaya koydu. En önemlisi, stereoskop altında her zaman örnek sağlığını ve tutarlı kalp atışlarını doğrulamaktır. Geleneksel teknikler genellikle kalp şeklini veya işlevini etkilerken, yöntemlerimiz bize erken embriyonik kalbin temellerini anlamamıza yardımcı olan atan kalbin dinamik bozulmamış verilerini sunar.