Name: In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Öğrenin, C. elegans PLM nöronlarında canlı görüntüleme ile mikrotübül dinamiklerini ve yönelimini değerlendirme yöntemini. Bu teknik, nöronal gelişim ve rejenerasyon süreçlerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

İlk destek ve çalışmada kullanılan suş için Yishi Jin ve Andrew Chisholm'a teşekkür ederiz. OP50 bakteriyel suş, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetics Center'dan (CGC) ticari olarak yararlanmıştır. Dharmendra Puri'ye deneysel prosedürlerin standardizasyonu için de teşekkür ederiz. Çalışma, Ulusal Beyin Araştırma Merkezi'nin temel hibesi (Biyoteknoloji Bölümü tarafından desteklenmektedir, Hindistan Govt. ), DBT/Wellcome Trust India Alliance Erken Kariyer Hibesi (Grant # IA/E/18/1/504331) S.D.'ye, Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA/ I/ 13/ 1 / 500874) A.G.-R'ye ve Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu'ndan (SıRP: CRG/2019/002194) 'a A.G.-R.

1. Muhabir gerginliği: Kültür ve bakım
NOT: PLM nöronlarındaki mikrotübül dinamiklerini ve oryantasyonunu ölçmek için, dokunmatik nörona özgü promotör mec-4(juIs338 alele) 18,25,26altında EBP-2::GFP'yi ifade eden solucan suşunu kullandık. Bu suş için standart solucan kültürü ve bakım yöntemleri kullanıyoruz27.
<ol><li>Nematod Büyüme Ortamını (3,0 g/L sodyum klorür, 2,5 g/L pepton, 20,0 g/L agar, 10 mg/L kolesterol (10 mg/mL'lik bir stok çözeltisinden seyreltilmiş) suya hazırlayın ve karışımı otoklavlayın.</li>
	<li>Karışımı 1 mM kalsiyum klorür, 1 mM magnezyum sülfat ve 25,0 mM potasyum fosfat monobasik pH 6.0 ile takviye etmeden önce 10-15 dakika kısa bir süre soğutun.</li>
	<li>Karışımın yaklaşık 9 mL'sini steril bir dağıtıcı kullanarak 60 mm Petri kaplarına dökün, ardından oda sıcaklığında ve steril koşullarda bir gün boyunca saklayın ve daha sonra 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>50 mL B Suyu (5.0 g/L sodyum klorür, 10.0 g/L Bacto-Tryptone) hazırlayın, otoklav ve tek bir Escherichia coli kolonisi (OP50 suşu) ile aşılamadan önce soğutun.</li>
	<li>Bakterileri 37 °C'de 12 saat boyunca kültüre edin. Soğuduğu NGM plakalarını tohumlama için oda sıcaklığına getirin ve sterilize edilmiş bir cam serpme yağı kullanarak NGM plakasına OP50 bakterisi sürün.</li>
	<li>Aşılanmış NGM plakalarını 12 saat boyunca 37 ° C'de tutun, bu da C. eleganlarınkültleşmesi için bakteri çimlerinin oluşmasına izin verecektir. Bu plakalar kullanıma kadar 20 °C'lik bir inkübatörde saklanabilir.</li>
	<li>Tohumlu NGM plakalarındaki transgenik gerilimi arkalayın.</li>
	<li>Alev üzerine bir platin tel çekme sterilize ve taze tohumlu bir plakaya transfer için 20-25 gravid yetişkin hermafroditleri seçin.</li>
	<li>Aktarıldıktan sonra, plakayı 1 saat boyunca 20 °C'lik bir inkübatöre kaydırın. Sonra, yetişkinleri bu plakalardan çıkarın. Bu tabaklar artık yaşla eşleşen yumurtalar içerecektir.</li>
	<li>Plakaları, bu durumda yumurtlamadan 43,5 saat sonra L4 aşaması olan gelişim aşamasına ulaşana kadar yetiştirme için 20 ° C inkübatörüne kaydırın. Daha fazla solucan için, kalabalığı önlemek için birden fazla plakayı arkalayın.</li>
	<li>İstenilen gelişim aşamasında, bu solucanlar EBP-2::GFP kuyruklu yıldızlarının görüntülenmesi için monte edilebilir.</li>
</ol>2. Örnek hazırlama: EBP-2 kuyruklu yıldızlarının görüntülenmesi için solucanların montajı
NOT: PLM nöronlarındaki EBP kuyruklu yıldızlarının canlı gözlemini sağlamak için, solucanları nöronun fizyolojisini tehlikeye atmayacak şekilde hareketliliklerini en aza indirmek için agarose pedlerine monte ettik. Çeşitli hareketsizleştirme yöntemleri arasında, ticari olarak kolayca mevcut olan 0,1 μm Polistiren boncuk çözeltisini seçtik. Özellikle EBP-2::GFP gözlemi için kullanılan montaj prosedürünü özetledik.
<ol><li>2 mL 1x M9 tamponda (0,02 M KH 2 PO4, 0,02 MNa2HPO4 , 0,008 M NaCl, 0,02 M NH 4 Cl) 5 mL cam test tüpünde 0,2 g agarose eriterek%10agarose çözeltisi hazırlayın. Bu test tüpü, agarose'u kullanıma kadar erimiş durumda tutan bir ısıtma bloğuna kolayca sığabilir.</li>
	<li>Geniş ağızlı bir damlalık kullanarak, bu erimiş agarozun bir damlalarını (yaklaşık 100 μL) 35 mm x 25 mm boyutlarda temiz bir cam kaydırağın üzerine dağıtın.</li>
	<li>Erimiş durumdayken, cam slaytlar arasında agarose ince bir film oluşturmak için başka bir cam slayt ile damla basın. Agarose, yaklaşık 30 saniyede yaklaşık 0,5 - 1,0 mm kalınlığında bir film olarak katılaştır.</li>
	<li>Agarose katılaştıktan sonra, alt kaydırağı baskın olmayan elde ve üst slaytı baskın elde tutun. Agarose pad'in iki slaytlardan birine yapışması sonucu alt kaydırağı sabit tutarken üst kaydırağı yukarı çevirin.</li>
	<li>Oluşan agarose ped kapak kılıfı boyutundan (18 mm x 18 mm) daha büyükse, kapak kapağının düzgün yerleştirilmesini sağlamak için gerekli boyutları elde etmek için pedinin kenarlarını kesin. Bu agarose pedler hemen kullanım içindir ve saklanmamalıdır.</li>
	<li>Agarose pedi nemli ve montaj için uygun pürüzsüz bir yüzey için görsel olarak inceleyin. Agarose ped havaya maruz kalırsa ve kurursa, agarose pedinin yüzeyi buruşuk görünür. Böyle bir senaryoda, bu bölümün 2-6 adımlarında belirtildiği gibi taze agarose ped hazırlayın.</li>
	<li>Agarose ped üzerine montaj ortamı olarak 2 μL 0,1 μm polistiren boncuk çözeltisi koyun.</li>
	<li>Platin tel çekme kullanarak 3-4 solucan seçin ve bunları unseeded NGM plakasına kaydırın. Bu işlem, montaj sırasında hareketsizleşmeyi engelleyen yüzey bakterilerinin uzaklaştırılmasını sağlar.</li>
	<li>Solucanlar yüzey bakterilerinden çıktıktan sonra, platin tel çekme kullanarak monte etmek için alın ve agarose pedi üzerindeki polistiren boncuk damlasına yeniden kullanın.</li>
	<li>Dikkatlice, solucanların üzerine 18 mm x 18 mm'lik bir kapak kılıfı yerleştirin. Monte edilen solucanların tahliyesini önlemek için, yerleştirildikten sonra kapak sapını hareket ettirmeyin.</li>
	<li>Hazırlanan slaydı görüntüleme için mikroskop üzerine monte edin.</li>
</ol>3. Görüntüleme kurulumu ve edinimi
NOT: EBP kuyrukluyıldızları, C. elegans16,18'inmemeli ve PLM nöronlarında gözlendiği gibi yaklaşık0,22 μm/ s hız ile seyahat eder. Nyquist kriterleri28'egöre zaman atlamalı alımda olayları en iyi şekilde örneklemek için sırasıyla 0,09 μm ve 0,43 s uzaysal ve zamansal ölçekler gereklidir. Fototoksisi veya fotobleachingin önlenmesi için Spinning Disk alımını kullandık. Görüntüleme kurulum ve alım ayarlarımızı aşağıda açıklamış bulunuyoruz.
<ol><li>Dönen disk ünitesi ve kamera ile donatılmış ters bir mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın. Üreticinin talimatına göre kurulumu açın.</li>
	<li>Kurulumu denetleyen yazılımı açın.</li>
	<li>Bu ters bir mikroskop olduğundan, takılı solucanlarla birlikte kaydırağı, kapak aşağı bakacak şekilde düşük büyütme hedefi (5x veya 10x) ile sahneye yerleştirin.</li>
	<li>Yansıyan ışık için iletilen ışık ve cıva ark lambası için halojen lambadan aydınlatma kullanan göze veya görünür moda giden ışık yolunu ayarlayın.</li>
	<li>Parlak alanın altındaki görüş alanına bir solucanı odakla ve ortala.</li>
	<li>Daldırma yağını koyun ve büyütmeyi 63x (1.4NA / Yağ) olarak değiştirin ve solucan kuyruğunu PLM nöronları için parlak alanda yeniden odaklayın.</li>
	<li>PLM nöronlarının kısa bir yeniden odaklama için cıva ark lambasının floresanını açın. GFP'nin görselleştirilmesi için doğru reflektör setini (AF488) ışık yoluna yerleştirin.</li>
	<li>Işık yolunu kameraya yönlendirerek mikroskobu kamera alımına ayarlayın. NOT: Yukarıda belirtilen adımların mikroskobun İnce Film Transistörü (TFT) ekranından 4-7'ye kadar kontrol edilmesi hızlıdır ve aydınlatmaya gereksiz yere maruz kalmayı önler. Alternatif olarak, aydınlatmayı, reflektörün yazılım aracılığıyla kontrol edin.</li>
	<li>PLM nöronunun görüş alanına odaklanmasından sonra, yazılım arayüzünde% 30 güç ve Elektron Çarpma (EM) kazanç değeri 70 ile kamera için 300 ms pozlama ile 488 nm lazerin aydınlatmasını seçin. Muhabir ifadesine bağlı olarak, bu parametreleri gerektiği gibi değiştirebilir. Ayarları sonraki görüntüleme oturumları için bir yapılandırma olarak depolayın.</li>
	<li>Kanallar sekmesi, parçaların her biri belirli bir aydınlatma ve kamera ayarıyla depolar. Vurgulanan parça canlı bir görselleştirme sağlarken, parçanın işaretlenmesi gereken bir görüntü elde etmek için. Çalışma alanında solucanın kuyruğunun canlı görselleştirilmesi için brightfield (DIC) içeren bir kanalı vurgulayın. Örnek, çalışma alanının canlı görüntüleme penceresinde odaklanmış ve ortalanmıştır.</li>
	<li>PLM nöronunun canlı görüntüleme penceresinde hızlı bir şekilde odaklanması için kanalı 488 nm lazer ekscitasyon ile vurgulayın. Odaklandıktan sonra, bir sonraki adımda belirtildiği gibi zaman serisi parametrelerini ayarlayarak zaman atlamalı alıma başlayın.</li>
	<li>488 nm lazer aydınlatma kullanarak, 2 dakika boyunca zaman serileri ile bir deney ayarlayın ve çerçeveler arasında zaman aralığı yok. Görüntü alımının zamansal ölçeklerini korumak için sadece GFP floresanını satın aldık.</li>
	<li>Denemeyi Başlat sekmesini kullanarak edinme işlemine başlayın. 63x büyütme kullanmak, uzamsal çözünürlüğü kamera tarafından 0,09 μm piksel boyutunda örneklenen 0,21 μm ile sınırlar. Olayı en iyi şekilde örneklemek için 3,3 kare/sn'de bir zaman atlamalı elde edin. Zaman atlamalı görüntü, 2 dakikalık bir süre boyunca elde edilen 396 zaman dilimine sahipti. Satın alma işleminden sonra, görüntüyü daha sonra varsayılan yazılım veya ImageJ tarafından erişilebilen varsayılan biçimde kaydedin.</li>
</ol>4. Gözlem ve analiz
<ol><li>Varsayılan yazılımda zaman uyumlu alımını önizleyin veya Bioformats eklentisi aracılığıyla Image J'de açın. NOT: Görüntü analizi sürecini Image J'de anlattık.</li>
	<li>ImageJ'de Bioformats eklentisini yükleyin.<ol>
<li>Alternatif olarak, ImageJ'de dosya uyumluluğu için varsayılan biçim dosyasını .tif verin. ZEN2'deki dışa aktarma işlevi, görüntünün ayrık .tif dosyaları olarak tek tek karelerine neden olur. Çok sayıda dosyanın oluşumunu önlemek için bu yöntemden kaçınıyoruz.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntüyü '.czi' formatında doğrudan 'Bioformats' eklentisi aracılığıyla Image J'de açın. Görüntü çok görüntülü bir yığın olarak açılır. Varsayılan yazılımın "dışa aktar" işlevini kullanıyorsanız, ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks Submenu > Images To Stacks'teki aşağıdaki iş akışını kullanarak görüntüleri çok görüntülü bir yığın olarak yeniden düzenleyin.</li>
	<li>Görüntü penceresinin sol alt köşesindeki Oynat simgesini kullanarak görüntüyü film olarak önizleyin. Kuyruklu yıldızlar, PLM nöronunun hücre gövdesinde ve süreçlerinde parlak mobil nokta olarak görülebilir. Kuyruklu yıldızlar net bir şekilde görünüyorsa, 8.</li>
	<li>Arama Tablosu'nu (LUT) kullanarak görüntünün renk profilini gri tonlamalı görüntüye dönüştürün: ImageJ programı > Görüntü menüsü > Arama Tabloları alt menüsü > Grileri Seç.</li>
	<li>Kolay görselleştirme için görüntünün LUT profilini ters çevirin: ImageJ programı > Görüntü menüsü > Arama Tabloları alt menüsü > INVERT LUT.</li>
	<li>Kuyrukluyıldızları görmek için görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlayın: ImageJ programı > Görüntü menüsü > Parlaklık / Kontrast > alt menüleri ayarlayın.<ol>
<li>Görüntüdeki yoğunlukların istenen ölçeklenerek ölçeklenerek Minimum, Maksimum, Parlaklık ve Karşıtlık kaydırıcılarını hareket ettirın. Görüntüleri kuyrukluyıldızlarla belirgin bir şekilde ölçtük.</li>
	</ol></li>
	<li>ImageJ'in temel sürümünde simgeler olarak temsil edilen başlangıç araçları vardır. Açılan menüyü açmak için çizgi içeren simgeyi bulun ve sağ tıklatın ve Parçalı satırıseçin. Parçalanmış çizgiyi, kaynağı nöronun hücre gövdesi üzerinde veya yakınında olan ilgi alanlarına (ROI) çizin.<ol>
<li>Daha sonraki hususlar için, aşağıdaki iş akışını kullanarak segmentlere ayrılmıştı satır yatırım getirisini yatırım getirisi yöneticisi aracılığıyla kaydedin: ImageJ > > Araçları Analiz > YATıRıM Getirisi yöneticisi > Görüntüde çizilen izlemeyi seçin ve YATıRıM YÇ yöneticisi penceresinde Ekle'yi tıklatın > Kaydet'> yatırım getirisi yöneticisi penceresinde Daha Fazla .</li>
	</ol></li>
	<li>Kimografı oluşturmadan önce, uzamsal ve zamansal ölçekler farklı olduğundan, aşağıdakileri kullanarak piksel cinsinden ölçümleri elde etmek için ölçeklendirmeyi kaldırın: ImageJ > Analiz et > Ölçek ayarla > Ölçeği kaldırmak için tıklatın > Tamam.</li>
	<li>Resim > Yığınları açılır menüsünün altındaki Yeniden Kaydır işlevini kullanarak bir kimograf oluşturun. Kimograf, segmentlere ayrılmıştı yatırım getirisinin zaman içinde bir temsilidir. Yatay eksen mesafeyi, dikey eksen ise saati temsil eder. Çapraz izler hareketli kuyrukluyıldızları temsil eder. Genellikle, kimograf görüntünün renk profilini alır, aksi takdirde çapraz izlemelerin görselleştirilmesi için önceki 5-6 adımlarında açıklandığı gibi bir renk profili atar.</li>
	<li>Çizgi aracının açılan menüsündeki Düz çizgi işlevini kullanarak (bu bölümün 9. adımına bakın) çapraz izlemelerin her birinin üzerine düz çizgiler çizin ve bunları yatırım getirisi yöneticisine ekler.</li>
	<li>Çözümle sekmesinin altında Ölçümleri Ayarla'ya gidin ve izlemeleri ölçmek için Ortalama Yoğunluk ve Sınırlayıcı Dikdörtgen parametrelerini seçin.</li>
	<li>Yatırım getirisi yöneticisi penceresinde, yatırım getirisinin ortalama yoğunluğunu, çizgi izlemelerinin X ve Y koordinatlarını, genişlik, yükseklik, açı ve çizgi izlemelerinin uzunluğunu verecek bir Sonuç penceresi açacak Ölçü'nün üzerine tıklayın. Bu pencere .csv biçimi olarak kaydedilebilir ve daha sonra bir veri çözümleme programına aktarılabilir.</li>
	<li>Elektronik tablo programında, sonuçlar penceresi satır ve sütunlar halinde dağıtılan değerlerle açılır. İlgili değerler, izlerin genişliği, yüksekliği ve açısıdır. Genişlik iz'in yer değiştirmesini verir, yükseklik süreyi verir ve açı vektörü temsil eder. Genişlik ve yükseklik değerleri piksel cinsinden olduğundan, standart ölçülebilir parametreleri elde etmek için bunları sırasıyla uzamsal ve zamansal ölçeklerle çarpın.</li>
	<li>Kimografın sol tarafı hücre gövdesine proksimal olduğundan, açıya bağlı olarak, kuyrukluyıldızları artı-son veya eksi-sonu olarak sınıflandırın (yani, sırasıyla hücre gövdesinden uzağa veya hücre gövdesine doğru). Açıları sırasıyla 1° ila -89° ve -91° ila -179° arasında artı-bitiş ve eksi-bitiş olarak sınıflandırın. Bir çalışma için bir elektronik tablodaki birden çok kimograftan gelen verileri harmanla ve istatistiksel olarak temsil edin.</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Mikrotübül dinamiklerini anlamak, yıllar boyunca sitoskeletal araştırma alanında önemli bir odak noktası olmuştur. Mikrotübüller, sürekli dinamik dengesizlik süreci ile birlikte çekirdeklenme ve felakete uğrar44,45,46,47. Bu bilgilerin çoğu, serbest vs polimerize tübulinin ışık saçılım okumaları, floresan tübulinden mikrotübül büyüme tahlillerivb.<...

Nöronlar dendritler, hücre gövdeleri, aksonlar ve sinapslar gibi özel bölmelere sahip ayrıntılı bir mimariye sahiptir. Nöronal sitoskeleton mikrotübüller, mikrofilamentler ve nörofilamentlerden oluşandır ve farklı organizasyonları nöronal bölmeleri yapısal ve işlevsel olarakdestekler 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Yıllar içinde mikrotübül organizasyonu nöronal polarite ve fonksiyonun önemli bir belirleyicisi olarak tanımlanmıştır. Nöronlar gelişim veya yenilenme sırasında yapısal tadilata tabi tuttukça, mikrotübül dinamikleri ve yönelimi çeşitli nöronal bölmelerin kimliğini, polarize taşınmasını, büyümesini ve gelişimini belirler7. Bu nedenle, nöronal yeniden şekillendirme işlemi ile ilişkili olmak için mikrotübül dinamiklerini ve oryantasyonunu değerlendirmek zorunludur.
Mikrotübüller, dinamik artı uçları ve nispeten istikrarlı eksi uçları11,12olan α ve β Tubulin heterodimerlerinin protofilamentlerinden oluşur. Artı uç kompleksinin ve ilişkili uç bağlama proteinlerinin keşfi, mikrotübül organizasyonunun13. Son bağlayıcı proteinler (EBP) geçici olarak mikrotübüllerin büyüyen artı uçları ile ilişkilidir ve ilişki dinamikleri mikrotübül protofilamentlerinin büyümesi ile ilişkilidir14,15. Artı uç kompleksinin mikrotübül ile sık sık ilişkilendirilmesi ve ayrışması nedeniyle, GFP etiketli EBP'nin nokta yayma işlevi bir timelapse filmi15,16'dabir "kuyruklu yıldız" olarak görünür. Memelinöronlarında öncü gözlemden bu yana16, floresan proteinlerle etiketlenmiş son bağlayıcı proteinler, farklı model sistemleri ve nöron tipleri 17 , 18 ,19, 20 ,21,22,23arasında mikrotübül dinamiklerini belirlemek için kullanılmıştır.
Basit sinir sistemi ve şeffaf gövdesi nedeniyle, C. elegans geliştirme ve rejenerasyon sırasında nöronal remodeling çalışmak için mükemmel bir model sistemi olduğunu kanıtlamıştır vivo. Burada, C. elegans'taki dokunmatik nöronların gelişimi ve yenilenmesi sırasında mikrotübül dinamiklerini ve büyümesini etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz. Genetik olarak kodlanmış EBP-2::GFP kullanarak, PLM nöronunda mikrotübülleri görüntüledik, bu nöronun iki farklı nötroritinde mikrotübüllerin polaritesini belirlememizi sağladı24. Bu yöntem, EBP kuyruklu yıldızlarının farklı hücresel bağlamlardaki mikrotübül dinamiklerinin bir ölçüsü olarak gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin verir, örneğin aksotomi sonrası akson yenilenmesini başlatan mikrotübül davranışındaki lokal değişiklikler protokolümüz kullanılarak değerlendirilebilir. Bu test, çeşitli hücre tiplerinde ve genetik geçmişlerde çeşitli hücresel süreçlerde mikrotübül dinamiklerinin düzenlenmesini araştırmak için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>CZ18975 solucan suşu</td><td>Yishi Jin lab</td><td>CZ18975</td><td>Anindya Ghosh-Roy</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>tarafından üretilmiştir Montaj solucanları</td></tr><tr><td>Lamel (18 mm x 18 mm)</td><td>Zeiss</td><td>474030-9010-000</td><td>Montaj solucanları</td></tr><tr><td>Isıtma bloklu kuru banyo</td><td>Neolab</td><td></td><td>Montaj</td></tr><tr><td>solucanları Cam kaydıraklar (35 mm x 25 mm)</td><td>Mavi Yıldız</td><td></td><td>Montaj solucanları</td></tr><tr><td>Polistiren boncuk çözeltisi (minimum yüzey aktif madde içeren sulu ortamda 4.55 x 10^13 partikül / ml)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876</td><td>Montaj solucanları</td></tr><tr><td>Test tüpleri</td><td>Montaj solucanları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 bakteri suşu</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td><td>OP50</td><td>Solucan işleme</td></tr><tr><td>60mm petri plakaları</td><td>Praveen Scientific</td><td>20440</td><td>Solucan işleme</td></tr><tr><td>Aspiratörü/Kılcal</td><td>VWR</td><td>53432-921</td><td>Solucan işleme</td></tr><tr><td>İnkübatörü</td><td>Panasonic</td><td>MIR554E</td><td>Solucan işleme</td></tr><tr><td>Platin tel</td><td></td><td></td><td>Solucan işleme</td></tr><tr><td>Floresan eki ile Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td>Solucan işleme</td></tr><tr><td>%0.3 Sodyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>Nematod Büyüme Ortamı</td></tr><tr><td>%0.25 Pepton</td><td>TM Ortamı</td><td>1506</td><td>Nematod Büyüme Ortamı</td></tr><tr><td>10mg/mL Kolesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Nematod Büyüme Ortamı</td></tr><tr><td>1mM Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td>Nematod Büyüme Ortamı</td></tr><tr><td>1mM Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>Nematod Büyüme Ortamı</td></tr><tr><td>%2 Agar</td><td>TM Ortamı</td><td>1202</td><td>Nematod Büyüme Ortamı</td></tr><tr><td>25mM Monobazik Potasyum dihidrojen fosfat</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>Nematod Büyüme Ortamı</td></tr><tr><td>0.1M Monobazik Potasyum dihidrojen fosfat</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>1X M9 tampon</td></tr><tr><td>0.04M Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>1X M9 tampon</td></tr><tr><td>0.1M Amonyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>21405</td><td>1X M9 tampon</td></tr><tr><td>0.2M Dibazik Disodyum hidrojen fosfat heptahidrat</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>1X M9 tampon</td></tr><tr><td>Cam şişeler</td><td>Borosil</td><td></td><td>Tampon depolama</td></tr><tr><td>488 nm lazer</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>5X objektif</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>63X objektif</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>Kamerası</td><td>Fotometri</td><td>Evolve 512 Delta</td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>Eğirme Diski ünitesi için bilgisayar sistemi</td><td>HP</td><td>Intel &reg; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>Epifloresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Observer.Z1</td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>Halojen lamba</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>Cıva Ark Lambası</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>Dönen Disk Ünitesi</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>ZEN2 yazılımı</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>Görüntüsü J (Fiji Sürüm)</td><td></td><td></td><td>Görüntü analizi ve işleme</td></tr><tr><td>: Adobe Creative Cloud</td><td>, Adobe</td><td></td><td>Görüntü analizi ve işleme</td></tr><tr>:<td>Görüntü Analizi için bilgisayar sistemi</td>, <td>Dell</td><td>, Intel, &reg; Çekirdek ve ticaret; i7-9700 CPU 3.00GHz</td><td>Görüntü işleme/Gösterim</td></tr></tbody></table>

in vivo caenorhabditis elegans nöronlarında mikrotübül dinamiklerinin ve oryantasyonunun değerlendirilmesi

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Nöronlarda, mikrotübül yönelimi, genellikle karışık oryantasyona sahip artı uçlu mikrotübüllere ve dendritlere sahip aksonları tanımlamak için önemli bir değerlendirici olmuştur. Burada, C. elegans'taki dokunmatik nöronların gelişimi ve yenilenmesi sırasında mikrotübül dinamiklerini ve büyümesini etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz. Mikrotübül uçlarının genetik olarak kodlanmış floresan muhabirlerini kullanarak aksonal mikrotübülleri görüntüledik. Aksotomi sonrasında akson rejenerasyonunu başlatan mikrotübül davranışındaki lokal değişiklikler bu protokol kullanılarak ölçülebilir. Bu test, çeşitli hücresel süreçlerde mikrotübül dinamiklerinin düzenlenmesini araştırmak için diğer nöronlara ve genetik geçmişlere uyarlanabilir.

Temsili bir örnek olarak, PLM nöronlarının sabit durumundaki ve yenileyici aksonlarındaki EBP kuyruklu yıldızlarının in vivo gözlemini tanımladık. PLM nöronları, bir sinaps ve kısa bir posterior işlem oluşturan uzun bir ön işlemle solucanın kuyruk bölgesinde bulunur. PLM nöronları epidermisin yakınında ön-arka yönde büyür ve solucanlardaki nazik dokunma hissinin sorumlusudur. Basitleştirilmiş yapıları ve görüntüleme ve mikrocerrahiye karşı alametleri nedeniyle PLM nöronları mikrotübül sitoskeleton29</su...

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Bu prosedürün amacı mikrotübül organizasyonuni ve dinamiklerini değerlendirmektir. Nöronlar, alttaki sitoskeletonları tarafından tutulan farklı aksonal, dendritik ve sinaptik bölmelere sahip polarize hücrelerdir. Mikrotübüller nöronal sitoskeletonun çoğunluğunu oluşturur ve nöronal gelişim ve olgunlaşma sırasındaki önemli olayları dinamikler ve yönelim belirler.Mikrotübüller alfa ve beta tübulin heterodimerlerinden oluşur ve doğası gereği son derece dinamik artı uçlar ve kararlı eksi uçlarla polarize edilir. Artı uçlarda polimerizasyon sırasında, son bağlayıcı proteinlerin çok molekülerli bir kompleksi, geçici olarak protofilamentlerle ilişkilendirir ve tübulin dimerlerinin montajını teşvik eder. Bu teknik, in vivo sinir mikrotübüllerini görselleştirmemize yardımcı olacaktır.Bu tekniği kullanarak, C.elegans nöronunun gelişimi ve yenilenmesi sırasında dinamik mikrotübüllerin yönelimini ve diğer parametrelerini belirleyebilirsiniz. Bu muhabiri genellikle duyusal nörondaki mikrotübül dinamiklerini görselleştirmek için kullanırız. Ancak bu hücrelerdeki dinamik mikrotübülleri görselleştirmek için bu muhabiri kas ve cilt gibi diğer hücre tiplerinde ifade edilebilir.Burada EBP'den GFP'ye

in-vivo-assessment-microtubule-dynamics-orientation-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Doser, R., et al. Nöronal Kalsiyum İşleminin In Vivo Hücre Altı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, transgenik Caenorhabditis elegans suşlarının ventral sinir kordonu nöronlarındaki hücre altı kalsiyum akışının in vivo görüntülemesini göstermektedir. İki farklı kalsiyum indikatörü kullanılır: bir suşta bir sitoplazmik indikatör ve diğerinde bir mitokondriyal indikatör kullanılır. Nöronlar, nöronal sitoplazma ve mitokondri içindeki floresan yoğunluğundaki gerçek zamanlı...

Caenorhabditis elegans Nöronlarında Hücre Altı Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonlar ve hücre içi taşıma çalışma için iyi bir modeldir. Burada, vivo içinde kayıt ve analiz C. elegansaksonlar ve intraflagellar taşıma için bir protokol açıklayın.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Burada, nörogelişme sırasında tek hücreli dinamikleri anlamak için C. elegans embriyoları yaşayan yüksek çözünürlüklü mikroskobik, Hesaplamalı araçlar ve tek hücreli etiketleme kullanarak bir Kombinatoryal yaklaşım sunuyoruz.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Bu yazıda, C. elegans'tadopaminerjik nöron dendrit morfolojislerindeki değişiklikleri tutarlı bir şekilde ölçmek için yedi puanlık bir puanlama sisteminin nasıl kullanılacağını sergiliyoruz. Bu sistem, nörodejeneratif bozuklukların genetik, kimyasal ve yaşa dayalı modellerini kullanan dopaminerjik nörodejenerasyon testlerinin analizleri için tasarlanmıştır.

Caenorhabditis elegans'ta Dopaminerjik Nöron Morfolojik Değişim ve Dejenerasyon Seviyelerinin Ölçülmesi

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Makale, canlı bir nematoda tek nöron çözünürlüğünde endojen etiketli kargoların aksonal taşınmasını görselleştirmek için floresan mikroskobu edinim parametrelerinin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Öğrenin, C. elegans PLM nöronlarında canlı görüntüleme ile mikrotübül dinamiklerini ve yönelimini değerlendirme yöntemini. Bu teknik, nöronal gelişim ve rejenerasyon süreçlerini anlamaya yardımcı olur.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet