Name: Bakteri hücresi içermeyen Lysatein Hızlı, Uygun Fiyatlı ve Karmaşık Olmayan Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Öğrenin, hücre içermeyen gen ifadesi için bakteriyal lizat üretiminin hızlı, uygun maliyetli ve basit yöntemini. Escherichia coli kullanarak yüksek kaliteli lizatlar elde edin ve araştırmalarınızda güvenilir sonuçlar alın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Zachary Sun ve Richard Murray'e (Kaliforniya Teknoloji Enstitüsü) plazmid P_araBAD-gamS'i sağladıkları için ve Kaeko Kamei'ye (Kyoto Teknoloji Enstitüsü) yüksek hızlı bir soğutma santrifüjü sağladıkları için teşekkür ediyor. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve ARO MURI programından hibelerle desteklendi ve kısmen Mükemmel Genç Araştırmacılar, MEXT, Japonya Lider Girişimi tarafından desteklendi.

1. Ortam ve tamponlar hazırlayın.
<ol><li>2xYTPG ortamı hazırlayın.<ol>
<li>62 g 2xYT tozu, 5.99 g potasyum fosfat monobasik, 13.93 g potasyum fosfat dibasik ve deiyonize suyu 2 L'ye karıştırın.</li>
		<li>30 dk14maruz kalma süresi ile sıvı döngüsü üzerinde otoklav.</li>
		<li>1.1.2'den 400 mL 2xYTP ortama 7.2 g D-glikoz (dekstroz) ekleyin ve çözünene kadar karıştırın.</li>
		<li>0,2 μm filtre ile filtre sterilize edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>S30A arabelleği hazırlayın.<ol>
<li>Tris-HCl (pH 7.7, 50 mM son konsantrasyon), potasyum glutamat (60 mM final) ve magnezyum glutamat (14 mM final) karıştırın.</li>
		<li>10 M KOH kullanarak pH'ı 7,7'ye ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çözüm 1'i Hazırlayın (bkz. Tablo 1).<ol>
<li>2 mL suda 4-(2-hidroksyetil)-1- piperazineethanesülonik asit (HEPES) resuspend.</li>
		<li>KOH kullanarak pH'ı 8.0'a ayarlayın.</li>
		<li>Tablo 1'dendiğer tüm bileşenleri ekleyin.</li>
		<li>10 M KOH kullanarak pH'ı 7,6'ya ayarlayın. Filtre sterilize edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2,5x premiks çözeltisi hazırlayın (bkz. Tablo 2).<ol>
<li>Tablo 2'dekitüm bileşenleri karıştırın.</li>
		<li>KOH kullanarak pH'ı 7,5'e ayarlayın.</li>
		<li>Aliquot ve donma -80 °C. NOT: 20 μL reaksiyon 8,9 μL premiks kullanır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Hücreleri hazırlayın.
<ol><li>Otomatik olarak hücreleri aşılayıcı bir döngü kullanarak 50 μg/mL ampisilin içeren LB agar plakalarına dizin ve 37 °C'de büyüyün (bkz. Not 1).</li>
	<li>Bir pipet ucu kullanarak LB/ampisilin ortamının başlangıç kültürüne tek bir koloni seçin ve bir gecede 37 °C'de büyüyün.</li>
	<li>400 μL başlangıç kültürüne sahip 50 μg/mL ampisilin içeren 2xYTPG ortamının 400 mL'lik kısmını aşıla ve 1 L Erlenmeyer şişesinde 37 °C'de büyüyerek 300 rpm'de sallanır.</li>
	<li>1 cm yol uzunluğuna sahip bir optik cuvette okumak için spektrofotometre kullanarak kültürün optik yoğunluğunu periyodik olarak 600 nm (OD600)olarak ölçün. OD600 1'i aştığında, ölçümlerin tipik bir laboratuvar spektrofotometresinin doğrusal aralığında kalmasını sağlamak için ölçümlerden önce kültürü 5 kat seyreltmeye başlayın. 5 kat seyreltilmiş kültür0,3'ün 600'üne ulaşana kadar hücreleri büyütmeye devam edin (1,5'in600'ün bir kültür OD'sine karşılık gelen).</li>
</ol>3. Lisat hazırlayın.
<ol><li>2 mM dithiothreitol (DTT) ile desteklenmiş S30A tampon hazırlayın. 3 mL S30A tamponunu 1 M'de 6 μL DTT stok çözeltisi ile karıştırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1800 × g'da santrifüjleme yaparak hücreleri hasat edin.</li>
	<li>Üstnatantı dökerek ve kalan sıvıyı çıkarmak için bir pipet kullanarak atın.</li>
	<li>Peleti 45 mL soğuk (4-10 °C) S30A tamponunda bir girdap karıştırıcı kullanarak yeniden depolayın.</li>
	<li>Boş bir 50 mL santrifüj tüpü tartın, hücreleri içine aktarın ve hücreleri yıkamak için 3.2-3.3 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Boş bir 50 mL tüpün ağırlığını çıkararak peleni tartın. Pelet ağırlığının doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamak için kalan herhangi bir üst öğeyi dikkatlice aspire ettiğinden emin olun. NOT: Tipik bir verim, 400 mL üretim kültüründen ~1,3 g hücre pelezidir.</li>
	<li>Her 1 g hücre peleti için 2 mM dithiothreitol, yani 2 mL tampon ile desteklenmiş 2 hacim soğuk S30A tampon ekleyin ve güçlü bir şekilde girdap karıştırma ile hücreleri yeniden depolayın.</li>
	<li>Hücreleri dondurun. Hücreleri içeren 50 mL'lik tüpü pelet iyice donana kadar -20 °C veya -80 °C dondurucuya yerleştirin. NOT: Donma adımı gün için iyi bir durma noktasıdır.</li>
	<li>Oda sıcaklığındaki su banyosundaki hücreleri çözün.</li>
	<li>2-3 dakika boyunca güçlü bir şekilde girdap.</li>
	<li>37 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatır ve 300 rpm'de sallan.</li>
	<li>4 °C'de 45 dakika boyunca 30.000 × g'da şeffaf santrifüj tüplerinde santrifüjleme yaparak ağır hücresel döküntü örneğini temizleyin. NOT: 30.000 x g kapasiteli bir santrifüj mevcut değilse, 21.000 × g'da45 dakika santrifüj kullanın ve pelet daha az kompakt olacağından 3.13.</li>
	<li>Peletin mümkün olduğunca rahatsız edilmesine karşı, süpernatant'ı bir pipet ile yeni bir tüpe dikkatlice aktarın. Aktarılan süpernatant peletten elde edilen malzeme ile kirlenmişse, önceki adımı tekrarlayın.</li>
	<li>Süpernatantı 1,5 mL santrifüj tüplerine ve santrifüje bir kez daha 21.000 × g'da (veya masa üstü santrifüjün maksimum hızına) 5 dakika aktarın.</li>
	<li>Temizlenen otolizotu istenen hacimlere aliquot, kalan peletlerden dikkatlice kaçının ve -80 ° C'de dondurun veya hemen kullanın. NOT: Tek bir 20 μL reaksiyon 8 μL otomatik tamamlama kullanır.</li>
</ol>4. Hücresiz gen ekspresyolü
NOT: Otomatik kullanım artık istenen son kullanım için hazırdır. Aşağıda, hücresiz gen ekspresyolü için örnek bir standart protokol verilmiştir.
<ol><li>20 μL reaksiyon için, buz üzerinde karıştırın 8 μL otomatik ve 8.9 μL premiks. Magnezyum glutamat ve PEG 8000 konsantrasyonlarının optimizasyonu ile ilgili protokol bölümünün sonundaki NOT'a bakın.</li>
	<li>DNA (örneğin, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500'ü 8 nM'lik son konsantrasyona), diğer reaktifleri ve suyu 20 μL'ye ekleyin.</li>
	<li>Reaksiyonu 384 kuyulu bir mikro plakaya yerleştirin ve bir plaka okuyucu kullanarak floresan zaman seyrini ve/veya uç noktaları ölçün. Yeşil floresan protein (GFP) için 485 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyu ve 520 nm emisyon dalga boyu kullanın.</li>
</ol>5. Protokol değişiklikleri
NOT: Protokolün aşağıdaki değişiklikleri, diğer uygulamalara hizmet etmesini sağlar.
<ol><li>Doğrusal DNA şablonları kullanarak hücresiz gen ekspresyolü<ol>
<li>Doğrusal DNA'nın eklenmesinden önce reaksiyonun 2.2 μM saflaştırılmış GamS proteini(12'deaçıklandığı gibi ifade edilir ve saflaştırılmıştır) ile desteklenerek bölüm 4'teki adımları uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein bozulmasını içeren hücresiz gen ekspresyasyonu<ol>
<li>Adım 2.1'de, plazmid pACYC-FLAG-dN6-His içeren hücreleri otomatik olarak kullanın (bkz. Malzeme Tablosu). Tüm büyüme ortamlarında ayrıca 34 μg/mL kloramfenikol ekleyin.</li>
		<li>Adım 2.3'te, plazmidden ifadeyi indük etmek için büyüme ortamına 40 μM izopropil β-D-1-tiyogalactopyranoside (IPTG) ekleyin.</li>
		<li>Çeviri inhibitörü olan kloramfenikolün tamamen çıkarılmasını sağlamak için 3.2-3.4 (yıkama) adımlarını iki kez (toplam üç yıkama için) tekrarlayın. İlk iki yıkama için (adım 3.4), S30A tamponu fosfat tamponlu salin (pH 7.4) ile değiştirin.</li>
		<li>Adım 4.2'de, ClpXP'nin yüksek ATP kullanımını telafi etmek için ek 3 mM ATP (sudaki 100 mM ATP stok çözeltisinden eklenen, pH 7.2) ve 4.5 mM magnezyum glutamat (suda 1 M stok çözeltisi kullanılarak) (son konsantrasyonlar) ile takviye ve ek ATP ile magnezyum şelasyonu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LacZ tabanlı okumalar kullanarak hücresiz gen ifadesi (kolorimetrik dahil)<ol>
<li>Adım 2.1'de, LacZ'yi yerel olarak ifade etmeyen hücreleri otomatik olarak kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternatif olarak, lisat doğrudan dondurularak kurutulmuş hücrelerden hazırlayın.<ol>
<li>1.1 ile 3.7 arasında tüm adımları gerçekleştirin.</li>
		<li>8 μL hücre süspansiyonu ile 8,9 μL premiksi karıştırın.</li>
		<li>20 μL'lik son hacme ulaşmak için plazmid DNA (istenirse), diğer özel reaktifler ve su ekleyin.</li>
		<li>Reaksiyonu 384 kuyulu bir mikro plakaya aktarın ve dondurarak kurutun. NOT: Dondurularak kurutulmuş numuneler bir haftaya kadar ve muhtemelen daha uzun süre saklanabilir.</li>
		<li>Reaksiyona başlamak için, istenen DNA veya diğer reaktiflerle desteklenmiş 18 μL deiyonize su ile yeniden sulandırın.</li>
		<li>Bir plaka okuyucusunda floresan dinamiklerini izleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>NOT 1: Otomatik olarak hücreleri dondurma-çözme döngüsü üzerine sulayacak şekilde tasarlanmıştır, bu nedenle donmuş stoklar yaparken kriyoprotektant kullanmak özellikle önemlidir. Stokları % 24 wt / vol gliserolde dondurduk ve -80 ° C'de depoladık.
NOT 2: Magnezyum iyonları ve PEG 8000, lysate performansı için kritik öneme sahiptir. Daha önce yayınlanan verilere dayanan 2,5x baz premiks, son reaksiyonda sırasıyla 2,4 mM ve% 1,9 olan 6 mM magnezyum glutamat ve% 4,8 wt / vol PEG 8000 içerir. Buradaki protokolle hazırlanan otomatikleştirme, tipik olarak son reaksiyonda ek 5 mM Mg-glutamat ve% 1.5 PEG 8000 ile en iyi performansı gösterir. Bununla birlikte, bu ek bir 0-10 mM Mg glutamat ve ek bir% 0-3 PEG 8000 aralığında optimize edilebilir (baz premiks ile karşılaştırıldığında). Premiksi önerilen ek 5 mM Mg-glutamat ve % 1,5 PEG 8000 (son konsantrasyonlar) ile hazırlamak için, 380 μL premiksi 1 M'de 4,75 μL magnezyum glutamat ve % 40 ağırlıkta / hacimde 36,1 μL PEG 8000 ile karıştırın.

<ol><li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+metabolic+engineering%3A+biomanufacturing+beyond+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+without+boundaries%3A+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li>
<li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+applications+in+proteomics+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. 86, 60-72 (2015).</li>
<li>Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+circuit+performance+characterization+and+resource+usage+in+a+cell-free+%22breadboard%22%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard".</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027(2018).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762(2013).</li>
<li>Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+reduce+variability+in+E.+coli-based+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li>
<li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li>
<li>Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cell+on+a+chip+integrated+with+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%222019+IEEE+32nd+International+Conference+on+Micro+Electro+Mechanical+Systems+%28MEMS%29%22%5BJournal%5D)">Artificial cell on a chip integrated with protein degradation.</a> 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).</li>
<li>Garibaldi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+autoclave+protocols+for+successful+decontamination+of+category+A+medical+waste+generated+from+care+of+patients+with+serious+communicable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).</li>
<li>Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li>
<li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).</li>
</ol>

J.H., kanser terapötiklerine odaklanan GenCirq Inc.'in kurucu ortağıdır. Yönetim Kurulu'ndadır ve GenCirq'te özkaynakları vardır.

Burada açıklanan protokol, hücresiz gen ekspresyözü için oldukça aktif bakteriyel lisat verir. Anahtar, lambda faj endolizini sitolizik olarak ifade eden plazmid pAD-LyseR'i taşıyan hücreleri kullanmaktır. Bu hücreler, iç zarın permeabilizasyonu üzerine kendilerini izlendirmek için güçlenir ve endolysin'in hücre duvarına erişmesini sağlar, bu da yöntemin basit bir donma-çözülme döngüsü ile elde ettiği. Hücreler kendilerini etkili bir şekilde uzatır çünkü, ürün otomatik olarak adlandırılır. Hücreler yutulduktan sonra, ger...

Hücresiz lisatlarda gen ekspresyoz, canlı hücreler1, 2,3,4kullanma konusunda çeşitliavantajlarasahiptir. Lysates biyokimyasal olarak kolayca değiştirilebilir ve canlı hücrelerde elde edilmesi zararlı veya imkansız olabilecek koşullarda kullanılabilir. Gen ekspresyon devreleri konak biyolojik süreçlerle uğraşmak veya rekabet etmek zorunda değildir ve yeni genetik devreleri test etmek DNA eklemek kadar basittir. Bu nedenlerden dolayı, hücresiz gen ekspresyözü biyosensörlerden5,6'dan hızlı prototipleme sentetik gen devrelerine 7 ,8'den yapay hücreler geliştirmeye kadar çeşitli uygulamalar bulmuş9. Çoğu hücresiz gen ekspresyasyonu, genellikle uzun ve karmaşık protokoller, özel ekipmanlar ve / veya kullanıcılar ve partiler arasında önemli farklılıklara yol açabilecek hassas adımlar gerektiren, yüksek oranda işlenmiş hücresel lysates kullanır10,11.
Bu makalede, minimum işleme ve uzmanlık gerektiren hücresiz lisat üretmek için basit ve verimli bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1A)12. Yöntem, basit bir donma-çözülme döngüsünü takiben iyse için tasarlanmış E. coli hücrelerine dayanır. Hücreler, hücre duvarını bozan faj lambda'dan bir endolysin ifade eder. Hücreler büyüdükçe, bu endolysin hücre duvarından inzit edilen sitoplazmda kalır. Bununla birlikte, basit bir donma-çözülme döngüsü sitoplazmik zarı bozar, endolizi periplazma bırakır, burada hücre duvarını bozar ve hızlı hücre lizisine neden olur. Protokol sadece birkaç saatlik uygulamalı çalışma ile tamamlanabilir ve sadece bir dondurucu, 30.000 × g kapasiteli bir santrifüj (optimum sonuçlar için; peleti rahatsız etmemek için daha düşük hızlar kullanılabilir), bir girdap karıştırıcısı ve basit bir tampon çözeltisi gerektirir. Fonksiyonel lisat, hücrelerin dondurularak kurutılması ve yerinde yeniden sulandırılmasıyla bile üretilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem, muhtemelen kalan hücre kalıntıları nedeniyle daha düşük aktiviteye sahip lysates üretir.
Lysates hücresiz gen ekspresyonu için oldukça aktiftir ve son kullanıma bağlı olarak çeşitli şekillerde geliştirilebilir. Protein sentezi oranı, standart spin konsantratörleri kullanılarak lizat konsantre edilerek daha da arttırılabilir. Doğrusal DNA, saflaştırılmış GamS proteini eklenerek bozulmaya karşı korunabilir. Salınım gibi daha karmaşık devre dinamikleri için gerekli olan protein bozulması, otolisat üreten gerinim13'tebir ClpX heksamerinin birlikte ifade edilmesiyle elde edilebilir. Son olarak, LacZ tabanlı görsel okumalar, lacZolmayan otomatik olarak bir gerinim kullanılarak etkinleştirilir. Genel olarak, bu yöntem çok çeşitli uygulamalar için uygun olan son derece aktif hücresiz lisat üretir.

<table><tbody><tr><td>2xYT medya</td><td>EMD Millipore</td><td>4.85008</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8877</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 santrifüj filtre ünitesi, isteğe bağlı 3 kDa kesme</td><td>Millipore Sigma UFC900308</td><td></td><td>, lizatı konsantre etmek, konsantre edilecek hacme uygun yoğunlaştırıcı kapasitesini seçmek için kullanılabilir</td></tr><tr><td>ampisilin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>veya karbenisilin, daha kararlı bir varyant</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8937</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9501</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4282</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Amerika Birleşik Devletleri Biosciences</td><td>14121</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>D-glikoz (dekstroz)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1749603</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>E. coli, BL21-Altın (DE3), pAD-LyseR</td>, <td>Addgene</td><td>99244</td><td></td></tr>, <tr><td>E. coli, BL21-Altın (DE3) ve Delta; pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99245</td><td></td></tr><tr><td>Folinik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7878</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>GTP</td> taşıyan <td>lacZ Amerika Birleşik Devletleri Biosciences</td><td>16800</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>LB ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446075</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>magnezyum glutamat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49605-250G</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6522</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>potasyum glutamat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1501-100G</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>potasyum hidroksit (KOH)</td> <td>pH'ı ayarlamak için</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>221473-25G</td></tr><tr><td>dibazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>potasyum fosfat monobazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85558</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>9310500GM</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>tRNA karışımı</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>UTP</td><td>Amerika Birleşik Devletleri Biyobilimleri</td><td>23160</td><td>veya eşdeğeri</td></tr></tbody></table>

bakteri hücresi içermeyen lysate'in hızlı, uygun fiyatlı ve karmaşık olmayan Üretimi

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Hücresiz gen ekspresyasyonu, canlı bir organizmanın komplikasyonları olmadan biyolojinin gücünü sunar. Bu tür birçok gen ekspresyon sistemi olmasına rağmen, çoğu satın almak için oldukça pahalıdır ve / veya etkili bir şekilde üretmek için özel ekipman ve ince honlanmış uzmanlık gerektirir. Bu protokol, sadece standart laboratuvar ekipmanlarını kullanarak ve minimum işlem gerektiren, yüksek düzeyde gen ekspresyonını destekleyen bakteri hücresiz lisat üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, büyümeyi etkilemeyen, ancak basit bir donma-çözülme döngüsünü takiben hasat edilen bir hücre peletini verimli bir şekilde yukan bir endolysin üreten bir Escherichia coli suşu kullanır. Gerekli olan tek işlem, hücresel kalıntıların otomatik olarak temizlenmesi için kısa bir inkübasyon ve ardından santrifüjlemedir. Dinamik gen devreleri, hasattan önce hücrelerdeki ClpX proteazının heterolog ifadesi ile elde edilebilir. LacZ geni olmayan bir E. coli suşu, kolorimetrik veya floresan bir okuma kullanılarak yüksek hassasiyetli, hücresiz biyosens uygulamaları için kullanılabilir. Tüm protokol, aşılamadan tamamlanmaya kadar sadece 1-2 saatlik uygulamalı çalışma ile 8-9 saat kadar az bir süre gerektirir. Hücre içermeyen lisat elde etmek için maliyeti ve zamanı azaltarak, bu yöntem çeşitli uygulamalar için hücresiz gen ekspresyonunun karşılanabilirliğini artırmalıdır.

Temsili sonuçlar, GFP'yi bir konsitütif olarak ifade eden plazmidden ifade etmek için otomatik olarak kullanılarak, burada pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 ve bir plaka okuyucusunda GFP floresanının bir zaman seyrini kaydederek gözlemlenebilir (Şekil 1B). Bir seyreltme serisi plazmid DNA,1 nM DNA'da bile güçlü bir ifade buldu. Ticari olarak mevcut bir lisate ile karşılaştırıldığında, otolisat daha fazla toplam verim üretebilir ve GFP zaman kursunun zaman türevi olarak hesaplanan daha yüksek ...

Bu protokol, Escherichia coli'nin tasarlanmış bir suşunu kullanarak ve sadece standart laboratuvar ekipmanı gerektiren hücresiz gen ekspresyözü için bakteriyel lisat üretmek için hızlı ve basit bir yöntemi açıklar.

Bakteri hücresi içermeyen Lysate'in Hızlı, Uygun Fiyatlı ve Karmaşık Olmayan Üretimi

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Bu protokol kullanılarak, yüksek kaliteli bakteri hücresi lysates sadece yaygın olarak bulunan ortak laboratuvar ekipmanları kullanılarak üretilebilir ve bu da hücresiz gen ekspresyonunu çoğu araştırmacı için kolayca erişilebilir hale getirir. Program hücresel otolizi dondurarak çözme veya dondurarak-kuru döngü ile birleştirmek, hücresiz gen ekspresyasyonu için bakteriyel lizazların hızlı üretimi için pratik, işçilik ve uygun maliyetli bir yaklaşım oluşturulmasını sağlar. Mililitre ampisilin başına 50 mikrogram içeren LB agar plakalarına otoliz E.coli suşunun hücrelerini çizgi etmek için bir aşılama döngüsü kullanarak başlayın, ardından plakaları bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, bir pipet ucu kullanarak, agar plakasından tek bir koloni seçin ve ampisilinli LB ortamı içeren bir kültür tüpüne ekleyin. Bu başlangıç kültürünü bir gecede 37 santigrat derecede büyütün. Ertesi gün, mililitre ampisilin başına 50 mikrogram ile desteklenmiş 400 mililitre 2xYTPG ortamı içeren bir litre Erlenmeyer şişesine 400 mikrolitre marş kültürü ekleyin.Kültürü 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve 300 RPM'de sallantıda. Spektrofotometre ve bir santimetre yol uzunluğuna sahip optik bir cuvette kullanarak, kültürün optik yoğunluğunu periyodik olarak 600 nanometrede ölçün. Optik yoğunluk biri aştığında, ölçümlerin tipik bir laboratuvar spektrofotometresinin doğrusal aralığında kalmasını sağlamak için ölçümlerden önce kültürü beş kat seyreltmeye başlayın.Beş kat seyreltilmiş kültürün optik yoğunluğu 0,3'e ulaştığında, şişeyi inkübatörden çıkarın ve lisatı hazırlamaya devam edin. Lisatı hazırlamak için, hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatant dökün ve kalan sıvıyı bir pipet kullanarak çıkarın.Peletin içine 45 mililitre soğuk S30A tamponu ekleyin ve peletı girdapla yeniden depoleyin. Ardından, hücreleri tüpe aktarmadan önce boş bir 50 mililitre santrifüj tüpü tartın. Hücreleri tekrar santrifüjle ve üstnatantı atın.Kalan herhangi bir süpernatantı pipet kullanarak aspire edin. Tüpü tekrar tartın ve peletin ağırlığını elde etmek için boş tüpün ağırlığını görüntülenen ağırlıktan çıkarın. Her bir miligram hücre peletı için, iki milimoler dithiothreitol ile desteklenmiş iki mikrolitre soğuk S30A tampon ekleyin.Daha sonra, güçlü girdap ile hücreleri yeniden depolar. Daha sonra, hücreleri pelet iyice donana kadar negatif 20 veya negatif 80 santigrat derecelik bir dondurucuya yerleştirerek dondurun, ardından bir oda sıcaklığındaki su banyosundaki ve girdaptaki hücreleri iki ila üç dakika boyunca kuvvetlice çözün. Hücreleri 300 RPM'de sallanarak 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın, ardından 30.000 x g'daki şeffaf santrifüj tüplerinde dört santigrat derecede 45 dakika santrifüj yaparak ağır hücresel döküntü örneğini temizleyin.Peletin rahatsız olmamasına dikkat ederek, süpernatant'ı pipetli yeni bir tüpe dikkatlice aktarın. Aktarılan süpernatant peletten elde edilen malzeme ile kirlenmişse, santrifüjü tekrarlayın. Süpernatantı 1,5 mililitre santrifüj tüplerine aktarın.Ve bir kez daha 21.000 x g'da veya bir masa üstü santrifüjün maksimum hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Temizlenen otomatik olarak istenen birimlere aliquot ve kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Otomatik elağar kullanarak hücresiz gen ekspresyolü için, sekiz mikrolitre otomatik doğrulama ve 8,9 mikrolitre ön karışımı buz üzerinde karıştırın.20 mikrolitrelik son bir hacim elde etmek için sekiz nanomol, diğer gerekli reaktifler ve su son konsantrasyonuna DNA ekleyin. Reaksiyonu 384 kuyulu bir mikro plakaya ekleyin ve floresan zaman seyrini ve uç noktaları ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. Plazma DNA'sının seyreltme serisi ile otomatikleştirmeyi kullanan GFP ifadesi, bir nanomolar DNA ile bile güçlü ifade ile sonuçlanır.Ticari olarak kullanılabilen bir lisat ile otomatikleştirme arasındaki GFP ifadesini karşılaştırdıklarında, otomatikleştirme GFP'nin karşılaştırılabilir düzeylerini üretir. Farklı araştırmacılar tarafından iki farklı laboratuvarda üretilen lysate partileri arasındaki değişkenlik yaklaşık iki kat içindeydi. En kritik üç değişken, hücre peletinin tampon oranına aktarılması, enkazsız süpernatant aktarılması ve son reaksiyonda optimum PEG ve magnezyum konsantrasyonu kullanılmasıdır.Ekstrakt hazırlandıktan sonra, ClpXP aracılı bozulma veya AHL aracılı çekirdek algılama gibi E.coli hücresiz ifade sistemleri için geliştirilen mevcut protokollerden oluşan büyük bir cephanelik kullanılabilir.

rapid-affordable-uncomplicated-production-bacterial-cell-free

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Kaynak: Wiegand, D.J., ve diğerleri. Hızla Büyüyen Bakteri Vibrio natriegens Kullanılarak Hücresiz Protein Ekspresyonu. J. Vis. Uzm. (2019).Bu video, birleştirilmiş in vitro transkripsiyon ve translasyon gerçekleştirmek için Vibrio natriegens ham lizatına dayalı bakteriyel hücresiz bir protein ekspresyon sisteminin kullanımını göstermektedir. Temel bileşenlerle bir ana karışımın hazırlanmasını ve bir DNA şablonundan fonksiyonel proteinlerin adım adım sentezini vurgular.

Bakteriyel Ham Hücre Ekstraktı Kullanılarak Hücresiz Protein Ekspresyonu

Bu iletişim kuralı adımları, maliyetleri ve ekipman E. colioluşturmak için gerekli ayrıntıları-hücre özleri dayalı ve 4 gün içinde veya daha az vitro protein sentez reaksiyonları uygulamak. Bu platformun geniş uygulamalar için esnek yapısı kullanabilmeniz için biz uyarlanmış ve en iyi duruma getirilmiş reaksiyon koşulları tartışıyorlar.

Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

İfade boş hücre sistemleri yüksek üretilen iş sentezi ve önemli protein testi ile taranması için maliyet-etkin ve güçlü araçlardır. Burada, Vibrio natriegens plazmid DNA, doğrusal DNA ve mRNA şablonunu kullanarak hızlı protein üretimi için kullanılan boş hücre proteini ifade sistemin hazırlanması açıklayın.

Boş hücre Protein ifade kullanarak hızla büyüyen bakteri Vibrio natriegens

Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

Standart laboratuvar ekipmanları kullanarak rekombinant PURE hücresiz TX-TL sistemini üretmek için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz.

OnePot PURE Hücresiz Sistem

Çalışma, sentetik gen parçalarından protein tarama kampanyaları için klonlama yapmadan veya canlı hücreler kullanmadan büyük (μg-mg) miktarlarda DNA oluşturmak için bir protokol tanımlamaktadır. Minimal şablon enzimmatik olarak sindirilir ve daireselleştirilir ve daha sonra izotermal yuvarlanan daire amplifikasyonu kullanılarak yükseltilir. Hücresiz ifade reaksiyonları, teşvik edilmemiş ürünle gerçekleştirilebilir.

Hücresiz Sistemler Kullanarak Protein Prototipleme için Minimal, Doğrusal Şablonların Amplifikasyonu için Hızlı, Enzymatik Yöntemler

Bu çalışma, Escherichia coli'den (E. coli ) hücre ekstraktının hazırlanmasını ve ardından 24 saatten kısa sürede hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını açıklamaktadır. Hücresiz otoindüksiyon (CFAI) protokolünün açıklaması, araştırmacı gözetimini azaltmak ve elde edilen hücre ekstraktı miktarlarını artırmak için yapılan iyileştirmeleri detaylandırmaktadır.

Hücresiz Otomatik İndüksiyon İş Akışını Kullanarak 24 Saat İçinde Hücrelerden Hücresiz Protein Sentezine

Leishmania Translasyonel Ekstrakt (LTE), tek hücreli parazit Leishmania tarentolae'den türetilen ökaryotik hücresiz bir protein ekspresyon sistemidir. Bu optimize edilmiş protokol, LTE'nin üretimini basit ve uygun maliyetli hale getirir. Karmaşık ökaryotik proteinlerin ve bunların etkileşimlerinin çok paralel ekspresyonu ve çalışmasına odaklanan çeşitli uygulamalar için uygundur.

Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTE'nin Üretimi ve Optimizasyonu

Bu protokol, sentetik hücrelerin yapımında kullanılan Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini tanımlar. Farklı mikro bölmelerde temsili sonuçlarla temel aşamaları ana hatlarıyla belirtir. Protokol, sentetik hücre topluluğundaki çeşitli laboratuvarlar için en iyi uygulamaları oluşturmayı ve sentetik hücre gelişiminde ilerlemeyi ilerletmeyi amaçlamaktadır.

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

OnePot 'Rekombinant Elementler Kullanarak Protein Sentezi' (PURE) sisteminin ve hücresiz protein sentezi için ham ribozomların üretimi için güncellenmiş bir protokol sunuyoruz ve partiden partiye varyasyonları en aza indirmek için hücre büyümesini kontrol etmeye odaklanıyoruz.

Tekrarlanabilir Hücresiz Protein Sentezi için OnePot PURE ve Ham Ribozom Üretiminin İyileştirilmesi

Öğrenin, hücre içermeyen gen ifadesi için bakteriyal lizat üretiminin hızlı, uygun maliyetli ve basit yöntemini. Escherichia coli kullanarak yüksek kaliteli lizatlar elde edin ve araştırmalarınızda güvenilir sonuçlar alın.

Bakteri hücresi içermeyen Lysate'in Hızlı, Uygun Fiyatlı ve Karmaşık Olmayan Üretimi

Daha fazla video keşfet