Ex Vivo Elektroretinogramın Küçük ve Büyük Gözlerde Retina Fonksiyonunu İncelemesi için Kurulum ve Koşulların Optimize Edilmesi
27 Haziran 2022
Mevcut multielektrot dizisinin veya yama kelepçesi ekipmanının modifikasyonu, ex vivo elektroretinogramı daha yaygın olarak erişilebilir hale getirir. Exvivo ışık yanıtlarını kaydetmek ve sürdürmek için geliştirilmiş yöntemler, sağlıklı retinada, göz hastalıklarının hayvan modellerinde ve insan donör retinalarında fotoreseptör ve ON-bipolar hücre fonksiyonunun incelenmesini kolaylaştırır.
Bu protokol, ex vivo ERG'de retina fonksiyonunu korumak için gereken koşulları, özellikle de ON-bipolar hücreler tarafından üretilen son derece hassas B dalgasını göstermektedir. Ex vivo ERG ile, farmakolojik ajanların kolayca tanıtılmasına izin verirken, yüksek sinyal-gürültü oranına sahip farklı retinal nöron tiplerinin işlevini ölçebiliriz. Bu yöntem özellikle farmakolojik ajanların retina fonksiyonu ve hastalığı üzerindeki etkinliğini ölçmek için uygundur.
Başlamak için, ex vivo ERG numune tutucuyu bir başlık aracılığıyla bir diferansiyel amplifikatöre bağlayarak çok elektrotlu bir dizi kurulumunu dönüştürün. Amplifikatör, çoklu elektrot dizi sisteminin arayüz kartının analog girişine takılmalıdır. ex vivo ERG'den giriş verilerini kaydetmek ve depolamak için çoklu elektrot dizisinin kayıt yazılımını kullanın.
Diferansiyel amplifikatörün kazancını 100'e ayarlayın ve sayısallaştırıcı özelliklerine bağlı olarak ek bir 10X voltaj amplifikasyonu ekleyin. Düşük geçiş filtresini 100 hertz olarak ayarlayın. Alternatif olarak, bir yama kelepçesi kurulumunu dönüştürmek için, ex vivo ERG numune tutucuyu bir far aracılığıyla yama kelepçesi amplifikatörünün baş kısmına bağlanması gereken bir diferansiyel amplifikatöre bağlayın.
ex vivo ERG'den giriş verilerini kaydetmek ve depolamak için yama kelepçe sistemi yazılımını ve sayısallaştırıcıyı kullanın. Parametreleri daha önce gösterildiği gibi ayarlayın. Uygun dalga boylarına sahip LED'leri mikroskopa bağlayın.
Işık uyaranlarını kontrol etmek için, bir sayısallaştırıcıdan analog çıkışlarla kontrol edilen bir LED sürücü kullanın. LED'leri, ışık uyaranlarının tetiklenmesini sağlayacak kayıt yazılımı ile kontrol edin. Ardından, LED'lerin ışık çıkışını bir fotodiyot kullanarak numune tutucudaki retina konumunda kalibre edin.
Gerekirse, ışık yolundaki ışık yoğunluğunu kısmak için nötr yoğunluk filtreleri takın. Elektrodu hazırlamak için, dişli bir yem konektörüne gümüş gümüş klorür pelet elektrodu yerleştirin. Yem konektörünün içini sıcak tutkalla doldurun ve dişli olmayan taraftan sıcak tutkalın içine iki milimetrelik bir soket takın.
EP-1 elektrodunun gümüş telini iki milimetrelik sokete lehimleyin. Bitmiş elektrotu diş üzerinde bir O-ring ile ex vivo ERG numune tutucunun elektrot portlarına vidalayın. İnsan donör gözleri de dahil olmak üzere büyük gözler için, kalan bağ dokusunun küresini temizleyin ve ön segmenti ve lensi çıkarın.
Limbustan yaklaşık üç milimetre kesim yapmak için bir neşter kullanın. Kavisli diseksiyon makasını kesiye yerleştirin ve gözün ön kısmını lensle çıkarmak için limbüs boyunca kesin. Üç ila altı milimetre tek kullanımlık biyopsi punch ile ex vivo elektroretinografi için retinal örnekler alın.
Dokuyu numune tutucuya monte etmek için, numune tutucunun alt yarısını büyük bir Petri kabına yerleştirin ve numune tutucunun kubbesi sadece suya batırılacak şekilde oksijenli Ames'medium ile doldurun. Retinanın kenarını ince forsepslerle dikkatlice kavrayın ve retinayı ex vivo numune tutucunun kubbesi, fotoreseptör tarafı yukarı bakacak şekilde aktarın. Retinanın yerinde kalmasına dikkat ederek numune tutucuyu Ames çözeltisinden kaldırın.
Gürültüyü, elektriksel çapraz konuşmayı ve sinyal şöntünü en aza indirmek için numune tutucunun plakasını tamamen kurulayın. Daha sonra numune tutucunun her iki yarısını dört vidayla birleştirin ve perfüzyon hattını bağlayın. Elektrodu numune tutucunun alt yarısında sürün ve anot kablosunu iç retinal tarafa ve katot kablosunu fotoreseptör tarafına bağlayın.
Işık tepkilerinin stabilize olmasına izin vermek için numune tutucuyu dakikada en az bir mililitre oksijenli Ames'medium ile 10 ila 20 dakika boyunca perfüze edin. Ex vivo ERG, fare retinasından fotoreseptör ve ON-bipolar hücre ışığı tepkilerinin kaydedilmesini sağladı. İnsan donör retinalarından fotoreseptör yanıtlarının kaydedilmesi, enükleasyonun beş saate kadar postmortem gecikmesi ve ON-bipolar hücre yanıtları için 20 dakikadan az gecikme ile mümkün olmuştur.
İdeal koşullar altında, her iki hücre tipindeki yanıt genlikleri ve kinetiği zamanla nispeten kararlıydı, ancak retinalar numune tutucuya monte edildikten 40 ila 45 dakika sonra yavaş bir düşüş gösterdi. Numune tutucudaki düşük sıcaklık, hem foto reseptörlerin hem de ON-bipolar hücrelerin kinetiğini büyük ölçüde yavaşlattı. Bununla birlikte, B dalgasının genliğini azalttı, ancak A dalgasının değil.
Tersine, perfüzyon hızını yavaşlatmak hem foto reseptörün hem de ON-bipolar hücre yanıtlarının genliklerini azalttı, ancak A veya B dalgasının örtük zamanını etkilemedi. Perfüzyonun 10 dakika boyunca kesilmesi ve ardından reperfüzyon, korunmuş fotoreseptör yanıtları ile ON-bipolar hücre fonksiyonunun tamamen kaybedilmesine neden oldu. Yeterli perfüzyon hızı ve fizyolojik sıcaklık, özellikle ex vivo ERG'deki ON-bipolar hücrelerden stabil yanıtlar elde etmek için kritik öneme sahiptir.
Bu protokol, insan makula ve periferisindeki fotoreseptör fonksiyonundaki farklılıkların derinlemesine araştırılmasına izin verir ve daha önce sadece insan olmayan primatlarda gerçekleştirilebilecek soruları yanıtlar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, retina nöron fonksiyonunu incelemek için ex vivo elektroretinogram (ERG) kayıt yöntemlerini geliştiren bir protokol sunar. Yaklaşım, çeşitli kurulumlar kullanarak ON-bipolar hücrelere ve fotoreseptör işlevselliğine odaklanır ve sağlıklı ve hastalıklı durumlarda retina üzerindeki farmakolojik etkiler hakkında bilgiler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Elektrofizyoloji
- Sinirbilim
- Retina biyolojisi
Arka Plan
- Ex vivo ortamlarda retina fonksiyonunu etkili bir şekilde kaydetme zorlukları.
- ON-bipolar hücrelerin ve fotoreseptörlerin retina sağlığı ve hastalığında önemi.
- Farmakolojik müdahaleleri ölçmek için güvenilir yöntemlere duyulan ihtiyaç.
- Mevcut tekniklerin sıklıkla erişilebilirlik ve hassasiyet eksikliği.
Çalışmanın Amacı
- Modifiye edilmiş ekipman kullanarak retina ışık tepkilerinin kaydını iyileştirmek.
- Fotoreseptör ve ON-bipolar hücre işlevselliklerinin analizini kolaylaştırmak.
- Retina hücrelerinde farmakolojik tepkileri değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Protokol, multi-elektrot dizileri veya patch clamp sistemleri kullanarak ex vivo ERG kullanır.
- Biyolojik modeller olarak fare retina ve insan donör retinaları kullanılır.
- Her kurulum, doğru kayıtlar sağlamak için amplifikasyon ve filtreleme için kritik parametreleri içerir.
- Deney sırasında sıcaklık ve perfüzyon oranlarının korunmasının önemi vurgulanır.
- Kontrollü stimülasyon için fotodiyotlar kullanılarak ışık çıkışlarının kalibasyonu kritik öneme sahiptir.
Ana Sonuçlar
- Gelişmiş yöntemler, hem fotoreseptörlerden hem de ON-bipolar hücrelerden stabil kayıtlara izin verir.
- Tepkiler tutarlı kalır, uzun montaj sürelerinden sonra hafif düşüşler gözlenir.
- Sıcaklık ve perfüzyon hızı, tepkilerin genliğini, özellikle B dalgasını önemli ölçüde etkiler.
- Bulgular, insan retina bölgelerinde fotoreseptör işlevinde farklılıkları açıklar.
Sonuçlar
- Bu çalışma, retina nöron fonksiyonlarını keşfetmek için güvenilir bir yöntem gösterir.
- Gelişmiş erişilebilirlik, retina sağlığı ile ilgili ileri farmakolojik çalışmalara olanak tanır.
- Bulgular, nöronal mekanizmaların ve retina hastalıkları için potansiyel müdahalelerin anlaşılmasını artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Optimizing ex vivo ERG conditions enables stable, high-fidelity recording of retinal neuronal responses, particularly from ON-bipolar cells and photoreceptors, supporting mechanistic de-risking in retinal target validation. The method allows quantitative assessment of pharmacological interventions in isolated tissue, reducing systemic variability and improving predictive confidence in preclinical models. This positions the technique as a translational bridge for evaluating retinal therapeutics across species, including human donor tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of retinal neuronal cell-type-specific contributions to light responses, supporting target hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates pharmacological agent introduction to quantify efficacy on retinal function, improving target de-risking.
- Predictive Value: Stabilized ON-bipolar cell B-wave recordings allow assessment of compound effects over time, supporting lead identification and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Optimized perfusion speed and physiological temperature maximize response amplitude and stability, enabling reliable compound screening.
- Quantitative Output: Provides high signal-to-noise measurements of photoreceptor and ON-bipolar cell responses, supporting dose-response and kinetic analyses.
- Scalability: Adaptable to retina samples from small and large eyes, including human donor tissue, supporting cross-species assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables comparison of photoreceptor function between human macular and peripheral retina, supporting biomarker alignment.
- Disease-Relevant System: Maintains retinal function ex vivo for up to five hours postmortem, allowing evaluation of pathological changes and therapeutic interventions.
- Mechanistic De-risking: Isolates tissue-intrinsic retinal responses, minimizing confounding systemic influences in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The optimized ex vivo ERG method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, supporting data-driven go/no-go decisions in retinal therapeutic development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of retinal neuronal mechanisms and pathway-specific contributions to visual function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative light response readouts enabling reliable compound evaluation in retinal assays.
- Analytics: Generates kinetic and amplitude data (A and B waves) that allow comparison of treatment effects across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects findings from model systems to human donor retina, supporting preclinical-to-clinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for retinal functional assessment across discovery and preclinical teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on retinal cell-type-specific responses, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardized perfusion and temperature controls improve reproducibility and reduce variability in retinal function measurements.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by improving predictive confidence in retinal target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by de-risking mechanistic uncertainty in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal tissue dissection, electrophysiology, and pharmacological agent handling.
- Dependent on specialized equipment including differential amplifiers, LED drivers, photodiodes, and perfusion systems.
- Necessitates standardized protocols for tissue mounting, perfusion speed (at least 1 mL/min), and physiological temperature maintenance.
- Adaptation across model systems requires optimization of biopsy punch size and dissection techniques for varying eye dimensions.
- Practical limitations include gradual decline in response stability after 40–45 minutes post-mounting, necessitating timely experimental execution.
