Name: Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Öğrenin, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örneklerin manuel blot ve dalma dondurması yöntemini. Bu maliyet etkin teknik, yüksek kaliteli örnek hazırlama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Herzik laboratuvar üyelerine bu makale ve video içeriği hakkında eleştirel düşünmeleri ve geri bildirimde bulunmaları için teşekkür ederiz. M.A.H.Jr. NIH R35 GM138206 ve Searle Scholar tarafından desteklenmektedir. H.P.M.N Moleküler Biyofizik Eğitim Hibesi (NIH T32 GM008326) tarafından desteklenmektedir. Ayrıca Scripps Araştırma Enstitüsü'ndeki Bill Anderson, Charles Bowman ve Dr. Gabriel Lander'a videoda gösterilen manuel pistonun tasarlanması, montajı ve testine yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.

Açıklayacak bir şeyimiz yok.

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu, başarılı yapı tespiti için kritik öneme sahip bir adım olmaya devam etmektedir. Bu protokolde açıklanan manuel blot-and-plunge yöntemi, cryoEM görüntüleme için ince vitreus buz filmlerindeki biyolojik örneklerin hızlı bir şekilde dondurulması için uygun maliyetli, güvenilir ve sağlam bir yöntemi temsil eder. Araştırmacılar, el yazmasında belirtilen yöntemleri kullanarak manuel pistonu bir araya getirip çalış...

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM), dinamik biyolojik örneklerin yapılarını atoma yakın çözünürlüğe çözmek için kullanılabilecek güçlü bir yapısal tekniktir1,2,3,4. Nitekim, doğrudan elektron dedektörü teknolojilerindeki son gelişmeler4,5,6,7,8,9,10, elektron kaynaklarında iyileşmeler4,11,12,13,14 ve elektromanyetik lens stabilitesi15, veri toplamanın sürekli gelişimi ile birleştiğinde 16,17 ve analiz yazılım paketleri18,19, araştırmacıların artık 3 şçözünürlüğe veya daha iyi 4,11,13,14,20,21,22,23'e iyi huylu örneklerin yapılarını rutin olarak belirlemelerini sağladı . Bu gelişmiş görüntüleme ve veri işleme yeteneklerine rağmen, cryoEM ızgara hazırlığı başarılı yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için en büyük engel olmaya devam ediyor ve genellikle EM iş akışında önemli bir darboğaz görevi görüyor24,25,26,27.
CryoEM, biyolojik örneklerin, yerel biyokimyasal durumu koruyan "cam benzeri" buzun ince bir filmini oluşturmak için dondurulan sulu çözeltilerde görüntülenmesine dayanır - vitrifikasyon olarak bilinen bir süreç. CryoEM için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu 40 yıl öncesine dayanıyor28,29,30 ve bu işlem için geliştirilen birçok teknik ve ekipman başlangıçta ayrıntılı blot ve dalma yöntemine güveniyor31,32,33,34,35 , örneğin, 1-5 μL) küçük bir numune hacminin, ızgaranın şişirme kağıdı ile fiziksel etkileşimi kullanılarak fazla çözelti çıkarılmadan önce özel bir EM ızgarasına uygulandığı yer. Bu işlemin zamanlaması genellikle her numune için ampirik olarak belirlenir, çünkü donma örneklerinin kritik bir bileşeni vitreus buz filminin kalınlığıdır - buz çok kalınsa, çok ince olan buz protein yönelimlerini kısıtlayabilir ve / veya parçacıkları ızgara folyo deliklerinin merkezinden dışlayabilirken elektron ışınının daha fazla saçılması nedeniyle görüntüleme kalitesi önemli ölçüde bozulur36 . Tek parçacıklı cryoEM için mükemmel buz kalınlığına olan bu güven, robotik37,38, mikroakışkanlar42 ve ultrasonik veya püskürtme cihazları27,39,40,41,42,43,44 dahil olmak üzere örnekleri dondurabilen çok çeşitli teknik ve ekipmanlara yol açmıştır. . Son yıllarda, en popüler numune hazırlama cihazlarından bazıları, blot ve dalma tekniğini kullanarak numunelerin otomatik olarak dondurulması için robotik kullanımına güveniyor45. Bu cihazlar görüntüleme için uygun buz kalınlığını yeniden oluşturmak üzere tasarlanmış olsa da, genellikle bireysel laboratuvarların satın alması ve çalışması için çok pahalı kalır ve genellikle kullanım için saatlik fiyatlarla cryoEM tesislerinde bulunur. Son yıllarda, orijinal manuel blot-and-plunge tekniği artmış kullanıma geri döndü3,47,48,49,50,51,52. Gerçekten de, elle çalıştırılan bir blot-and-plunge cihazı, robotik meslektaşlarının maliyetinin çok altında yüksek kaliteli cryoEM ızgaraları elde edebilir. Ayrıca, manuel şişkinlik, araştırmacılar her bir örnek ve araştırma sorusuna göre şişkinlik türünü (örneğin, ızgaranın geri blottingi, ızgaranın ön blottingi vb.) ve blotting süresini ayarlayabildiğinden, daha fazla kullanıcıya şişkinlik üzerinde kontrol sağlar.
Bu makalede, özel tasarlanmış bir dewar platformu53 ile birlikte geleneksel bir manuel blot ve dalma vitrifikasyon cihazı kullanarak biyolojik örneklerin etkili bir şekilde nasıl dondurulacağı hakkında ayrıntılı bilgi veriyoruz. Kriyojenin hazırlanması, ızgara işleme, örnek uygulama ve şişkinlik dahil olmak üzere en iyi uygulamaların yanı sıra bu engellerin nasıl aşılacağına dair yaygın tuzaklar ve öneriler sağlanmaktadır. Izgara preparatları arasında buz kalınlığı tekrarlanabilirliğinin nasıl artırılacağı ve numune şişkinliğinin biyolojik numune tipine göre nasıl değiştirilerek değiştirilmeleri konusunda tavsiyeler tartışılmıştır. Bu yazıda açıklanan manuel pistonun satın alınması ve işletilmesiyle ilgili düşük maliyet göz önüne alındığında, dünyanın dört bir yanındaki laboratuvarlar cryoEM için biyolojik örnekleri uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir şekilde hazırlayabilir.

<table><tbody><tr><td>4 yuvalı ızgara saklama kutusu</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>14 gauge düz metal dağıtım ucu</td><td>Amazon</td><td>B07M7YWWLT</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm kare cam lamel</td><td>Sigma</td><td>C9802-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Izgaraları saklamak için 60 mm cam Petri kabı</td><td>Fisher</td><td>08-747A</td><td></td></tr><tr><td>Whatman kağıdını saklamak için 100 mm cam Petri kabı</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>Whatman kağıdını saklamak için 150 mm cam Petri kabı</td><td>Fisher</td><td>08-747F</td><td></td></tr><tr><td>250 mL beher</td><td>Fisher</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>Mavi strafor dewar</td><td>Spear Lab</td><td>FD-500</td><td></td></tr><tr><td>Pirinç etan kabı</td><td>Lasco</td><td>17-4075</td><td></td></tr><tr><td>Sıkıştırma cımbızı</td><td>Ted Pella</td><td>38825</td><td></td></tr><tr><td>Hassas görev mendilleri</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Kontrol vanalı çift kademeli regülatör</td><td>Airgas</td><td>Y12N245D580-AG</td><td></td></tr><tr><td>Kanalizasyon şebekesi tabanı</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etan platformu</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etan propan tankı</td><td>Praxair</td><td>ET PR50ZU-G</td><td>etan (%50): yüksek basınçlı tankta propan (%50)</td></tr><tr><td>Etan tankı</td><td>Praxair</td><td>UN1035</td><td>etan (%100)</td></tr><tr><td>Esnek kol görev lambası</td><td>Amscope</td><td>LED-11CR</td><td></td></tr><tr><td>Izgaralar (UltrAufoil R 1.2 / 1.3 300 mesh)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>Q325AR1.3</td><td></td></tr><tr><td>Nemlendirici</td><td>Hedef</td><td>719438</td><td></td></tr><tr><td>Higrometre</td><td>ThermoPro</td><td>B01H1R0K68</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar önlüğü</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Nitrojen dewar</td><td>Worthington</td><td>LD4</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Nitrojen eldivenleri</td><td>Fisher</td><td>19-059-925</td><td></td></tr><tr><td>Manuel piston standı (siyah stand + ayak pedalı)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mark 5 (dalma platformu)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitril eldivenler</td><td>VWR</td><td>82026-424</td><td></td></tr><tr><td>P20 pipet</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-029</td><td></td></tr><tr><td>PCR tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>E0030124286</tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>ibis scientific</td><td>63300005</td><td></td></tr><tr><td>Halka lamba</td><td>Amazon</td><td>B07HMR4H8G</td><td></td></tr><tr><td>Güvenlik gözlükleri</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Amazon</td><td>Fiskars 01-004761J</td><td></td></tr><tr><td>Tornavida</td><td>Ironside</td><td>354711</td><td></td></tr><tr><td>Bant</td><td>Fisher</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Izgara kutusunu aktarmak için cımbız</td><td>Amazon</td><td>LTS-3</td><td></td></tr><tr><td>Tygon boru</td><td>Fisher</td><td>14-171-130</td><td></td></tr><tr><td>Whatman kurutma kağıdı</td><td>Fisher</td><td>1001-090</td><td></td></tr></tbody></table>

tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik Örneklerin manuel blot ve dalma dondurması

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için elektronlu biyolojik örneklerin görüntülenmesi, ilgi çekici biyomolekülleri içeren ince bir vitreus buz tabakası gerektirir. Son yıllarda tek parçacıklı cryoEM'i yapısal biyolojinin ön saflarına taşıyan çok sayıda teknolojik ilerlemeye rağmen, numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için vitrifiye edildiği yöntemler genellikle hız sınırlayıcı adım olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda çok sayıda çaba, yeni örnek desteklerinin geliştirilmesi ve yenilikçi vitrifikasyon enstrümantasyonu da dahil olmak üzere numune vitrifikasyonu sırasında sıkça karşılaşılan engellerin üstesinden gelmek için araçlar sağlasa da, geleneksel manuel olarak işletilen piston, düşük satın alma maliyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle cryoEM topluluğunda temel bir unsur olmaya devam etmektedir. Burada, tek parçacıklı cryoEM ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu için standart, giyotin tarzı elle çalıştırılan blot ve dalma cihazını kullanmak için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Ayrıca, standart bir preparat uygun bir numune veremediğinde sık karşılaşılan sorunlar ve sorun giderme önerileri de açıklanmıştır.

Burada açıklanan blot ve dalma protokolünün başarılı bir şekilde yürütülmesi, elektron mikroskobu altında gözlemlenebilen altıgen buz, kirleticiler ve kullanılamaz buzun büyük gradyanlarından arınmış ince, düzgün bir vitreus buz tabakası ile sonuçlanacaktır (Şekil 3). Şişkinlik kağıdının ızgara yüzeyi ile tutarsız teması, şişkin kağıdın zamanından önce çıkarılması veya ızgara teması sırasında şişkin kağıdın hareket ettirilerek vitreus buzun kalitesi düşebilir ve EM ızgarası boyunca tutarsız ...

Bu makale, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örnekleri manuel olarak dondurmak için leke ve dalma yöntemini özetlemektedir.

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Burada açıklanan manuel dalma yöntemi, numuneleri iletim elektron mikroskopisi için hazırlamak için uygun maliyetli, güvenilir bir yöntemdir. Bu videoda, manuel pistonun nasıl kurulacağını, kriyojenin nasıl hazırlanacağını ve EM ızgaralarının manuel olarak nasıl şişirilmiş ve dalma yapılacağını göstereceğiz. Manuel Dalma Ortamını hazırlayın.Bu prosedür, %95'ten büyük nem oranına sahip 40 santigrat derecede tutulan soğuk bir odada yapılmalıdır Burada gösterilen ve manuel şişkinlik ve dalma için çevrimiçi protokolde açıklandığı gibi malzemeleri kullanmanızı öneririz. Kriyojen Dewar ve Manuel Pistonu hazırlayın. Kriyojen Dewar'ı monte etmek için, önce platform tabanını mavi strafor Dewar'ın altına monte edin ve düz ve düz olmasını sağlayın.Daha sonra etan kap tutucuyu platform tabanının üzerine yerleştirin ve pirinç etan kabını yerleştirin. Son olarak, dönen ızgara depolama platformunu oturtun. Ardından, dalgıç Dewar'ı manuel pistonun tabanına bulun.Etan kabını dalma kolunun altına ortalayın ve dalgıç Dewar'ı üsse sabitleyin. Manuel dalma yüksekliğini ayarlamak için, önce dalma kolunun tabanına taze bant takın. Ardından, bandı dalma koluna ve cımbız tabanına güvenli bir şekilde sararak bir çift sıkma cımbızı bağlayın.Cımbızın hafifçe dokunarak sıkıca takıldığından emin olun. Dalma kolunu tutun ve ayak pedalını bastırarak cımbızı yavaşça pirinç etan kabına 2007'den fazla haline haline alın. Dalma Dewar'ın konumunu, cımbızın pirinç etan kabının ortasına yermesi için ayarlayın.Cımbız uçları, cımbızın ve manuel pistonun zarar görmesini önlemek için pirinç etan kabının boyutuna veya altına temas etmemelidir. Konum ayarlandıktan sonra manuel dalma kolunu sıfırlayın. Cryogen'i hazırlayın.Kriyojen hazırlığı iyi havalandırılmış bir odada yapılmalı ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir. Başlamak için, zayıf sıvı nitrojen doğrudan dalma Dewar içine, sıvı nitrojen seviyesi pirinç etan kabının tepesine ulaştığında durur. Sistem, sıvı nitrojen şiddetli bir şekilde köpürmeyi durdurduktan sonra devam edecek kadar soğuk olmalıdır.Bu yaklaşık beş dakika sürecektir. Etan sıkıştırılmış gaz olarak gelir ve yoğunlaştırılması gerekir. Optimum etan yoğunlaşma için gaz akışını ayarlamak için, etan gazı hattının ucunu 250 millik bir su kabına yerleştirin ve köpürmeyi gözlemleyin.Gaz akışı, su yüzeyini şiddetli bir şekilde bozmayan sabit bir kabarcık akışı üretmelidir. Etan yoğuşmaya başlamak için, etan gazı hattının ucunu pirinç etan kabının altına yerleştirin. Metal ucu yavaşça karıştırın ve etanları sıvılaştırmaya başlayın.Etan soğumaya başlar başlamaz, duyulabilir bir ses çıkarır. Pirinç etan kabını sıvı etan dolu dörtte üçüne doldurun. Dalgıç Dewar'ı sıvı nitrojenle kaplayın, pirinç etan kabına dokunmasını ancak içine dökülmemesini sağlayın.Sıvı nitrojenin eklenmesi, tek tip etan dondurma için gereklidir. Köpük kapağı mavi dalgıç Dewar üzerine yerleştirin ve etan tamamen katılaşmak için izin verin. Etan gazı akışını yeniden başlatın ve gaz hattının ucunu dikkatlice katı etan içine yerleştirin.Ucun kabın içine dikey olarak yerleştirilmesi ve tabana etan dağıtılması önemlidir. Etanları eritmek ve sıvı etan seviyesini kabın tepesine çıkarmak için metal ucu yavaşça karıştırın. Kapağı yaklaşık bir dakika kapatın ve etan, iki ila üç milimetre katı etan görünene kadar pirinç kabın kenarlarının etrafında katılaşmaya izin verin.Etan şimdi biyolojik numuneleri dondurmak için ideal bir sıcaklıkta. Dalma Dewar'ı manuel pistonun tabanına dikkatlice takın. Bandı dalma koluna ve cımbız tabanına güvenli bir şekilde sararak bir çift sıkma cımbızı sabitleyin.Dalma kolunu tutun ve ayak pedalını bastırarak cımbızı yavaşça sıvı etan içine dirayaklayın. Dalma Dewar'ın konumunu, cımbızın sıvı etan ortasına yer edinecek şekilde ayarlayın ve katı etan halkasıyla temastan kaçının. Dalgıç Malzemeleri ve Aksesuarları hazırlayın.Her dairesel filtre kağıdını yaklaşık bir santimetre genişliğinde şeritler halinde keserek şişkin kağıdı hazırlayın. Şişkin kağıdın ortasına dokunmaktan kaçının ve daha küçük uç parçalarını atın. Şişkin kağıt şeritlerinin kuru, temiz ve kirletici içermemesini sağlamak önemlidir.Dalmadan önce, ızgara kutularını dalma Dewar'a uygun yuvalara yerleştirin. Izgaranın döndürme özgürlüğümüzü kapsadığından emin olun. Dondurucuya Dalarak CryoEM Örneklerini Hazırlayın.Şebeke ve ızgara preparatlarının çeşitliliği nedeniyle, şebekelerin hidrofilik hale getirilmesi için önerilen protokolleri izleyin. Izgaraları düzgün bir şekilde işlemek için, dış halkadaki hidrofilik ızgaraları almak için temiz, kuru sıkma cımbızları kullanın. Izgaranın sabitlenebilmesi için plastik kelepçeyi kaydırın ve ızgaranın düzgün bir şekilde kenetlendiğini sağlamak için cımbızlara hafifçe dokunun.Sıkma cımbızında tutulan ızgaranın önüne üç mikrolitre numune uygulayın. Bandı cımbız tabanının etrafına sararak cımbızları manuel dalma koluna sıkıca takın. Örnek artık şişirilmeye ve dondurulmaya hazır.Temiz bir şişkinlik kağıdı şeridinin her ucunu işaret parmaklarınız ve başparmaklarınız arasında tutun. İstikrarlı bir pozisyon oluşturmak için ellerinizi dalgıç Dewar'ın kenarına koyun. Şişkinlik kağıdı ızgaranın yüzeyinden yaklaşık bir santimetre olmalıdır.Ortadaki ızgarayla temas edene kadar şişkinlik kağıdını bükün. Şişkinlik kağıdının ızgara yüzeyine paralel olması, eşit temasa izin vermek ve ızgara hasarını önlemek için önemlidir. Mobil sıvı ön yayılmayı durdurduğunda saymaya başlayın.Izgarayı beş saniyeliğine lekele. Parmaklarınızı birbirinden ayırın, şişkin kağıdı gerin ve ızgaranın yüzeyinden hızla çıkarın. Aynı anda, manuel dalma kolunu serbest bırakmak için ayak pedalına basın, ızgarayı tutan cımbızı sıvı etan içine daldırın.Taze donmuş ızgarayı sıvı etan içinde tutarak, cımbızları manuel dalma kolundan dikkatlice ayırın. Cımbızı dikkatlice çıkarın, böylece ızgara çıkarılabilir. Izgarayı pirinç etan kabının altındaki sıvı azot rezervuarına, etandan sıvı nitrojene hızlı bir hareketle hareket ettirin.Izgarayı kılavuz kutusuna yerleştirin. Temsili Sonuçlar. Bu videodan araştırmacılar, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ince vitreus buz filmleri içeren birçok kare ile bunun gibi CryoEM ızgaralarını hazırlayabilmelidir.Numune konsantrasyonu ve şişkinlik süresi parçacık yoğunluğunu optimize etmek için ayarlanabilir. Burada, blot ve plunge yöntemini kullanarak CryoEM örneklerini dondurmak için tam iş akışını göstereceğiz. Taze bir ızgara almak ve ızgarayı yerinde sabitlemek için temiz bir sıkma cımbızı kullanın.Izgaranın hidrofilik tarafına üç mikrolitre numune uygulayın ve bandı cımbız sapının etrafına sararak manuel dalma koluna cımbız sabitleyin. Şişkinlik kağıdını ızgara yüzeyine paralel yerleştirin ve şişkinliği başlatmak için şişkin kağıdı ızgaraya doğru hafifçe bükün. İstenilen sürenin ardından, lekeleme kağıdını ızgara yüzeyinden bir çıtlatma hareketiyle hareket ettirirken, ayak pedalını bastırarak dalma kolunu serbest bırakın, ızgarayı sıvı etan içine daldırın.Bandı cımbızın ve manuel dalma kolunun etrafından dikkatlice gevşetin. Hızlı bir hareketle, ızgarayı etan kaptan sıvı nitrojen rezervuarına hızlı bir şekilde aktarın. Izgarayı ızgara depolama kutusuna yerleştirin ve cımbızı kuruması için kim silmeye sarın;tekrarlayın.

manual-blot-plunge-freezing-biological-specimens-for-single-particle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Yerli yakın eyalette bakteri hücrelerinin ultrastrüktür çalışma elektron cryotomography (EKT) nasıl kullanılacağı "makromoleküler" (~ 4 nm) çözünürlük, burada göstermektedir.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Biz elektron mikrograflarında fluoresan ışığı ile işaretlenmiş proteinler yerelleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Floresans ilk ince kesitler üzerinde fotoğraf ile aktive localisation mikroskopi kullanılarak yerelleştirilmiştir. Bu görüntüler daha sonra aynı bölümde elektron mikroskop ile hizalanır.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Cryo elektron mikroskopları, Tarama (SEM) veya İletim (TEM), ya çok yüksek su içeriği ile 1 biyolojik örneklerin veya diğer malzemelerin karakterizasyonu için kullanılır. A SEM / Odaklı İyon Işın (FİB) örneklerinde ilgi özelliklerini belirlemek ve cryo-TEM transfer için ince, elektron-saydam tabakalara ayıklamak için kullanılır.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Bu makale, transmisyon elektron mikroskobu ile süspansiyon hücreleri görselleştirme için bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir cryofixation yöntemini tarif etmektedir.

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Burada iki örnek işleme teknikleri, buz gibi yüksek basınç birleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve mikrodalga destekli örnek işleme, veri odaklı iyon demeti Taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) ile edinme için gömme en az reçine izledi. Bu bir fare tibial sinir örnek ve Caenorhabditis eleganskullanarak gösterilmiştir.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Burada bakteri, maya, kültürlü hücreler, izole hücreler, hayvan ve insan dokuları ve virüsler de dahil olmak üzere biyolojik örneklerin hızlı donması için sandviç dondurma cihazının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, hızlı donma işleminden sonra ultra ince kesitler için numunelerin nasıl hazırlanacağını da gösteriyoruz.

Elektron Mikroskopisinde Biyolojik Örneklerin İyi Ultrayapısal Korunması için Sandviç Dondurma Cihazı Kullanılarak Hızlı Dondurma

Burada, kriyo-elektron tomografisi için hücresel numunelerin hazırlanmasına rehberlik etmek için 3D bağıntılı odaklanmış iyon ışını frezeleme için bir boru hattı sunuyoruz. İlgilenilen floresan etiketli proteinlerin 3 boyutlu konumu önce kriyo-floresan mikroskobu ile belirlenir ve daha sonra öğütme için hedeflenir. Protokol memeli, maya ve bakteri hücreleri için uygundur.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Soyma-leke tekniği, kalınlığı azaltmak, numune konsantrasyonunu artırmak ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için çok katmanlı ve konsantre biyolojik numunelerin tek katmanlara ayrılmasını sağlayan bir kriyo-EM ızgara hazırlama yöntemidir.

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

Burada, elektron mikroskobu ızgaralarına tek bir tek katmanlı grafen uygulamak için bir protokol ve bunların kriyoEM yapı belirlemede kullanılmak üzere nasıl hazırlanacağını açıklıyoruz.

Kriyoelektron mikroskobu için tek katmanlı grafen kaplı ızgaraların imalatı

Öğrenin, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örneklerin manuel blot ve dalma dondurması yöntemini. Bu maliyet etkin teknik, yüksek kaliteli örnek hazırlama sağlar.

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Daha fazla video keşfet