Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Teknik, ektopik sinyal kaynaklarını naklederek embriyogenez sırasında sinyal moleküllerinin işlevini ve aralığını incelemeyi sağlar. Ayrıca mikroplu mutantların verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır. Protokol, blastula evre zebra balığı ve medaka embriyolarına ve muhtemelen diğer embriyonik aşamalara ve TDO türlerine de uygulanabilir.

Transplantasyon cihazını monte etmek için, yem kilidi bağlantısını kullanarak bir cezb ucu 25 mikroliter gaz sıkı şırıngayı bir mikro pipet tutucusuna bağlayın. Ardından cihazı doğrudan manuel bir mikro manipülatöre monte edin. Transplantasyon cihazını kullanmak için, mikro manipülatörü monte edilmiş cihazla birlikte stereo mikroskobun yanına yerleştirin.

Ardından pistonu çıkarın ve transplantasyon iğnesini yerleştirin. İğneyi, iğnenin ucu batırana kadar 45 derecelik bir açıyla Ringer çözeltisi ile dolu bir tabağa 2007'de 2007'den buyun. Zil sesini temizlemek için pistonu yaklaşık olarak yarıya kadar yerleştirin ve iğnenin ince konik kısmında sadece küçük bir su bırakın.

İlk kez bir transplantasyon iğnesi kullanırken, kurban edilen bir embriyodan boyunduruk çekerek ve boyunduruk malzemesini tamamen dışarı atarak iğnenin içini kaplar. Daha sonra, bir transplantasyon iğnesi kullanarak, donör embriyoyu hafifçe konumlandırın, ardından iğne açıklığı ortogonal'i embriyo yüzeyine yerleştirin ve hücreleri iğneye çekmek için pistonu dikkatlice çekin. İstenilen sayıda hücre içeri çekildikten sonra, pistonu hafifçe aşağı iterek emmeyi durdurun ve iğneyi kısa ve hızlı bir hareketle yana doğru sallayarak embriyodan çıkarın.

Hücreleri iğnenin konik ucuyla sınırlayarak, hücre sütununun her iki tarafında da bazı Ringer çözeltisi bırakın. Pistonu yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirerek ve hücreleri Ringer'ın çözeltisiyle yıkayarak kalan yumurta sarısı veya hücre kalıntılarını temizleyin. Daha sonra, iğne ortogonalini konak embriyonun yüzeyine konumlandırmak için transplantasyon çanağını baskın olmayan elle hareket ettinin.

Embriyoyu duvarlara dikkatlice sıkarak embriyoya hafif basınç uygulayın. Daha sonra hızlı keskin bir hareketle, iğne ile yumurta sarısını çizmemeye dikkat ederek konak embriyonun saran tabakasını delin. İğne içeri girdikten sonra, hücre sütununu embriyoya ekstrüde etmek için pistonu hafifçe itin ve iğneyi aynı anda yavaşça geri çekin.

Mikrop hücrelerinin nakli için, bir transplantasyon çanağına Ringer'ın çözeltisi ile doldurun, ardından kafeinsiz küreyi kubbe evre embriyolarına transplantasyon kabına aktarın ve hücreleri bir donör embriyodan altı farklı konak embriyoya nakletmek için konakçı ve donör embriyoları alternatif kolonlara yerleştirin. Nakli gerçekleştirmek için, marjı olan embriyoları transplantasyon iğnesine doğru yönlendirin. Germline nakli için kaynak hücreleri marjdan alın ve konak embriyoda aynı yere yatırın.

Transplantasyon tamamlandıktan sonra, embriyonun Ringer'ın çözeltisinde 30 dakika ila bir saat boyunca iyileşmesine izin verin. Daha sonra floresan stereo mikroskop kullanarak nakledilen hücreleri inceleyin. Daha sonra, embriyoları, aynı donörden hücre alan tüm konak embriyoları aynı kuyuya gruplandırarak embriyo ortamına sahip 24 kuyu Agarose kaplı bir tabağa aktarın.

Daha sonra embriyoları ertesi güne kadar 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Gerekirse, donör embriyoları genotipleme için etiketli PCR şeritlerine aktarın. Döllenmeden 30 saat sonra, floresan stereo mikroskop altında konak embriyoları başarılı germline nakilleri için tarayın.

Mikrop hücreleri yumurta sarısı uzantısının üzerindeki olukta bulunmalıdır. Başarıyla nakledilen larvaları standart hayvancılık koşullarına göre yetişkin davlumbazlara yetiştirin. Başarılı nakillerde embriyo, blastodermde büyük yırtıklar olmadan çevrilmemiş embriyolara şekil ve yumurta sarısı berraklığında normal ve benzer görünür.

Buna karşılık, bir embriyo transplantasyon sırasında gözle görülür şekilde hasar görürse, normal olarak gelişmez. Transplantasyon cihazı esas olarak blastula aşamalarında zebra balığı embriyolarında kullanılmış olsa da, transplantasyon ve hücre ekstüresi Japon pirinç balığı medakasının deforionlu blastula evre embriyolarında da yapılabilir. Spesifik germline transplantasyonu durumunda, iyi bir transplantasyon, yumurta sarısı kenar boşluğunun hemen üzerinde uzun bir yatay hücre sütununa sahip bir embriyo ile sonuçlanır.

Bununla birlikte, prosedürün başarısı ancak mikrop hücreleri floresanlarında somatik hücrelerden farklı olduğunda 24 ila 30 saatlik döllenmeden sonra değerlendirilebilir. İlkel mikrop hücreleri, yumurta sarısı uzantısının hemen üzerindeki olukta küçük floresan küreler olarak görünecektir. Bu mikrop hücrelerinin doğru yerde bulunması başarılı mikrop hattı nakline işaret eder.

Başarısız transplantasyon örnekleri burada gösterilmiştir. İlk örnekte, mikrop hücreleri gonadal mezoderm'e ulaşmış olsa da, konak embriyo ciddi şekilde deforme olduğu için normal şekilde gelişmeyecektir. İkinci örnekte, floresan hücreler sadece oluğun dışında tespit edilir.

Bu hücreler, doğru şekilde geçirilemeyen somatik hücreler veya mikrop hücreleridir. Ve her iki hücre tipi de embriyonun mikrop hattına katkıda bulunmayacak. Nakledilen hücrelerin ve konak embriyonun zarar görmesini önlemek önemlidir.

Hücreler yavaşça çizilmeli, kalan yumurta sarısı temizlenmeli ve dikkatlice yerleştirilmelidir. Bu yöntem zebra balığı embriyolarındaki hücrelerin nakli için kolay bir yol sağlar ve ektopik kaynaklar ve germline mutantları üretmek için yararlı olacaktır. Bu cihazın ana avantajı, düşük maliyetlidir ve çok fazladır ve kullanır.