Name: Tryptophan-ANS FRET Eğitimi için Bir Rekombinant Ca2 +-ATPase N-domainde Triptofan Kalıntısının Kimyasal Modifikasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Öğrenin, rekombinant Ca2+-ATPaz N-domain kullanarak triptofan kalıntılarının ANS bağlanmasındaki rolünü ve FRET enerji transferini floresans spektroskopisi ile nasıl analiz edeceğinizi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen FAI-UASLP hibe numarası C19-FAI-05-89.89 ve CONACYT hibe numarası 316463 (Apoyos a la Ciencia de) tarafından finanse edildi. Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Yazarlar julian E. Mata-Morales'in teknik yardımına video baskıda teşekkür ediyorlar.

1. ANS ve SERCA N-domain etkileşiminin belirlenmesi (silikoda)
<ol><li>Tercih edilen protein modelleme yazılımı50kullanarak moleküler modelleme ile proteinin (SERCA N-domain) üç boyutlu (3D) bir yapısını oluşturun.</li>
	<li>Tercih edilen moleküler yapı yazılımı51kullanarak nükleotid bağlayıcı bölgeyi oluşturan amino asit kalıntılarını tanımlayın ve Arg ve Lys kalıntılarının varlığını belirleyin35; bunlar ANS bağlama ve floresan yoğunluğunu (kuantum verimi) artırmak için gereklidir.</li>
	<li>ATP,floresan izotiyosiyanat (FITC) (nükleotid bağlayıcı bölgeyi etiketleyenLys515 ile birlikte bir kovalent bağ oluşturur) ve nükleotid bağlayıcı bölgede amino asit kalıntıları ile ANS etkileşimlerini belirlemek için moleküler yerleştirme (tercih edilen yerleştirme yazılımını kullanarak)52,53,54 gerçekleştirin (Şekil 1).</li>
	<li>Tercih edilen yazılımdaki ölçüm aracını kullanarak Trp kalıntısı ile bağlı ANS arasındaki moleküler mesafeyi (Å) hesaplayın.</li>
	<li>Etkileşimin kararlılığını belirlemek için ANS-N-domain kompleksinin moleküler dinamik simülasyonunungerçekleştiriliyor 52,54. Daha sonra, kompleksin stabilitesi doğrulandığında in vitro deneyleri gerçekleştirin.</li>
</ol>2. Rekombinant N-domain'in ifadesi ve saflaştırılması
<ol><li>N-domain40için gen kodlamasını sentezle.</li>
	<li>N-domain40için kodlayan sentetik geni içeren plazmid tasarlayın ve inşa edin.</li>
	<li>Tasarlanmış rekombinant N etki alanı olan benzeşim kromatografisi (Ni-NTA) ile ifade edin ve arındırın. Saflığı belirlemek için saflaştırılmış proteinin SDS PAGE'ini gerçekleştirin (Şekil 2)40.</li>
	<li>N-domain yok olma katsayısı (ε= 11.960 M -1 ·cm -1)40ile 280nm'lik emiciliği inceleyerek protein konsantrasyonunun belirlenmesi.</li>
</ol>3. ANS ve N alanlı floresan yoğunluğu değişikliklerine dayanarak ANS-N etki alanı kompleksinin oluşumunu izleyin.
<ol><li>N,N-dimetilformamid içinde bir ANS stok çözümü hazırlayın.<ol>
<li>Az miktarda (1-5 mg) ANS tartın ve N, N-dimetilformamid,örneğin, 3,2mg (10,69 mM son konsantrasyon) hacminin 1 mL'sinde çözün.</li>
		<li>N, N-dimetilformamid'deki ANS çözeltisini kullanarak 100μMANS sulu stok çözeltisi hazırlayın, örneğin, 10,69 mM ANS çözeltisinin 9,4 μL'sini 990,6 μL 50 mM fosfat tamponuna ekleyin ve 1 mL'lik son bir hacim elde edin.</li>
		<li>Çözeltileri 15 s için 3 - 5 kez girdaplayarak karıştırın. NOT: Aşağıdaki denemede, yalnızca ANS sulu stok çözümünü kullanın. Deneyleri başlatmadan önce ANS sulu stok çözümünü yeni hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NBS stok çözeltisini N,N-dimetilformamid olarak hazırlayın.<ol>
<li>Az miktarda (1-5 mg) NBS tartın ve 1 mL N,N-dimetilformamid, örneğin, 1 mL'de 5.3 mg (29.78 mM son konsantrasyon) çözün.</li>
		<li>N, N -dimetilformamiddeki NBS çözümünü kullanarak 1mMNBSsulu stok çözeltisi hazırlayın, örneğin, 29,78 mM NBS çözeltisinin 3,36 μL'sini pH 8,0 ile 96,64 μL 50 mM fosfat tamponuna ekleyerek son hacim 0,1 mL'yi elde edin.</li>
		<li>Çözeltileri 15 s için 3 - 5 kez girdaplayarak karıştırın. NOT: Deneylere başlamadan önce NBS sulu stok çözümünü yeni hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ANS ile N-etki alanını titrat ve floresan spektrumunu 25 °C'de φ=295 nm'de ekscitasyonla kaydedin.<ol>
<li>Floresan spektrum taban çizgisini elde edin.<ol>
<li>1 mL floresan kuvars cuvette içine pH 8.0 ile 50 mM fosfat tamponunun 1 mL'lik bir kısmını yerleştirin.</li>
			<li>Hücreyi spektrofluorometrenin termo-belirtilen hücre odasına (25 °C) yerleştirin ve ekscitasyon φ'yi 295 nm olarak ayarlayın.</li>
			<li>Floresan spektrumu (305 - 550 nm) kaydedin. NOT: Boş numune görevi gören pH 8.0 ile 50 mM fosfat tamponunun floresan spektrumu, elde edilen tüm floresan spektrumlarından çıkarılır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>N-etki alanının iç floresan spektrumu edinin.<ol>
<li>900 μL 50 mM fosfat tamponu pH 8.0 ile floresan kuvars cuvette yerleştirin.</li>
			<li>1 mL son hacimde 1 μM N alan adı son konsantrasyonu elde etmek için 100 μL N etki alanı (10 μM) süspansiyon ekleyin.</li>
			<li>Çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak 20 kez hafifçe homojenize edin. NOT: Protein, yüksek kaliteli iç floresan spektrumu elde etmek için taze arındırılmalıdır, örneğin, saflaştırılmış rekombinant N-domain saflaştırmadan sonra sadece bir hafta kullanılabilir.</li>
			<li>Hücreyi spektrofluorometrenin termo-belirtilen hücre odasına (25 °C) yerleştirin ve ekscitasyon φ'yi 295 nm olarak ayarlayın.</li>
			<li>N-domain iç floresan spektrumu (305-550 nm) kaydedin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ANS ekleyin ve φ=295 nm'de heyecanlanarak floresan spektrumunu elde edin.<ol>
<li>0,2 μM ANS son konsantrasyon elde etmek için askıya alınan N etki alanına (1 μM) 100 μM ANS sulu stok çözeltisi 2 μL aliquot ekleyin.</li>
			<li>Çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak 20 kez hafifçe homojenize edin.</li>
			<li>Hücreyi spektrofluorometrenin termo-kararlı hücre odasına (25 °C) yerleştirin ve ekscitasyonu φ 295 nm olarak ayarlayın.</li>
			<li>Floresan spektrumu (305-550 nm) kaydedin.</li>
			<li>ANS eklemelerini ve floresan spektrum kaydını 1:1 molar ilişki ANS:N-domain'in üzerinde tekrarlayın.</li>
			<li>Uygun yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın.</li>
			<li>Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin.</li>
			<li>Spektrumun FRET benzeri bir desen oluşturup oluşturmadığını belirleyin. ANS-N-domain floresan spektrumu FRET benzeri bir desen oluşturur (Şekil 3A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. NBS ile Trp kimyasal modifikasyonu ile N-domain iç floresan titrasyonu.
<ol><li>3.3.1 ve 3.3.2 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>1 μM NBS'lik son konsantrasyonu elde etmek için askıya alınan N-etki alanına (1 μM) 1 mM NBS sulu stok çözeltisinin 1 μL'lik bir aliquotunu ekleyin.</li>
	<li>Çözeltinin homojenliğini sağlamak için 20 kez bir mikropipette kullanarak hafifçe homojenize edin.</li>
	<li>Hücreyi spektrofluorometrenin termo-kararlı hücre odasına (25 °C) yerleştirin ve ekscitasyonu φ 295 nm olarak ayarlayın.</li>
	<li>Floresan spektrumu (305-550 nm) kaydedin (Şekil 3B).</li>
	<li>Minimum N-domain iç floresan söndürme gözlenene kadar NBS ilavesini ve floresan spektrum kaydını tekrarlayın40. N etki alanında, bu genellikle 5-6 NBS / N-domain40molar oranında gerçekleşir. NOT: NBS, N-etki alanının iç floresanını hızla (<5 s) sorgular; floresan yoğunluğunda bir azalma gözlenir. NBS diğer amino asit kalıntıları ile de reaksiyona girebileceği için hemen bir sonraki adıma geçin47.</li>
	<li>Uygun yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın.</li>
	<li>Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin (Şekil 3B).</li>
</ol>5. 25 °C'de floresan spektrumu kaydederek NBS modifiye N-domain'i ANS ile titrate edin.
<ol><li>Adım 4'te oluşturulan NBS değiştirilmiş N etki alanını kullanarak Adım 3.3.3'i gerçekleştirin.</li>
	<li>Uygun yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın.</li>
	<li>Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin (Şekil 3C).</li>
	<li>Oluşturulan floresan spektrumu (Şekil 3C) FRET oluşumunu destekler veya çürütür, yani FRET meydana geldiğinde, ANS floresan artmaz ve bunun tersi de geçerli olur.</li>
</ol>6. φ=370 nm'de heyecanlanarak kimyasal olarak değiştirilmiş N-etki alanına ANS bağlanmasının kanıtı.
<ol><li>Adım 4'te oluşturulan NBS değiştirilmiş N etki alanını kullanarak ancak φ ekscitasyonunu 370 nm olarak değiştirerek Adım 3.3.3'i gerçekleştirin.</li>
	<li>Uygun yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın.</li>
	<li>Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin (Şekil 3D).</li>
	<li>ANS floresan yoğunluğundaki artışı gözlemleyerek N etki alanına ANS bağlamasını onaylayın. N-etki alanına ANS bağlaması, φ=370 nm 'de heyecanlandığınızda floresan artışı gösterir (Şekil 3D). Kontrol olarak, pH 8.0 ile 50 mM fosfat tamponunda ANS'nin floresan spektrumu 295 ve 370 nm'de heyecan verici elde edildi(Şekil 4, videoda gösterilmedi). NOT: Kimyasal modifikasyon için gerekli olan NBS:Trp'nin stoichiometrik ilişkisi, trp kalıntılarının çalışma aşamasındaki proteine gömülme dereceine bağlıdır46,47,55,56. Bu nedenle, önceden NBS:protein/(Trp) molar oranının belirlenmesi önerilir.</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

ANS-N-domain kompleksinin floresan spektrumu, 295 nm'lik bir φ'de heyecanlandığında FRET benzeri bir desen gösterirken, Trp kalıntısı ile ANS arasındaki moleküler mesafe (20 Å) FRET oluşumunu destekliyor gibi görünmektedir (Şekil 1). NBS tarafından TRP kimyasal modifikasyonu daha az floresan N-domain ile sonuçlanır(Şekil 3B, Spektrum f); bu nedenle, enerji transferi mümkün değildir. ANS floresan spektrumu, 295 nm(Şekil 3A ve...

Föster rezonans enerji transferi (FRET), protein yapısı ve fonksiyon çalışmalarında bağlanma veya etkileşim sonrası moleküler yapılar arasındaki mesafeyi belirlemek için standart bir teknik haline gelmiştir1,2,3,4. P tipi ATPases'te FRET, sarkoko-endoplazmik reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)2, 5,6,7,8,örneğin katalitik döngü sırasındaki yapısal dalgalanmaların yapısını ve işlevini araştırmak için FRET7tarafından tüm proteinde analiz edilmiştir.
FRET donörleri çeşitlidir ve küçük floresan (dışsal) moleküllerden floresan proteinlere9,10arasında değişmektedir. Triptofan (Trp) kalıntıları (floresanları nedeniyle) protein amino asit dizilerindeki yapısal değişiklikleri tanımlamak için yararlıdır11,12. Trp'nin floresan yoğunluğu önemli ölçüde çevresindeki çevrenin polaritesine bağlıdır13,14. Ligand bağlama genellikle proteinlerde/enzimlerde yapısal yeniden düzenleme oluşturur15,16. Trp protein bağlama bölgesinde veya yakınında bulunuyorsa, yapısal dalgalanmalar trp'nin sulu ortama maruz kalma derecesini sıklıkla etkiler13,14; böylece, polaritedeki değişiklik Trp floresan yoğunluğunun söndürülme ile sonuçlanır13,14. Bu nedenle, Trp'nin floresan özelliği enzimler için ligand bağlama çalışmaları yapmak için yararlıdır. Diğer fiziksel olaylar da Trp floresan söndürme yol açabilir17,18,19,20, örneğin, FRET ve orta polaritede değişiklikler. Trp'nin heyecanlı durumundan bir florofora enerji transferi, örneğin proteinlerdeki küçük ligandların benzeşim tayini gibi potansiyel uygulamalara da sahiptir21. Nitekim Trp, FRET çalışmalarında22, 23 , 24,örneğin terbiyum (Tb3+) FRET çalışmalarında floresan donör olarak kullanılmaktadırılmıştır,Bir Trp kalıntısı tb3+ 25, 26,27'yeenerji transferi için anten olarak sıklıkla kullanılmaktadır. Trp, protein yapısındaki doğal constitutive karakteri nedeniyle diğer FRET donörlerine göre çeşitli avantajlar sergiler, bu da çalışılan proteinin işlevini / yapısını etkileyebilecek hazırlık süreçlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırır24. Bu nedenle, radyatif bozunmaların tanımlanması (protein yapısal yeniden düzenlemelerinin neden olduğu orta polaritedeki enerji transferi ve değişiklikler) protein yapısal çalışmalarında ligand bağlanması ile ilgili doğru sonuçlar çıkarmak için önemlidir13,14,19,28.
Protein yapısal çalışmalarında, ekstrinsik bir florofor, yani 8-anilino-1-naftalin sülfonat (ANS), öncelikle protein katlama / açma ile ilgili deneylerde kullanılmıştır28,29. ANS, genellikle31, 32,33 substratlarının bağlama bölgelerinde, doğal durumdaki proteinlere / enzimlerebağlanır; ANS floresan kuantum veriminde (ΦF) bir artış (yani, floresan yoğunluğunda bir artış), ANS'nin Arg ile uygun etkileşimleri ve hidrofobik ceplerdeki kalıntıları 34,35 , 36,37 meydana geldiğindeproteinin φ=370nm'de heyecan verici olmasıyla indüklenmektedir. Çeşitli çalışmalarda, Trp kalıntıları (donörler) ve ANS (kabul eden) arasında FRET (280-295 nm içinde heyecan verici olduğunda) meydana gelmesi bildirilmiştir, aşağıdakilere dayanmaktadır: 1) Trp floresan emisyon spektrumunun ve ANS'nin uyarma spektrumunun çakışması, 2) enerji transferi için bir veya daha fazla Trp kalıntısı ile ANS arasında uygun bir mesafenin tanımlanması, 3) protein ceplerine bağlandığında yüksek ANS kuantum verimi ve 4) ANS 3, 17,27,37,38varlığında proteinin floresan spektrumunda karakteristik FRET deseni.
Son zamanlarda, SERCA ve diğer P tipi ATPases'teki nükleotid bağlayıcı etki alanına (N-domain) ligand bağlama, mühendislik rekombinant N-domains40 , 41 , 42,43,44,45,46kullanılarak araştırılmıştır. SERCA N-domain moleküler mühendisliği, tek Trp kalıntısını (Trp552Leu) nükleotid bağlayıcı bölgeye yakın olan daha dinamik bir yapıya (Tyr587Trp) taşımak için kullanılmıştır, burada floresan varyasyonları (söndürme) ligand bağlama34üzerindeki yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılabilir. Deneysel sonuçlar, ANS'nin (ATP olarak) saflaştırılmış rekombinant SERCA N-domain34'tekinükleotid bağlama bölgesine bağlandığını göstermiştir. İlginçtir ki, ANS floresan 295 nm'lik bir φ'de heyecanlanma üzerine N-etki alanına bağlanınca artarken, N-etki alanının iç floresanları34azalır , böylece bir Trp-ANS FRET çiftinin oluşumunu öneren bir FRET deseni üretir.
Modifiye proteinlerin absorbans tahlilleri ile47 proteinlerindeki Trp kalıntılarının içeriğini belirlemek için NBS kullanımı önerilmiştir. NBS, Trp'nin son derece emici indole grubunu daha az emici oksidol47,48ile değiştirir. Bu, Trp floresan özelliğinin kaybına (söndürme) neden olur40. Bu nedenle, Trp kalıntılarının NBS aracılı kimyasal modifikasyonu, FRET hipotez edildiğinde Trp'nin (donör olarak) rolünü tanımlamak için bir test olarak kullanılabilir.
Bu protokol, SERCA'nın mühendislik rekombinant N-domain'indeki tek Trp kalıntısının NBS tarafından protein modeli olarak kimyasal olarak değiştirilmesini tanımlamaktadır. Deneysel sonuçlar, ANS floresan yoğunluğunun kimyasal olarak NBS modifiye edilmiş N-domain34'te hala arttığını göstermektedir . Bu nedenle, test, N etki alanı34 , 40,49'a bağlandığında Trp kalıntısı ve ANS arasında FRET yokluğunu göstermek için yararlıdır. Bu nedenle, bu test (Trp'nin NBS kimyasal modifikasyonu) Trp-ANS FRET çiftinin proteinlerde varlığını kanıtlamada yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>Akrilamid</td><td>Bio-Rad</td><td>1610107</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>SDS-SAYFA</td></tr><tr><td>8-Anilino-1-naftalinsülfonik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1028</td><td>Florofor</td></tr><tr><td>Bis-akrilamid</td><td>Bio-Rad</td><td>1610125</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>N-Bromosuccinimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B81255</td><td>Kimyasal modifikasyon</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamid</td><td>J.T. Baker</td><td>9213-12</td><td>Stok çözelti hazırlama</td></tr><tr><td>Floresein izotiyosiyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Kimyasal floresan etiketi</td></tr><tr><td>Floresan küvet</td><td>Hellma</td><td>Z801291</td><td>Floresan deneyi</td></tr><tr><td>Floresan Spektroflorometre</td><td>Shimadzu</td><td>RF 5301PC</td><td>Floresan deneyi</td></tr><tr><td>HisTrap ve ticaret; FF</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0004-59</td><td>Protein saflaştırma</td></tr><tr><td>IPTG, Dioksan içermeyen</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00841-00010</td><td>Protein ekspresyonu</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td>Protein saflaştırma</td></tr><tr><td>LB ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Pipetman L P10L</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td>Floresan tahlil</td></tr><tr><td>Pipetman L P100L</td><td>Gilson</td><td>FA10004M</td><td>Floresan testi</td></tr><tr><td>Pipetman L P200L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td>Floresan testi</td></tr><tr><td>Pipetman L P1000L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td>Floresan testi</td></tr><tr><td>Pipetman L P5000L</td><td>Gilson</td><td>FA10007</td><td>Floresan testi</td></tr><tr><td>Hassasiyet artı std</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>J.T. Baker</td><td>3828-19</td><td>Tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>J.T. Baker</td><td>3818-01</td><td>Tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi 0.2 um</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td>Çözelti</td></tr><tr><td>filtrasyonu Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>SDS-SAYFASI</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>SDS SAYFASI</td></tr></tbody></table>

tryptophan-ans fret eğitimi için bir rekombinant ca2 +-atpase n-domain'de triptofan kalıntısının kimyasal modifikasyonu

Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET

Sarko/endoplazmik reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), çeşitli konformasyonlarda kristalize edilmiş P tipi bir ATPazdır. Ayrıntılı işlevsel bilgiler yine de yalıtılmış rekombinant etki alanlarından elde edilebilir. Mühendislik (Trp552Leu ve Tyr587Trp) rekombinant nükleotid bağlayıcı etki alanı (N-domain), ligand bağlama üzerine floresan söndürme görüntüler. Dış florik florofor, yani 8-anilino-1-naftalin sülfonat (ANS), Arg, His, Ala, Leu ve Phe kalıntıları ile elektrostatik ve hidrofobik etkileşimler yoluyla nükleotid bağlayıcı bölgeye bağlanır. ANS bağlama, 370 nm'lik bir dalga boyunda (φ) heyecanlandığında floresan yoğunluğundaki artışla kanıtlanır. Bununla birlikte, 295 nm'lik bir heyecanlandığında, floresan yoğunluğundaki artış, N-domain iç floresanının söndürülmeleriyle birleştiğinde görünüyor. Floresan spektrumu, Föster rezonans enerji transferi (FRET) benzeri bir desen gösterir, böylece Tyr587Trp ve ANS arasındaki kısa mesafe (~20 Å) ile desteklenmiş gibi görünen bir Trp-ANS FRET çiftinin varlığını önerir. Bu çalışmada Trp-ANS FRET çiftinin N-bromosuccinimide (NBS) aracılı Trp kimyasal modifikasyonu (ve floresan söndürme) ile analizi açıklanmaktadır. Kimyasal olarak değiştirilmiş N-domain'de, ANS floresan 295 nm'lik bir φ'de heyecanlandığında arttı, 370 nm'lik bir φ'de heyecanlandığında olduğu gibi. Bu nedenle, Trp kalıntısının NBS aracılı kimyasal modifikasyonu, Trp ve ANS arasında FRET yokluğunu araştırmak için kullanılabilir. Trp floresan yokluğunda, ANS floresanında bir artış olmamalıdır. Proteinlerdeki Trp kalıntılarının NBS tarafından kimyasal olarak modifikasyonu, bağlı ANS'ye yakın trp kalıntıları arasındaki FRET'i incelemek için yararlı olabilir. Bu test muhtemelen diğer floroforları kullanırken de yararlı olacaktır.

Moleküler yerleştirme, ANS'nin elektrostatik ve hidrofobik etkileşimler yoluyla N-etki alanının nükleotid bağlayıcı bölgesine bağlanmasını gösterir (Şekil 1). Trp kalıntısı ile ANS (nükleotid bağlayıcı bölgeye bağlı) arasındaki moleküler mesafe (20 Å) FRET oluşumunu destekler (Şekil 1). Tasarlanan (mühendislik) rekombinant N-domain, benzeşim kromatografisi (Şekil 2) ile yüksek saflıkta elde edildi ve floresan deneyleri için uygundu....

ANS, Ca2+-ATPase rekombinant N etki alanına bağlanır. Floresan spektrumu, 295 nm dalga boyunda heyecanlanma üzerine FRET benzeri bir desen gösterir. Trp'nin NBS aracılı kimyasal modifikasyonu, N-etki alanının floresanını sorgular ve bu da Trp kalıntısı ile ANS arasında enerji transferi (FRET) olmamasına neden olur.

Tryptophan-ANS FRET Eğitimi için Bir Rekombinant Ca2 +-ATPase N-domain'de Triptofan Kalıntısının Kimyasal Modifikasyonu

The sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) is a P-type ATPase that has been crystallized in various conformations. Detailed functional ...

Bu tahliller, ANS bağlama çalışmaları yapılırken triptofan kalıntılarının proteinlerdeki rolünü netleştirmeye yardımcı olabilir. ANS floresan proteinlerdeki belirli yapısal bölgelere bağlanınca artar. Bazen ANS bağlama bölgesi, triptofan ve ANS arasında FRET varlığını düşündüren bir mesafeye sahip bir triptofan kalıntısına yakın bir yer bular.NBS, proteinlerdeki triptofan kalıntılarının kimyasal modifikasyonunu aracılık ederek floresanını söndürür. Bu nedenle, bu tahliller triptofan kalıntılarının FRET tarafından ANS floresan yoğunluğunun artmasına katkıda bulunup bulunmadığının belirlenmesine izin verir. Bu çalışmada, ANS'nin de bağlandığı nükleotid bağlama bölgesine yakın bir triptofan bulmayı amaçlayan, mutasyon içeren SERCA'dan tasarlanmış bir rekombinant nükleotid bağlama etki alanı kullanıyoruz.Bu tahlil hızlı ve gerçekleştirilmesi kolaydır, bu nedenle ana avantajıdır. ANS ve SERCA N-Domain etkileşiminin silikosunda kararlılık. Tercih edilen protein modelleme yazılımını kullanarak moleküler modelleme ile proteinin üç boyutlu bir yapısını oluşturun.Tercih edilen moleküler yapısal yazılımı kullanarak nükleotid bağlama bölgesini oluşturan amino asit kalıntılarını tanımlayın ve arginin ve lizin kalıntılarının varlığını belirleyin. Bunlar ANS bağlama için gereklidir ve floresan yoğunluğunu arttırır. SERCA'nın nükleotid bağlama bölgesinde arginin ve lizin kalıntıları bulunması nedeniyle, ANS'nin N-Domain'e bağlanmasını hipotez ediyoruz.3D modelde, ATP bağlama bölgesini oluşturan amino asit kalıntıları turuncu renkte tanımlanır ve vurgulanır. Benzer şekilde, tirozin-triptofan mutasyonu mavi ile bulunur ve vurgulanır. ATP, FITC ve ANS ile moleküler yerleştirme gerçekleştirin.Yerleştirme sonuçları, ANS'nin ATP ve FITC'ye benzer şekilde nükleotid bağlama bölgesine iyi uyduğunu göstermektedir. FITC nükleotid bağlama bölgesini etiketler. Triptofan kalıntısı ile ANS arasındaki moleküler mesafeyi hesaplayın.20 angstrom, FRET için uygun bir mesafe gibi görünüyor. Etkileşimin kararlılığını belirlemek için ANS N-Domain kompleksinin moleküler dinamik simülasyonunun gerçekleştiriliyor. 10 nanosaniyelik simülasyon süresi kompleksin kararlılığını gösterir.Tüp bebek deneylerini yapmaya devam edin. Rekombinant N-Domain'in ifadesi ve saflaştırılması. Benzeşim kromatografisi ile mühendislik rekombinant N-Domain'i ifade edin ve arındırın.Saflığı belirlemek için saflaştırılmış proteinin SDS PAGE'ini gerçekleştirin. N-Domain yok olma katsayısı ile 280 nanometre dalga boyunda emici ile protein konsantrasyonu belirleyin. ANS ve N-Domain floresan yoğunluğu değişikliklerine dayanarak ANS N-Domain kompleksinin oluşumunu izleyin.N, N-Dimetilformamid'de bir ANS stok çözümü hazırlayın. Bir ila beş miligram arasında az miktarda ANS ağırlığındadır. ANS'yi N, N-Dimetilformamid'in son hacminin bir mL'sinde çözün.N, N-Dimetilformamid'deki ANS çözümünü kullanarak 100 mikromolar ANS stok çözümü hazırlayın. Çözeltiyi üç ila beş kez girdaplayarak karıştırın. N-Dimetilformamid N,N-Dimetilformamid NBS stok çözüm hazırlayın.Bir ila beş miligram olmak üzere az miktarda NBS ağırlığındadır. NBŞ'yi bir mL N, N-Dimetilformamid içinde çözün. N, N-Dimetilformamid'deki NBS çözümünü kullanarak bir milimolar NBS stok çözümü hazırlayın.Çözeltiyi üç ila beş kez girdaplayarak karıştırın. ANS ile N-Domain titrate ve 25 derecede 295 nanometre dalga boyunda heyecan için floresan spektrumu kaydedin. Floresan spektrum taban çizgisini elde edin.Bir mL floresan kuvars cuvette içine pH sekiz ile 50 milimoler fosfat tamponunun bir mL'sini yerleştirin. Hücreyi spektrofotometrenin termostatlı hücre odasına yerleştirin ve heyecan dalga boyunu 295 nanometreye ayarlayın. Floresan spektrumu kaydedin.Boşluğun floresan spektrumu, daha sonra çıkarılması gereken suyun zirvesini gösterir. N-Domain'in iç floresan spektrumunun eldeini elde edin. 900 mikrolitre 50 milimoler fosfat tamponu pH 8 ile floresan kuvars cuvette yerleştirin.Bir mikromoler N-Domain son konsantrasyonu elde etmek için 100 mikrolitre N-Domain süspansiyon ekleyin. Çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak hafifçe homojenize edin. Hücreyi Spektrofotometrenin termostatlı odasına yerleştirin.Heyecan dalga boyunu 295 nanometreye ayarlayın. N-Domain iç floresan spektrumu kaydedin. ANS ekleyin ve 295 nanometre dalga boyunda heyecanlanarak floresan spektrumunu elde edin.0,2 mikromolar ANS son konsantrasyon elde etmek için askıya alınan N-Domain'e 100 mikromolar ANS stok çözeltisinin iki mikroliter aliquotunu ekleyin. Bu çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak hafifçe homojenize edin. Floresan spektrumu kaydedin.1:1 ANS N-Domain molar ilişkisi için ans eklemelerini ve floresan spektral kaydını yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın. Yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın. Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin Spektrum tarafından FRET benzeri bir desen oluşup oluşmadığını belirleyin.ANS N-Domain floresan spektrumu FRET benzeri bir desen oluşturur. N-Domain iç florescence titrasyon NBS ile triptofan kimyasal modifikasyon ile. N-Domain'in iç floresan spektrumu tekrar elde edin.Bir mikromoler NBS'nin son konsantrasyonunu elde etmek için askıya alınan N-Domain'e bir milimoler NBS stok çözeltisinin bir mikrolitre aliquotunu ekleyin. Çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak hafifçe homojenize edin. Floresan spektrumu kaydedin.NBŞ ilavesini ve floresan spektral kaydını minimal N-Domain iç floresan söndürmesi gözlenene kadar tekrarlayın. Çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak hafifçe homojenize edin. Yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın.Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin. NBS modifiye N-Domain'i ANS ile 25 derecede floresan spektrumu kaydederek titrat. ANS ekleyin ve 295 nanometre dalga boyunda heyecanlanarak floresan spektrumunu elde edin.Çözeltinin homojenliğini sağlamak için bir mikropipette kullanarak hafifçe homojenize edin. Floresan spektrumu kaydedin. Yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın.Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin. Oluşturulan floresan spektrumu FRET oluşumunu destekler veya çürütür. Yani FRET meydana geldiğinde, ANS floresan artmaz ve bunun tersi de artar.ANS'nin kimyasal olarak değiştirilmiş N-Domain'e 370 nanometre dalga boyunda heyecanlanarak bağlanmış kanıtı. NBS modifiye N-Domain'e ANS ekleyin ve 370 nanometre dalga boyunda heyecanlanarak N-Domain iç floresan spektrumunu kaydedin. Yazılımı kullanarak her spektrumdan boş spektrumu çıkarın.Tüm spektrumları tek bir grafikte çizin. Artan ANS floresan yoğunluğu ile N-Domain'e ANS bağlamasını onaylayın. N-Domain'e ans bağlama, 370 nanometre dalga boyunda heyecanlandığında floresan artışı gösterir.Sonuçlara genel bakış. Panel A.ANS N-Domain kompleksi, 295 nanometre dalga boyunda heyecan verici olduğunda FRET benzeri bir desen görüntüler. Panel B.NBS, kimyasal olarak değiştirilmiş N-Domain'deki tek triptofan kalıntısını kimyasal olarak değiştirerek N-Domain iç floresanını söndürür.Panel C.ANS floresan, 295 nanometre dalga boyunda heyecan verici olduğunda artar. Panel D.ANS floresan da 370 nanometre dalga boyunda heyecan verici olduğunda artar. Bu nedenle, ANS'nin 295 nanometre dalga boyunda doğrudan çıkarılması, ATP bağlama bölgesine bağlandığında ANS floresanının ana kaynağıdır. Sonuç.Bu tahliller, proteinlerde triptofan kalıntıları ve ANS arasındaki FRET varlığını belirlemek için kullanılabilir. FRET'in triptofan ve ANS arasında doğrulansa da onaylanmasa da netleştirilmesi, protein yapısal çalışmalarında daha iyi sonuçlara varılmasını sağlayacaktır. Test, diğer floroforları kullanırken de yararlı olabilir.

chemical-modification-tryptophan-residue-recombinant-ca2-atpase-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Tıbbi, farmasötik, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için Kanonik olmayan amino asit analoglarının proteinlere kalıntıya özgü dahil edilmesi için kullanımı kolay, hücresiz bir ekspresyon protokolü sunulmuştur.

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi

Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Biyokimyasal ve yapısal analizleri glikozile proteinlerin homojen örnekleri nispeten büyük miktarda gerektirir. Burada, reaktif Cys thiols hedefleyerek bakterilerden saflaştırılmış rekombinant proteinlerin siteye özgü Glikozilasyon için verimli bir kimyasal yöntem mevcut.

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Sentetik Biyoloji Mühendisliği proteinlerin kanonik olmayan amino asitlerin co-translational ekleme kullanarak benzersiz özellikleri ile sağlar. Burada, GFP türü fluorophore "altın" floresan protein (GdFP) olarak adlandırdığı roman Floresans spektroskopik özellikleri ile hayalice kırmızı kaymıştır bir türevi E. coli seçici basınç birleşme (SPI) yolu ile nasıl üretilir sundu.

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Bu makale, Salmonella tiphimurium triptofan sintazının ekspresyonu ve saflaştırılması için bir dizi ardışık yöntem sunar, bu protokol protein kompleksini bir günde arındırmak için hızlı bir sistemdir. Kapsanan yöntemler escherichia coliprotein ekspresyözü, benzeşim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi ve kristalizasyondur.

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Klasik bölgeye yönelik mutagenezin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, spesifik modifikasyonlara sahip prolin analogları birkaç floresan proteinine dahil edildi. Hidrojenin flor ile veya prolin kalıntılarındaki tekli çift bağlarla ("moleküler cerrahi") değiştirilmesinin, katlanmaları ve ışıkla etkileşimleri de dahil olmak üzere temel protein özelliklerini nasıl etkilediğini gösteriyoruz.

Floresan Proteinlerde Prolin Analogları ile Prolinin Kalıntıya Özgü Değişimi: Omurganın "Moleküler Cerrahisi" Katlanma ve Stabiliteyi Nasıl Etkiler?

İşlevsel bölgeye yönelik florometri, protein alanı hareketlerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir. Bu tekniğin doğal hücrelerde uygulanması için modifikasyonu, artık murin izole iskelet kası liflerindeki voltaj kapılı Ca2 + kanallarından tek voltaj sensörü hareketlerinin tespit edilmesine ve izlenmesine izin vermektedir.

İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

Dinamin süper aile proteinlerinin işlevleri, GTP hidrolizi ile birleşen konformasyonel değişikliklere bağlıdır. Farklı nükleotid yükleme durumlarında dinnamin benzeri GTPaz atlastininin konformasyonel dinamiklerini izlemek için tek moleküllü FRET (smFRET) tekniği kullanılarak bir sistem tanımlanmıştır.

Dinamin Benzeri GTPaz Atlastininin Konformasyonel Dinamiklerini Gözlemlemek için Tek Moleküllü FRET Görüntüleme

Bu protokol, son santrifüjleme adımında disakkarit trehalozu içeren geliştirilmiş bir SERCA saflaştırma yöntemini tanımlar. Bu karbonhidrat, zorlu koşullar altında proteinleri stabilize eder. Saflaştırılmış SERCA, katalitik olarak aktifti ve yüksek saflık sergiledi, bu da onu yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için uygun hale getirdi.

Sarko-Endoplazmik Retikulum Ca2+-ATPazın Tavşan Kasından Saflaştırılması

Öğrenin, rekombinant Ca2+-ATPaz N-domain kullanarak triptofan kalıntılarının ANS bağlanmasındaki rolünü ve FRET enerji transferini floresans spektroskopisi ile nasıl analiz edeceğinizi.

Tryptophan-ANS FRET Eğitimi için Bir Rekombinant Ca^{2 +}-ATPase N-domain'de Triptofan Kalıntısının Kimyasal Modifikasyonu

Daha fazla video keşfet