Drosophila'da Tüketimin Nicelleştirilmesi için Yüksek Verimli Mikro Plaka Besleyici Tahlili
June 14th, 2021
Mikro plaka besleyici tahlili, Drosophila'dakisıvı gıda tüketimini ölçmek için ekonomik, yüksek verim yöntemi sunar. 3D baskılı bir cihaz, sineklerin barındırıldığı 96 kuyulu bir mikro plakayı, sineklerin bir izleyici boyası ile bir besleme çözeltisi tükettiği 1536 kuyulu bir mikro plakaya bağlar. Çözelti hacmi düşüşü spektrofotometrik olarak ölçülür.
Mikro plaka besleyici tahlili, Drosophila besleme davranışını ölçmek için basit, yüksek verimli, ekonomik bir yöntem sağlar ve diğer, daha ayrıntılı yöntemlere göre birden fazla avantaj sunar. Absorbansı bir plaka okuyucu ile ölçerek tüketimi ölçmek manuel ölçümleri ortadan kaldırır ve manuel veri girişini ortadan kaldırır. Veriler programlı ekstraksiyon ve işleme için de uygun.
Bu yüksek verimli test ile suda çözünen besin maddelerinin, ilaçların, farmasötiklerin veya toksinlerin tüketimini ölçebiliriz ve sistem çeşitli böcek türlerine uygulamalar için değiştirilebilir. Erimiş agarose'u bir reaktif oluğuna dökerek başlayın ve çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyulu bir mikro plakanın her kuyusuna 80 mikrolitre erimiş agarose dağıtın. Kalan agarose'u kapalı bir torbada bir haftaya kadar soğutun ve ek plakalar yapmak için yeniden eritin.
Bariyer şeritleri çok gevşekse, onları kanallarda tutmak için eğrilik vermek için parmağın etrafına sarın. Bağlayıcıları hazırlamak için bariyer şeritlerini bariyer şeridi kanallarına yerleştirin. Bağlayıcıyı bir açlık plakasına yapıştırın, bağlayıcı kayabileceğinden plakayı manipüle etmek için bağlayıcıyı kullanmamaya dikkat edin.
Doğru yönlendirmeyi korumak için bağlayıcının açılı köşesinin mikro plakanın açılı köşesine eşleştiğinden emin olun. CO2 anestezisi altında, üç ila beş günlük sinekleri sıralayın. Tek tek sinekleri sütunla açlık plakasına yükleyin.
Bariyer şeridini kapalı konuma ayarlayarak her sütunu doldururken kapatın. Numune düzenini mikro plaka içinde dikkatlice kaydedin. Açlık plakası doldurulduktan sonra, sineklerin CO2'yi çıkardıktan sonra kendiliğinden iyileşmesine izin verin ve ilk anestezi sürelerinden başlayarak altı saat aç bırakın.
10 mililitre damıtılmış suda 0,4 gram sakkaroz ve 0,1 gram maya ekstresini eriterek 15 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre sıvı gıda hazırlayın. Katı maddeler tamamen çözünene kadar tüpü girdapla. 40 mikrolitre boya stok çözeltisi ekleyin ve sıvı gıdayı 0,45 mikrometre filtre ile uçlanmış 10 mililitrelik bir şırıngaya aktarın.
Çözeltinin yaklaşık 1,5 mililitresini aynı anda 1,7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne filtreleyin. Çözeltiyi içeren şırınnayı bir kenara koyun ve besleyici plakası hazırlığı sırasında ek çözeltiyi gerektiği gibi filtreleyin. 1536 kuyulu bir mikro plakanın altını sızdırmazlık filmiyle kapatarak bir besleyici plakası hazırlayın.
Filme iyice yapışmak için bir sızdırmazlık raketi kullanın. Ardından, fazla filmi bir jiletle sol ve sağ kenarlardan kesin. Filtrelenmiş sıvı gıda kolonunun 10 mikrolitresini, 1536 kuyulu mikro plakanın dört kuyusunun her bir kümesi için sol üst kuyuya dağıtın.
Tüm kuyular doldurulduktan sonra, mikro plakanın tabanını kapatmak için kullanılan adımları izleyerek plakanın üstüne bir sızdırmazlık filmi uygulayın. İstediğiniz sayıda plaka için tekrarlayın. Sıvıyı yerleştirmek için plakaları 10 saniye boyunca 200 kez G'de santrifüj edin.
Plakanın soğutulmasına izin vermeyin, çünkü bu kuyularda yoğuşma birikmesine neden olabilir ve absorbans okumalarını gizleyebilir. Plakanın üst yüzeyindeki kuyuları, çözeltileri dağıtırken kullanılanla aynı sırayı kullanarak 0,25 milimetre çapında bir iğne ile donatılmış iğne prob aracı ile delin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için çözeltiler arasındaki iğneyi silin.
Plakayı çevirin ve alttaki kuyuları delin. Kapağı olmayan 630 nanometrede plakanın emiciliğini okuyun. Yoğuşma halkalarının delikli kuyuları çevrelemesini sağlamak için üst sızdırmazlık filminin üzerine bir iç kapak yerleştirin, ardından dış kapağı plakaya yerleştirin.
Besleyici plakasını bağlayıcının üzerine, kılavuzların besleyici plakasının ve açlık plakasının uygun deliklerini hizalayıp hizalayıp hizalayana kadar yerleştirin. Bağlayıcının ve plakaların doğru yönlendirildiğine emin olun. Tüm besleyici plakaları bağlayıcılara yüklendikten sonra, bağlayıcı üzerindeki bariyer şeritlerini ayarlayarak plakaların kuyularını açın.
Bağlayıcı ve plaka montajlarını ikincil kaba yerleştirin. Nem sağlamak için her ikincil kaba ıslatılmış kağıt havlu içeren bir pipet kutusunun alt yarısını yerleştirin. İkincil kabın kapağını kapatın ve kontrollü bir ortama aktarın.
Sineklerin 22 saat boyunca tüketmesine izin verin. 22 saatlik pozlamadan sonra, her plakayı ölü sinekler için kontrol edin ve plaka düzenini buna göre güncelleyin. Tüm plakalar kontrol edildikten sonra, ikincil kabın içine CO2 pompalayarak sinekleri toplu olarak uyuşturun.
Yaklaşık 60 saniye sonra, tüm sineklerin hareketsiz olduğundan emin olun. Sinekleri yavaşça açlık plakasına dokunun ve plastik bariyer şeritlerini değiştirin. Beslemek plakalarını okumak için çıkarın.
Plakanın emiciliğini 630 nanometrede yeniden oku. Tüm plakalar okunana kadar işlemi tekrarlayın. Buharlaşma her kuyu için ölçüldü ve bireysel plakaların kuyuları arasında herhangi bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için bulundu.
Buharlaşma ve sütunlara karşı buharlaşma için Pearson korelasyon katsayıları, buharlaşma ve kuyu konumları arasındaki eğilimleri değerlendirmek için hesaplanmıştır. Protokolün geçerliliğini belirlemek için üç ila beş günlük Kanton-SB sineklerinin tüketimi ölçüldü. Sineklere% 1 maya özü ile% 4 sakkaroz çözeltisi ile% 15 etanol ve% 1 maya özü ile desteklenmiş% 4 sakkaroz çözeltisi arasında bir seçim yapıldı.
Hem erkekler hem de dişiler etanol ve maya özü ile çözelti için ezici bir tercih gösterdi. Besleyici plakalarını oluştururken tutarlılığı korumak, her bir sineğin gıda hacmi, buharlaşma ve erişim açısından aynı tüketim senaryosuyla sunulmasını sağlamak önemlidir. Bu teknik, Drosophila alanındaki araştırmacıların geleneksel yöntemlere kıyasla daha yüksek aktarım hızına ve daha düşük maliyetle tüketim ve tercih davranışları için yüksek verimli tahliller yapmalarına izin verecektir.
Genel Bakış
Mikroplak besleyici testi, Drosophila beslenme davranışını kantitatif olarak ölçmek için yüksek verimli bir yöntem sağlar. Bu ekonomik yaklaşım, mikroplaklar arasında bağlantı sağlamak için 3D baskılı bir cihaz kullanarak sıvı yem tüketiminin verimli ölçümünü sağlar.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Davranışsal Biyoloji
- Entomoloji
Arka Plan
- Drosophila'da beslenme davranışı ölçmek, besin tercihlerini anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler iş gücü yoğun ve daha az verimli olabilir.
- Mikroplak besleyici testi bu süreci basitleştirir.
- Veri toplama için spektrofotometrik ölçümleri kullanır.
Çalışmanın Amacı
- Drosophila'da yem tüketimini değerlendirmek için yüksek verimli bir yöntem geliştirmek.
- Çeşitli besinlerin ve maddelerin nicellendirilmesini kolaylaştırmak.
- Beslenme davranışı çalışmalarının verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Beslenme testleri için agarose ve mikroplakların hazırlanması.
- Kontrollü beslenme deneyleri için sineklerin sıralanması ve anestezi uygulanması.
- Yem tüketimini kantitatif olarak ölçmek için absorbans ölçümü.
- Beslenme davranışı ve tercihlerindeki eğilimler için veri analizi.
Ana Sonuçlar
- Sinekler etanol ve maya özü içeren yiyeceğe tercih göstermiştir.
- Veri toplama, otomatik absorbans ölçümleriyle basitleştirilmiştir.
- Buharlaşma oranları kantitatif olarak ölçülmüş ve korelasyonlar için analiz edilmiştir.
- Test, yüksek verimli beslenme çalışmaları için etkili olduğu kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- Mikroplak besleyici testi, Drosophila araştırması için değerli bir araçtır.
- Beslenme davranışı ölçümünün verimli ve doğru şekilde yapılmasını sağlar.
- Bu yöntem çeşitli böcek türleri ve uygulamalar için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying consumption in model organisms supports target validation and phenotypic screening in early discovery. The microplate feeder assay enables high-throughput measurement of liquid food intake in Drosophila, providing quantitative data for mechanistic de-risking of nutritional, toxicological, or pharmacological interventions. This approach improves predictive confidence in lead identification by standardizing consumption metrics across large sample sets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals in a genetically tractable model.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, absorbance-based measurement of liquid food intake.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating reproducible consumption data for compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by isolating individual fly consumption in multi-well formats.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through sealed microplates and controlled evaporation correction.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse via 3D-printed couplers that synchronize 96- and 1536-well microplates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling dose-response analysis of consumable compounds.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value when assessing behavioral responses to substances like ethanol or yeast extract.
- Disease-Relevant System: Supports studies of consumption-associated traits with environmental and pharmacological variables.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting quantitative behavioral phenotyping.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through quantified liquid food intake.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via absorbance measurements before and after consumption.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including evaporation correction and Pearson correlation analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it via preference testing between sucrose and ethanol-supplemented solutions.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through 3D-printed couplers and sealing protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in consumption-related phenotypes.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through microplate-based absorbance readings and barrier strip controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling high-throughput preference and consumption assays.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative intake data across compound libraries.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in Drosophila handling, microplate preparation, and spectrophotometry.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include plate readers capable of 630 nm absorbance and 3D-printed coupler systems.
- Cross-team standardization requirements for sealing, perforation, and environmental controls to minimize condensation and evaporation artifacts.
- Adaptation considerations across model systems, noting potential for extension to other insect species with modified food formulations.
- Practical limitations supported by source material: evaporation must be quantified and corrected; chilling plates causes condensation that obscures readings; consistent orientation of coupler and microplates is required for proper well access.
