Drosophila'da Tüketimin Nicelleştirilmesi için Yüksek Verimli Mikro Plaka Besleyici Tahlili

Mikro plaka besleyici tahlili, Drosophila besleme davranışını ölçmek için basit, yüksek verimli, ekonomik bir yöntem sağlar ve diğer, daha ayrıntılı yöntemlere göre birden fazla avantaj sunar. Absorbansı bir plaka okuyucu ile ölçerek tüketimi ölçmek manuel ölçümleri ortadan kaldırır ve manuel veri girişini ortadan kaldırır. Veriler programlı ekstraksiyon ve işleme için de uygun.

Bu yüksek verimli test ile suda çözünen besin maddelerinin, ilaçların, farmasötiklerin veya toksinlerin tüketimini ölçebiliriz ve sistem çeşitli böcek türlerine uygulamalar için değiştirilebilir. Erimiş agarose'u bir reaktif oluğuna dökerek başlayın ve çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyulu bir mikro plakanın her kuyusuna 80 mikrolitre erimiş agarose dağıtın. Kalan agarose'u kapalı bir torbada bir haftaya kadar soğutun ve ek plakalar yapmak için yeniden eritin.

Bariyer şeritleri çok gevşekse, onları kanallarda tutmak için eğrilik vermek için parmağın etrafına sarın. Bağlayıcıları hazırlamak için bariyer şeritlerini bariyer şeridi kanallarına yerleştirin. Bağlayıcıyı bir açlık plakasına yapıştırın, bağlayıcı kayabileceğinden plakayı manipüle etmek için bağlayıcıyı kullanmamaya dikkat edin.

Doğru yönlendirmeyi korumak için bağlayıcının açılı köşesinin mikro plakanın açılı köşesine eşleştiğinden emin olun. CO2 anestezisi altında, üç ila beş günlük sinekleri sıralayın. Tek tek sinekleri sütunla açlık plakasına yükleyin.

Bariyer şeridini kapalı konuma ayarlayarak her sütunu doldururken kapatın. Numune düzenini mikro plaka içinde dikkatlice kaydedin. Açlık plakası doldurulduktan sonra, sineklerin CO2'yi çıkardıktan sonra kendiliğinden iyileşmesine izin verin ve ilk anestezi sürelerinden başlayarak altı saat aç bırakın.

10 mililitre damıtılmış suda 0,4 gram sakkaroz ve 0,1 gram maya ekstresini eriterek 15 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre sıvı gıda hazırlayın. Katı maddeler tamamen çözünene kadar tüpü girdapla. 40 mikrolitre boya stok çözeltisi ekleyin ve sıvı gıdayı 0,45 mikrometre filtre ile uçlanmış 10 mililitrelik bir şırıngaya aktarın.

Çözeltinin yaklaşık 1,5 mililitresini aynı anda 1,7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne filtreleyin. Çözeltiyi içeren şırınnayı bir kenara koyun ve besleyici plakası hazırlığı sırasında ek çözeltiyi gerektiği gibi filtreleyin. 1536 kuyulu bir mikro plakanın altını sızdırmazlık filmiyle kapatarak bir besleyici plakası hazırlayın.

Filme iyice yapışmak için bir sızdırmazlık raketi kullanın. Ardından, fazla filmi bir jiletle sol ve sağ kenarlardan kesin. Filtrelenmiş sıvı gıda kolonunun 10 mikrolitresini, 1536 kuyulu mikro plakanın dört kuyusunun her bir kümesi için sol üst kuyuya dağıtın.

Tüm kuyular doldurulduktan sonra, mikro plakanın tabanını kapatmak için kullanılan adımları izleyerek plakanın üstüne bir sızdırmazlık filmi uygulayın. İstediğiniz sayıda plaka için tekrarlayın. Sıvıyı yerleştirmek için plakaları 10 saniye boyunca 200 kez G'de santrifüj edin.

Plakanın soğutulmasına izin vermeyin, çünkü bu kuyularda yoğuşma birikmesine neden olabilir ve absorbans okumalarını gizleyebilir. Plakanın üst yüzeyindeki kuyuları, çözeltileri dağıtırken kullanılanla aynı sırayı kullanarak 0,25 milimetre çapında bir iğne ile donatılmış iğne prob aracı ile delin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için çözeltiler arasındaki iğneyi silin.

Plakayı çevirin ve alttaki kuyuları delin. Kapağı olmayan 630 nanometrede plakanın emiciliğini okuyun. Yoğuşma halkalarının delikli kuyuları çevrelemesini sağlamak için üst sızdırmazlık filminin üzerine bir iç kapak yerleştirin, ardından dış kapağı plakaya yerleştirin.

Besleyici plakasını bağlayıcının üzerine, kılavuzların besleyici plakasının ve açlık plakasının uygun deliklerini hizalayıp hizalayıp hizalayana kadar yerleştirin. Bağlayıcının ve plakaların doğru yönlendirildiğine emin olun. Tüm besleyici plakaları bağlayıcılara yüklendikten sonra, bağlayıcı üzerindeki bariyer şeritlerini ayarlayarak plakaların kuyularını açın.

Bağlayıcı ve plaka montajlarını ikincil kaba yerleştirin. Nem sağlamak için her ikincil kaba ıslatılmış kağıt havlu içeren bir pipet kutusunun alt yarısını yerleştirin. İkincil kabın kapağını kapatın ve kontrollü bir ortama aktarın.

Sineklerin 22 saat boyunca tüketmesine izin verin. 22 saatlik pozlamadan sonra, her plakayı ölü sinekler için kontrol edin ve plaka düzenini buna göre güncelleyin. Tüm plakalar kontrol edildikten sonra, ikincil kabın içine CO2 pompalayarak sinekleri toplu olarak uyuşturun.

Yaklaşık 60 saniye sonra, tüm sineklerin hareketsiz olduğundan emin olun. Sinekleri yavaşça açlık plakasına dokunun ve plastik bariyer şeritlerini değiştirin. Beslemek plakalarını okumak için çıkarın.

Plakanın emiciliğini 630 nanometrede yeniden oku. Tüm plakalar okunana kadar işlemi tekrarlayın. Buharlaşma her kuyu için ölçüldü ve bireysel plakaların kuyuları arasında herhangi bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için bulundu.

Buharlaşma ve sütunlara karşı buharlaşma için Pearson korelasyon katsayıları, buharlaşma ve kuyu konumları arasındaki eğilimleri değerlendirmek için hesaplanmıştır. Protokolün geçerliliğini belirlemek için üç ila beş günlük Kanton-SB sineklerinin tüketimi ölçüldü. Sineklere% 1 maya özü ile% 4 sakkaroz çözeltisi ile% 15 etanol ve% 1 maya özü ile desteklenmiş% 4 sakkaroz çözeltisi arasında bir seçim yapıldı.

Hem erkekler hem de dişiler etanol ve maya özü ile çözelti için ezici bir tercih gösterdi. Besleyici plakalarını oluştururken tutarlılığı korumak, her bir sineğin gıda hacmi, buharlaşma ve erişim açısından aynı tüketim senaryosuyla sunulmasını sağlamak önemlidir. Bu teknik, Drosophila alanındaki araştırmacıların geleneksel yöntemlere kıyasla daha yüksek aktarım hızına ve daha düşük maliyetle tüketim ve tercih davranışları için yüksek verimli tahliller yapmalarına izin verecektir.