Name: Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Öğrenin, yüksek sıcaklıkta (70 °C'ye kadar) kriyojenik elektron mikroskobisi için numune ızgaraları hazırlama protokolünü. Bu yöntem, protein yapılarının sıcaklık bağımlılığını anlamayı kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, yararlı tavsiyeler için Thermo Fisher Scientific'ten Dr. Hervé Remigy'ye teşekkür eder. Kriyo-EM deneyleri Academia Sinica Cryo-EM Tesisi'nde (ASCEM) gerçekleştirildi. ASCEM, Academia Sinica (Hibe No. AS-CFII-108-110) ve Tayvan Protein Projesi (Hibe No. AS-KPQ-109-TPP2). Yazarlar ayrıca numune hazırlama konusundaki yardımları için Bayan Hui-Ju Huang'a teşekkür eder.

NOT: Bu protokol, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) örneklerini belirli sıcaklıklarda, özellikle 37 ° C'den daha yüksek sıcaklıklarda hazırlamak için modifiye edilmiş bir ticari vitrifikasyon aparatı kullanmayı amaçlamaktadır. Genel deney düzeni Şekil 1'de gösterilmiştir. Protokol örnek olarak 55 ° C kullanır. Diğer sıcaklıklardaki özel koşullar için lütfen referans12'deki Ek Tablo 2'ye bakın.
1. Vitrifikasyon aparatının hazırlanması
<ol><li>Kapalı ucunda 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 1 cm'lik bir delik açın.</li>
	<li>Tüpü, Şekil 2'de gösterildiği gibi, ultrasonik su çıkışındaki vitrifikasyon aparatı odasına yerleştirin. NOT: Amaç, tüm odaya ulaşmadan önce su buharını borudan ısı eşanjörüne yönlendirerek su yoğuşmasını en aza indirmektir.</li>
	<li>Vitrifikasyon aparatı sıcaklığını belirtilen sıcaklığa ayarlayın (örneğin, Şekil 3'te gösterildiği gibi 55 ° C) ve vitrifikasyon aparatı odasının 55 ° C'ye ve% 100 bağıl neme ulaşmasına izin verin. Deneye başlamadan önce koşulları stabilize etmek için en az yarım saat bekletin.</li>
</ol>2. Numunenin ve aletlerin ısıtılması
<ol><li>Su banyosunu bir ocak üzerine yerleştirin ve ocak plakasını istenen sıcaklığa ayarlayın (burada 55 ° C). Suyun 55 ° C'ye ulaştığından emin olmak için bir termometre ile kontrol edin.</li>
	<li>Numuneyi su banyosunda inkübe edin ve kurutma deneyinden önce ocak plakasının kenarındaki pipet ucunu 2 dakika veya daha uzun süre önceden ısıtın. NOT: Vitrifikasyon aparatı haznesi için en yüksek sıcaklık ayarı 60 °C'dir. Cyro-EM deneyi için daha yüksek sıcaklık ızgaraları hazırlamak üzere (örneğin, 70 ° C), numune 80 ° C'de su banyosunda inkübe edilir ve numune sıcaklığı ile vitrifikasyon aparatı sıcaklığı arasındaki ortalamanın, numunenin ızgaradaki gerçek sıcaklığı olduğu tahmin edilir (bu durumda 70 ° C). Bu tahminle ilgili daha fazla ayrıntı ve sınırlama için Tartışma bölümüne bakın.</li>
</ol>3. Lekeleme deneyine hazırlık
<ol><li>Işıtma, 30 s için 25 mA'da delikli karbon destekli bir ızgarayı boşaltır veya kullanılan cihaza bağlı olarak değerlere alternatif olarak boşaltır.</li>
	<li>Cımbızları vitrifikasyon aparatındaki ızgara ile 2 dakika veya daha uzun süre inkübe edin.</li>
	<li>Etan kabını standart prosedürlere göre etan ile doldurun. Etan'ın taşmasına izin vermeyin. NOT: Bu adım yaklaşık 10 dakika sürer ve donmayı önlemek için lekeleme deneyi ile hemen takip edilmelidir.</li>
	<li>Vitrifikasyon filtre kağıdını, lekeleme deneyinden en geç 5 dakika önce vitrifikasyon aparatı haznesine yerleştirin. NOT: Filtre kağıdının hazneye çok erken yerleştirilmesi çok ıslanmasına neden olur.</li>
</ol>4. Lekelenme deneyi
NOT: Izgarayı tutarken, ızgaranın sabit olduğundan ve cımbızla minimum temas alanı olduğundan emin olun (Şekil 4). Bu, etan'ın en iyi soğutma verimliliğini korumak ve vitröz olmayan buzdan kaçınmak için yapılır.
<ol><li>Numunenin 7-9 μL'sini ızgaraya uygulamak için bir pipet ucu kullanın. Ardından 1-2 s bekleyin, 1-1.5 s için lekeleyin ve numuneyi hızlı bir şekilde sıvı etan'a batırın.</li>
	<li>Izgarayı sıvı etandan, sıvı azotta depolanan kriyo kutusuna aktarın. NOT: Bu adım çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir, çünkü cımbız hala sıcaktır, bu nedenle tüm soğutma tankı şu anda buharla doludur.</li>
</ol>5. Izgaralar için kalite kontrolü
<ol><li>Izgaraları kırpın ve bir kriyo-EM cihazına yükleyin.</li>
	<li>Izgaradaki buz durumunu ve numunenin ızgaradaki dağılımını taramak için kriyo-EM cihazının ekran ekranını ve yazılımın düşük doz işlevini kullanın. NOT: Çoğu zaman, ızgaralar çok kurudur veya buz tabakası çok kalındır. Yüksek sıcaklıklarda hazırlanan ızgaraların başarı oranı, oda sıcaklığında veya 4 °C'dekinden önemli ölçüde daha düşüktür. İyi ızgaraların ve tatmin edici olmayan ızgaraların temsili sonuçları bir sonraki bölümde gösterilmiştir.</li>
	<li>Elde edilen ızgaranın kalitesi iyi değilse, ızgara hazırlama işlemini çeşitli koşullarla (bekleme süresi, lekelenme süresi vb.) tekrarlayın. Elde edilen ızgaranın kalitesi iyiyse, ızgaraları farklı bir sıcaklıkta yapmak için aynı adımları tekrarlayın.</li>
</ol>6. Veri toplama
<ol><li>Kaliteli ızgaraları yüksek çözünürlüklü bir kriyo-EM cihazına aktarın.</li>
	<li>Belirlenen prosedürlere göre veri toplama ve veri analizleri gerçekleştirin. NOT: Önceki yayınımızda gösterildiği gibi, yapının çözünürlüğü yüksek sıcaklık12'den etkilenmez.</li>
</ol>

<ol><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li>
<li>Cabra, V., Samsó, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+of+cryo-electron+microscopy%3A+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).</li>
<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+speed%3A+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+operating+principles+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li>
<li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structure+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Protokolün 1. adımında, santrifüj tüpünün iyi monte edildiğinden ve deney devam ederken düşmediğinden emin olun. Haznede, filtre kağıdının adsorpsiyon kapasitesini değiştirebilecek çok sayıda su damlacığının birikmesi nedeniyle, vitrifikasyon aparatı haznesi denge sıcaklığına ulaştıktan sonra deneyin toplam süresinin 30 dakikayı geçmemesi önerilir. Çalışma süresi 30 dakikayı aşarsa, operatörün filtre kağıdını değiştirmesi ve kabinin sıcaklık ve nemi tekrar dengelemesini beklemesi gerekir. Protokolün 8. adımında, önerilen...

Protein komplekslerinin yapılarını çözmek için kriyo-EM teknolojisi, özellikle yüksek çözünürlüklü yapıların elde edilmesi yönünde gelişmeye devam etmiştir 1,2. Bu arada, vitrifikasyon prosesinden önce pH veya ligandlar gibi numune koşullarının değiştirilmesiyle uygulama alanı da genişletilmiştir3, bu da numune ızgaralarının hazırlanmasını ve ardından dalma dondurma 4,5'i içerir. Bir diğer önemli koşul sıcaklıktır. X-ışını kristalografisi gibi kriyo-EM deneyleri düşük sıcaklıklarda yapılmasına rağmen, kriyo-EM ile çözülen yapı, vitrifikasyondan önceki çözelti durumundaki yapıyı yansıtır. Yakın zamana kadar, tek parçacık analizi (SPA) kriyo-EM çalışmalarının çoğu, vitrifikasyon6'dan önce buz üzerinde (yani 4 ° C'de) tutulan örnekleri kullanır, ancak bir dizi çalışma oda sıcaklığında 7,8,9,10 veya 42 ° C 11 kadar yüksek numuneler kullanır. Yakın tarihli bir raporda, termofilik arkeon Sulfolobus solfataricus'tan (Sso) ketol-asit redüktoizomeraz (KARI) enziminin sıcaklığa bağlı çalışmalarını 4 ° C ila 70 ° C12 arasında altı farklı sıcaklıkta gerçekleştirdik. Çalışmalarımız, fonksiyonel olarak ilgili sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamanın önemli olduğunu ve kriyo-EM'nin aynı protein kompleksinin yapısını çoklu sıcaklıklarda çözmek için pratik olarak mümkün olan tek yapısal yöntem olduğunu göstermektedir.
Yüksek sıcaklıklarda vitrifikasyon için en büyük zorluk, buhar yoğuşmasını en aza indirmek ve ince buz elde etmektir. Burada, Sso-KARI 12 ile ilgili önceki çalışmamızda yüksek sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamak için kullanılan ayrıntılı protokolü sunuyoruz. Okuyucuların veya izleyicilerin kriyo-EM deneyleri için genel numune hazırlama ve veri işleme prosedürlerinde zaten deneyimli olduklarını varsayıyoruz ve yüksek sıcaklıkla ilgili yönleri vurguluyoruz.

<table><tbody><tr><td>Falcon tüpü</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>boyutu: 50 mL</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Ted Pella</td><td>47000-100</td><td>&Oslash; 55 / 20mm, Sınıf 595</td></tr><tr><td>HI1210</td><td>Leica</td><td></td><td>su banyosu</td></tr><tr><td>K100X</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td></td><td>kızdırma deşarjı</td></tr><tr><td>Quantifoil, 1.2 / 1.3 200Mesh Cu ızgara</td><td>Ted Pella</td><td>658-200-CU-100</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios G3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>1063996 düşük doz görüntüleme</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Cımbız</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr></tbody></table>

cryo-em için yüksek sıcaklık numune izgaralarının hazırlanması

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) deneyleri için numune ızgaraları genellikle biyolojik numunelerin depolanması için en uygun sıcaklıkta, çoğunlukla 4 ° C'de ve bazen oda sıcaklığında hazırlanır. Son zamanlarda, düşük sıcaklıkta çözülen protein yapısının, özellikle termofilik arkelerden gelen proteinler için işlevsel olarak alakalı olmayabileceğini keşfettik. Kriyo-EM analizi için daha yüksek sıcaklıklarda (70 ° C'ye kadar) protein örnekleri hazırlamak için bir prosedür geliştirilmiştir. Daha yüksek sıcaklıklarda hazırlanan numunelerden elde edilen yapıların işlevsel olarak alakalı ve sıcaklığa bağlı olduğunu gösterdik. Burada, örnek olarak 55 °C kullanarak numune ızgaralarını yüksek sıcaklıkta hazırlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Deney, ek bir santrifüj tüpü kullanılarak modifiye edilmiş bir vitrifikasyon aparatı kullandı ve numuneler 55 ° C'de inkübe edildi. Ayrıntılı prosedürler, buhar yoğuşmasını en aza indirmek ve ızgarada ince bir buz tabakası elde etmek için ince ayarlandı. Başarılı ve başarısız deneylere örnekler verilmiştir.

Düşük büyütmeye genel bakış Şekil 5A,B'de gösterilmiştir. Panel A, başarılı bir ızgara örneğidir. Sol üstten (daha kalın) sağ alta (daha ince veya boş) bir buz gradyanı vardır. Böyle bir ızgara, mavi ve yeşil kutular gibi veri toplama için uygun orta alanda uygun bir buz tabakası kalınlığı bulmayı kolaylaştırır. B ızgarası çok kuru. Izgaradaki kareler parlak kontrasta sahiptir, bu da buz tabakasının çok ince olduğu veya hiç buz tabakası olmadığı anlamına gelir. Yalnızca kırm...

Bu makale, kriyo-EM deneyleri için donma işlemine dalmadan önce, 70 ° C'ye kadar yüksek sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Proteinlerin fonksiyonları sıcaklığa bağlıdır ve sıcaklıkta optimaldir. Bu protokol, protein yapılarını daha yüksek sıcaklıklarda çözmenin bir yolunu sağlar. Bu yaklaşım, işlevsel olarak ilgili yapıları sağlayabilir ve protein yapılarının sıcaklığa bağımlılığının anlaşılmasını artırabilir.Prosedürü gösteren, Academia Sinica Cryo EM tesisinin Müdürü Yuan-Chih Chang olacak. Kapalı ucundaki 50 milimetrelik bir santrifüj tüpünde bir santimetrelik bir delik açarak başlayın. Tüpü ultrasonik su çıkışındaki vitrifikasyon aparatı odasına yerleştirin.Vitrifikasyon aparatı sıcaklığını belirtilen sıcaklığa ayarlayın ve vitrifikasyon aparatı odasının 55 santigrat dereceye ve% 100 bağıl neme ulaşmasına izin verin. Deneye başlamadan önce koşulları stabilize etmek için en az yarım saat bekletin. Su banyosunu bir sıcak plakaya yerleştirin ve sıcak plakayı istenen sıcaklığa ayarlayın.Suyun 55 santigrat dereceye ulaştığından emin olmak için bir termometre ile kontrol edin. Numuneyi su banyosunda inkübe edin ve kurutma deneyinden önce sıcak plakanın kenarındaki pipet ucunu iki dakika veya daha uzun süre önceden ısıtın. Işıltı, 25 miliamperde delikli karbon destekli bir ızgarayı 30 saniye boyunca boşaltır.Vitrifikasyon filtre kağıdını, lekeleme deneyinden en geç beş dakika önce vitrifikasyon aparatı odasına yerleştirin. Cımbızları vitrifikasyon aparatındaki ızgara ile iki dakika veya daha uzun süre inkübe edin. Etan kabını standart prosedürlere göre etan ile inşa edin ve etanın taşmamasını sağlayın.Numunenin yedi ila dokuz mikrolitresini ızgaraya uygulamak için bir pipet kullanın. Ardından bir ila iki saniye bekleyin, bir ila bir buçuk saniye lekeleyin ve numuneyi hızlı bir şekilde sıvı etan'a batırın. Izgarayı sıvı etandan sıvı azotta depolanan kriyo kutusuna aktarın.Elektron mikroskobu veya Cryo EM cihazı elde etmek için ızgaraları kırpın ve boşaltın. Cryo EM cihazının ekran ekranını ve yazılımın düşük doz fonksiyonunu kullanarak ızgaradaki buz durumunu ve numunenin ızgaradaki dağılımını görüntüleyin. Elde edilen ızgaranın kalitesi iyi değilse, ızgara hazırlama işlemini bekleme süresi, lekelenme süresi vb. gibi çeşitli koşullarla tekrarlayın.Elde edilen ızgaranın kalitesi iyiyse, ızgaraları farklı bir sıcaklıkta yapmak için aynı adımları tekrarlayın. Kaliteli ızgaraları yüksek çözünürlüklü bir Cryo EM cihazına aktarın. Belirlenen prosedürlere göre veri toplama ve veri analizleri gerçekleştirin.Başarılı ızgara durumunda, ızgaranın sol üst köşesinde daha kalın buz ve sağ altta daha ince buz ile bir buz gradyanı oluşur. Başarılı ızgarada veri toplamaya uygun mavi ve yeşil kutular gözlenmiştir. Diğer ızgarada parlak bir kontrast gözlendi.İnce bir tabakayı, buz tabakasını veya buz yokluğunu gösterir. İkinci ızgarada veri toplama için sadece iki karenin uygun olduğu bulunmuştur. Izgaralardan biri, çoğunlukla veri toplama için uygun olmayan kristalin formundaki buzdan oluşuyordu.Öte yandan, diğer ızgara buz tabakasının çoğunlukla veri toplama için uygun amorf bir durumda olduğunu gösterdi. Bir kap olarak hazırlanması ve diğerlerinin bir zaman noktasına göre tamamlanması gerekir. Zaman kontrolü ve deneyin hızlı ve doğru bir şekilde bitirilmesi en önemlisidir.Bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçlara bağlı olarak, araştırmacının basit koşulları oluştururken daha dikkatli olması gerekebilir.

preparation-of-high-temperature-sample-grids-for-cryo-em

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Burada, hem hızlı ızgara yapımı hem de zaman çözümlenmiş deneyler yapmak için hızlı karıştırma ve dondurma için hızlı ızgara yapma cihazının kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Zaman Çözümlü Cryo-Elektron Mikroskopisi için Hızlı Şebeke Hazırlığı

Burada sunulan protokol, sıvı kriyojende vitrifikasyondan önce en az 90 ms karıştırılan kendi kendine fitillenen nanotel ızgaraya iki ilgi örneği sunmak için yeni bir robotik sistem olan Spotiton'un kullanımını açıklamaktadır.

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

Verilerin sinyal-gürültü oranı, mikrokristallerden X-ışını kırınım ölçümlerinin yapılmasında en önemli hususlardan biridir. VMXm kiriş çizgisi, bu tür deneyler için düşük gürültülü bir ortam ve mikrobülans sağlar. Burada, VMXm ve diğer mikro odak makromoleküler kristalografi kiriş hatları için mikrokristallerin montajı ve soğutulmasından dolayı örnek hazırlama yöntemlerini açıklıyoruz.

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Bu makale, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örnekleri manuel olarak dondurmak için leke ve dalma yöntemini özetlemektedir.

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Burada, kriyo-elektron tomografisi için hücresel numunelerin hazırlanmasına rehberlik etmek için 3D bağıntılı odaklanmış iyon ışını frezeleme için bir boru hattı sunuyoruz. İlgilenilen floresan etiketli proteinlerin 3 boyutlu konumu önce kriyo-floresan mikroskobu ile belirlenir ve daha sonra öğütme için hedeflenir. Protokol memeli, maya ve bakteri hücreleri için uygundur.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Bu yöntem, in situ hücresel kriyotomografi ve korelasyon ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) için elektron mikroskobu (EM) ızgaralarının hazırlanması için erişilebilir ve esnek bir protokol sağlar.

Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

Kriyo-elektron mikroskobu ile zorlu makromoleküler numunelerin yapısal çalışmalarında kullanılmak üzere streptavidin afinite ızgaralarının üretilmesi için adım adım bir protokol sağlanmıştır.

Kriyo-Elektron Mikroskobu Numune Hazırlama için Streptavidin-Afinite Izgarası İmalatı

Bu protokol, numune hazırlama optimizasyonu yoluyla eşit olmayan parçacık dağılımını ele almak için bir örnek olarak Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) kullanan pratik bir yöntem sunar ve araştırmacılara kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) kullanarak makromoleküler yapıları verimli bir şekilde aydınlatmaları için bir referans sağlar.

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

Öğrenin, yüksek sıcaklıkta (70 °C'ye kadar) kriyojenik elektron mikroskobisi için numune ızgaraları hazırlama protokolünü. Bu yöntem, protein yapılarının sıcaklık bağımlılığını anlamayı kolaylaştırır.

Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

Daha fazla video keşfet