Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

Bu makale, ex vivo deneyleri için yeni bir bağırsak organ kültürü sistemi kullanarak konak mikrobiyom etkileşimlerini analiz etmek için benzersiz bir yöntem salamaktadır.

Bağırsak organ kültürü sistemi in vitro ve in vivo tahlillerin avantajlarını birleştirir ve böylece basit in vitro tahliller ile karmaşık in vivo deneyler arasında bir ara deneysel adım görevi görür. Bu tekniğin temel avantajı, sıkı deneysel kontrolün bağırsak fizyolojisinin korunması ile kombinasyonudur. Bu yöntem, konak, mikrobiyal ve çevresel bileşenler üzerinde yüksek düzeyde kontrole sahip belirli uyaranlara bağırsak yanıtlarını analiz etmek için içgörü sağlar.

Prosedürü gösterenler laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Alon Shemesh ve laboratuvar müdürümüz Dr. Sivan Amidror olacak. Başlamak için, künt uçlu iğneleri cihaz kalıbı içinde uygun konuma getirin ve cihazın ve kapağın bir seti için yaklaşık 20 gram polidimetilsiloksan veya PDMS karışımı dökün. Hava kabarcıklarını PDMS karışımından çıkarmak için kalıpları 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin, ardından PDMS polimerizasyonunu tamamlamak için kalıpları bir gecede 55 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

PDMS ayarlandığında, iğneleri kalıptan çıkarın ve kültür cihazını ve kapağı plastik kalıplardan dikkatlice serbest bırakın. Pdms kalıntılarını bir cerrahi bıçak kullanarak kuyu anahattından çıkarın. PDMS cihazını ve cihaz kapağını toksik olmayan silikon yapıştırıcı kullanarak 75 ila 50 milimetrelik bir kapak camına takın ve parçaları gece boyunca ayarlamak için bırakın.

Yapıştırılmışı cihazın pürüzsüz tarafına uygulayın. Lümen için 12, 22 ölçer iğne ve kuyu için 12, 18 ölçer iğne yerleştirin. Silikon kullanarak tüm iğneleri yerinde sabitle ve gece boyunca ayarlasın.

Giriş şırınmalarını temizle ve kuyu ortamının tüm tüplerden bir atık cama aktığından emin olun, ardından giriş şırınnalarını temizleyin ve farklı stimülasyonları kirletmemeye dikkat ederek stimülasyonların tüm tüplerden atık bir bardağa akmasını sağlar. Fareyi feda ettikten sonra, tüm yağ ve bağ dokularını keserek, onu parçalamak ve sindirim sistemini mideden anüse çıkarmak için keskin makas ve tokmak kullanın. Kolonu kesin ve yeni bir tabağa yerleştirin.

Dokuyu hafifçe ve sadece kenarlarda tutarken teması en aza indirin. Kolon yıkamayı bir diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirin. Kolon içeriğini metinde açıklandığı gibi hazırlanan 10 mililitre şırınna ile steril IMDM ile hafifçe yıkayın.

Dışkıyı bağırsak dokusundan çıkardıktan sonra, kolonu 0,5 mililitre steril IMDM ile dolu yeni bir altı kuyu plakasına yerleştirin. Daha sonra, kolon dokusunu alın ve iki iplikle sıkı bir bağ yaparak 22 kalibrelik iğneye dikkatlice bağlayın. İki nokta üst üste lümen akışına doğru yönlendirmeyi koruyun, böylece proksimal ve distal sırasıyla giriş ve çıkışa eşittir.

Tüm dokular için kolon yıkama ve iğneyi tekrarlayın. Giriş ve çıkış tüplerini cihaza bağlayın, ardından pompaları istediğiniz oranlarda çalıştırarak deneye başlayın. Ki67 lekelemede belirtildiği gibi, kolonik epiteldeki mukus dolu kadeh hücreleri ve lümen içindeki mukus salgısı ve kolonik mahzenlerde çoğalma IEC'si tespit edildi.

Bu sonuçlar bağırsak kültürü sisteminin bağırsak fonksiyonunu ve yapısı ex-vivo'yu koruduğunu göstermiştir. İki saatlik segmentli filamentli bakteriler veya SFB, girişten sonra, floresan in situ hibridizasyon kullanılarak ince bağırsak villi ile yakın ilişkide tipik SFB filamentleri tespit edildi. Ek olarak, bir iletim elektron mikroskopisi ince bağırsak epitel fırçası sınırının birkaç mikron içinde SFB sundu.

Tüm doku örneklerinin gen ekspresyon profilleri SFB ile infüzyondan iki saat sonra üç taraflı olarak üretildi. Kontrol kültürleri mikropsuz veya Bacteroides fragilis monokolonize farelerin dışkı süspansiyonları ile aşılandı. SFB tarafından ikna edilen bu değişiklikler, mikropsuz kontrole kıyasla çoğunlukla küçük genlikteydi.

Kolonun yönü son derece önemlidir. Kolonu iğneye tanırken ekstra dikkatli olun. Uygun kravat, kuyunun lümen içeriği ile kirlenmesini önleyecektir.

Yeni nesil sıralama, görüntüleme, hücre sıralama ve daha fazlası gibi çok çeşitli okuma teknikleri bu protokolü izleyebilir. Bu okumalar, sağlık ve hastalıkta konak mikrobiyom etkileşimleri hakkında yeni bilgiler sağlar.