Name: Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Öğrenin, bağırsak organ kültürü sistemiyle konak-mikrobiyota etkileşimlerini analiz etmeyi. Bu yöntem, deneysel kontrol ile bağırsak fizyolojisinin korunmasını birleştirerek mikrobiyom araştırmalarında değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yissachar laboratuvarının geçmiş ve şimdiki üyelerine bağırsak organ kültürü sistemi protokolünü optimize etmedeki değerli katkıları için teşekkür ederiz. Yael Laure'ye makalenin eleştirel düzenlemesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (3114831 No. hibe), İsrail Bilim Vakfı - Broad Institute Ortak Programı (8165162 Sayılı hibe) ve gassner Tıbbi Araştırma Fonu, İsrail tarafından desteklendi.

Bu protokol, hayvan refahı etik komitesi tarafından onaylanan hayvan bakım yönergelerini izler.
1. Deney hazırlığı
<ol><li>Bağırsak organ kültürü cihazının imalatı (3 gün)<ol>
<li>3D yazıcı kullanarak, organ kültürü cihazı için yeniden kullanılabilir plastik kalıpları yazdırın (cihazda 24 küçük ve büyük delikli 6 kuyu ve cihaz kapağı kapağı vardır) (3D dosyalar eklenmiştir). NOT: Bu plastik kalıplar çok sayıda cihazın imalatı için kullanılabilir.</li>
		<li>Künt uçlu iğneleri (22 G & 18 G) cihaz kalıbı içinde uygun konuma getirin ve cihazın ve kapağın bir seti için yaklaşık 20 g polidimetilsiloksan (PDMS) karışımı (1:10 ağırlık oranı, tabandan katalizöre) dökün.</li>
		<li>Hava kabarcıklarını PDMS karışımından çıkarmak için kalıpları 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin.</li>
		<li>PDMS polimerizasyonunu tamamlamak için kalıpları bir gecede 55 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>PDMS ayarlandığında, iğneleri kalıptan çıkarın ve kültür cihazını ve kapağı plastik kalıplardan dikkatlice serbest bırakın.</li>
		<li>Pdms kalıntılarını bir cerrahi bıçak kullanarak kuyu anahattından çıkarın. PDMS cihazını ve cihaz kapağını toksik olmayan silikon yapıştırıcı kullanarak bir kapak camına (75 mm x 50 mm mikro slaytlar) takın ve parçaları gece boyunca ayarlamak üzere bırakın (yapıştırıcıyı cihazın pürüzsüz tarafına uygulayın).</li>
		<li>Lümen için on iki 22 G iğne ve kuyu için on iki 18 G iğne yerleştirin. Silikon kullanarak tüm iğneleri yerinde sabitle ve gece boyunca ayarlasın. Bağırsak organ kültürü cihazına uygun hava akışı için kapak kapağına iki adet 18 G iğne yerleştirin.</li>
		<li>Su dolu bir şırınga kullanarak tüm iğneleri sızıntılara karşı kontrol edin. Kuyuları su ile doldurarak kuyulardan sızıntı olup olmadığını kontrol edin.</li>
		<li>Kolona bağlanacak her 22 G iğneye iki cerrahi düğüm yerleştirin. Cihazı ve kapağı bir otoklav kese kağıdına yerleştirin ve bir otoklavda sterilize edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültür ortamı (0,5 saat)<ol>
<li>Biyolojik bir kaputun içinde, aşağıdakileri karıştırın (50 mL tüpte): 37 mL Iscove Modifiye Dulbecco'nun Ortası (IMDM), 10 mL KSR serum replasmanı, 1 mL B27 takviyesi, 0,5 mL N2 takviyesi, 0,5 mL 1 M HEPES tamponu ve 0,5 mL esansiyel olmayan amino asitler.</li>
		<li>Tüm ortamı filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Boru ve cerrahi takım hazırlama<ol>
<li>Giriş lümen, giriş kuyusu, çıkış lümen ve çıkış kuyusu (12 kısa tüp ve 12 uzun tüp) için uygun boru uzunluğunu kesin. Tüpün her iki tarafına uygun bir adaptör bağlayın.</li>
		<li>Cerrahi aletleri hazırlayın: düz makas, 4x ince kanat ve 2x keskin eleps.</li>
		<li>Tüpleri ve cerrahi aletleri bir otoklav kağıt torbasına yerleştirin ve bir otoklav kullanarak sterilize edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Işıltı girişini hazırlayın (istenen stimülasyon - bakteri, dışkı, ilaçlar vb.).<ol>
<li>Deneyden önce, bakteri kültürünün bakteri yükünü, seri seyreltmeler12ve aerobik ve / veya anaerobik koşullar altında kültürü belirleyin.</li>
		<li>Bakteri yükünü hesapladıktan sonra, gerekli bakteri konsantrasyonu elde etmek için steril doku kültürü ortamında bakteri kültürlerini seyreltin. Dışkı örnekleri için 100 μm süzgeç kullanarak filtreleyin. NOT: Nonbakteriyel stimülasyon (ilaçlar, metabolitler vb.) için, bağırsak kültürü ortamını kullanarak maddeyi gerekli konsantrasyona seyreltin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Deneme kurulum hazırlığı
<ol><li>Organ kültürü inkübatörünün içinde, ısıtıcı ünitesini açın ve 37 ° C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Pompaların yanı sıra giriş ve çıkış şırınnalarını da kurun.</li>
	<li>Doku kültürü ortam girişi<ol>
<li>Biyolojik veya laminer akış davlumbazında, giriş kuyusu şırınnalarını tam kültür ortamı ile doldurun. Son hacim deneyin süresine ve akış hızına bağlıdır; genellikle 1 mL/h artı temizleme için ek ortam.</li>
		<li>Luer-lock adaptörünü kullanarak tüpleri şırınna bağlayın. Dolu şırınnaları şırınna pompalarına yerleştirin.</li>
		<li>Giriş şırınnalarını temizle. Kuyu ortamının tüm tüplerden atık bir cama aktığından emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Işıltılı giriş<ol>
<li>Işınlama giriş şırınglarını stimülasyon tedavisi (bakteri, ilaç vb.) ile doldurun. Hacim, denemenin süresine ve akış hızına bağlıdır (genellikle 30 μL / s artı temizleme için ek ortam).</li>
		<li>Luer-lock adaptörünü kullanarak tüpleri şırınna bağlayın. Dolu şırınnaları şırınna pompalarına yerleştirin.</li>
		<li>Giriş şırınmalarını temizle. Stimülasyonun tüm tüplerden atık bir bardağa aktığından emin olun. Farklı stimülasyonları kirletmemeye dikkat edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çıkış<ol>
<li>Boş şırıngları çıkış şırıngır pompalarına yerleştirin (pompa modunu 'çekilme' olarak ayarlayın).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cihaz kurulumu<ol>
<li>Gaz karışımını (%95 O 2 +%5 CO2)kontrol eden regülatörü hafif ve minimum bir akış için ayarlayın.</li>
		<li>Cihazı laminar kaputta inceleyin.</li>
		<li>İğneleri yıkamak için cihazın iğnelerini steril IMDM ile yıkayın.</li>
		<li>Cihazın her kuyusuna 500 μL steril kültür ortamı ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku diseksiyonu için hazırlık<ol>
<li>Steril cerrahi aletleri laminar kaputun içine koyun.</li>
		<li>10 mL'lik bir şırıngayı steril IMDM ile doldurun ve kolonun yıkanması için steril (otomatik kapatılmış) 22 G künt uçlu bir iğne bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Organ kültürleri
<ol><li>Farelerin kurban ve doku diseksiyonu<ol>
<li>Laminar bir başlıkta, 12-14 günlük fareleri kafa keserek kurban edin. Fareleri% 70 etanol ile püskürtün ve fareleri plastik bir tabağa yerleştirin.</li>
		<li>Keskin makas ve tokmaklar kullanarak fareyi parçalara ayırın ve tüm yağ ve bağ dokularını keserek sindirim sistemini mideden anüse kadar çıkarın. Kolonu kesin ve yeni bir tabağa yerleştirin. NOT: Kolon dokusu ile teması en aza indirin. Kolon dokusunun orta kısmına dokunmayın. Dokuyu nazikçe ve sadece dokunun kenarlarında tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kolon yıkama ve yıkama<ol>
<li>Diseksiyon mikroskobu altında, kolon içeriğini steril IMDM (proksimal tarafa) ile hazırlanan 10 mL şırıngayla (adım 2.7.2) hafifçe yıkayın. Dışkıyı bağırsak dokusundan çıkardıktan sonra, kolonu 0,5 mL steril IMDM ile dolu yeni bir 6 kuyu plakasına yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İki nokta üst üste aygıtı bağlama<ol>
<li>Dokuyu alın ve 22 G iğneye dikkatlice bağlayın ve iki iplikle sıkı bir bağ yapın. Bu noktada, kolonun lümen akışına doğru yönelimini korumak zorunludur (proksimal = giriş, distal = çıkış). 6 doku için de 3.2-3.3 adımlarını tekrarlayın.</li>
		<li>Giriş iğnesi Luer kilitlerinin ortamdan boş olduğunu doğrulayın. Değilse, boşaltın. Giriş iğnesi Luer kilidine stimülasyonlar ekleyin (hava kabarcıklarının lümene girmesini önlemek için). Uygun uyarılma ile her iki nokta üst üste için bu adımı tekrarlayın.</li>
		<li>Tüm dokuların bağlı olup olmadığını kontrol edin ve kapak kapağını cihazın üzerine yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organ kültürü cihazının pompalara bağlanması<ol>
<li>Cihazı önceden ısıtılmış sıcaklık kontrollü odaya (37 °C) yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gaz akışını bağlayın<ol>
<li>Uygun giriş iğnesini kullanarak gaz adaptörünü kapak kapağına bağlayın.</li>
		<li>Giriş ve çıkış tüplerini cihaza bağlayın. NOT: Proksimal kolon tarafını giriş küvetlerine bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lümeni stimülasyon girişleriyle arındırın.<ol>
<li>Işıklı stimülasyonu bağırsaktan hafifçe geçirin ve çıkış tüplerindeki orta akışı doğrulayın.</li>
		<li>Harici ortamı yıkayın.</li>
		<li>Harici ortamı 3 kez yıkayın (pompaları hem giriş hem de çıkış için 600 μL/ dk hızında ayarlayın). Her yıkama 1 dakika sürer (kuyuyu boşaltarak başlar).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deneye başlayın.<ol>
<li>Pompaları aşağıdaki oranlarda başlatın: Akış hızı: lümen: giriş- 30 μL/h, çıkış- 35 μL/h Harici ortam: giriş- 1000 μL/h, çıkış- 950 μL/h NOT: Deneme süresi 30 dakika ile 24 saat arasında değişebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deney sonu (kolon organ kültürleri için 24 saate kadar)<ol>
<li>Tüm tüpleri cihazdan çıkarın.</li>
		<li>Dokuları iğnelerden ayırın ve istenen okumalara devam edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+in+vitro+and+ex+vivo+Models+to+Study+Host-Microbiome+Interactions+and+Acute+Stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors.</a> Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).</li>
<li>Hooper, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+commensal+host-microbial+relationships+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.</a> Science. 291 (5505), 881-884 (2001).</li>
<li>Haller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-pathogenic+bacteria+elicit+a+differential+cytokine+response+by+intestinal+epithelial+cell%2Fleucocyte+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures.</a> Gut. 47 (1), 79-87 (2000).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).</li>
<li>Gazzaniga, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+Colon+Chip+Technology+to+Identify+Commensal+Bacteria+That+Promote+Host+Tolerance+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014(2021).</li>
<li>Yissachar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intestinal+Organ+Culture+System+Uncovers+a+Role+for+the+Nervous+System+in+Microbe-Immune+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk.</a> Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).</li>
<li>Duscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propionic+Acid+Shapes+the+Multiple+Sclerosis+Disease+Course+by+an+Immunomodulatory+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism.</a> Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).</li>
<li>Grosheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screen+Identifies+Host+and+Microbiota+Regulators+of+Intestinal+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function.</a> Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).</li>
<li>Blaize, J. F., Corbo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Dilutions+and+Plating%3A+Microbial+Enumeration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li>
<li>Schnupf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+host+interaction+of+mouse+segmented+filamentous+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro.</a> Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Atarashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+Cell+Induction+by+Adhesion+of+Microbes+to+Intestinal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells.</a> Cell. 163 (2), 367-380 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makalede, Yissachar ve arkadaşlarının yakın zamanda geliştirdiği ex vivo gut organ kültürleri için optimize edilmiş bir protokol açıklanmaktadır(yayınlanan 9 ve yayınlanmamış veriler). Bağırsak organ kültürü sistemi, parlak akışı korurken sağlam bağırsak parçalarının çok yönlü kültürünü destekler. İl içi ve ekstra-luminal ortam (stimülasyon dozu, maruz kalma süresi ve akış hızı dahil) üzerinde tam kontrol sağlar ve naif bağırsak dokusu yapısını ve hücresel karmaşıklığını korur<sup clas...

Bağırsak, hücrelerin birbirleriyle ve ışık içeriğiyle (mikrobiyota, gıda vb.) etkileşime girmesini ve iletişim kurmasını sağlayan belirli bir yapıda düzenlenmiş çok çeşitli hücre tipleri (epitel hücreleri, bağışıklık sistemi hücreleri, nöronlar ve daha fazlası) içeren son derece karmaşık bir organdır. 1. Şu anda, konak-mikrobiyota etkileşimlerini analiz etmek için mevcut olan araştırma araç kutusu in vitro hücre kültürlerini ve in vivo hayvan modellerini içerir2. In vivo hayvan modelleri fizyolojik doku konstrüksiyon3 sağlar, ancak zayıf deneysel kontrol ve deney koşullarını manipüle etme yeteneği sınırlıdır. İn vitro kültür sistemleri ise, mikroplarla desteklenebilen birincil hücreleri veya hücre hatlarını kullanın4Deney parametreleri üzerinde sıkı kontrol sağlar, ancak hücresel karmaşıklıktan ve doku mimarisinden yoksundur. Modern in vitro tahliller, fare veya insan kaynaklarından elde edilen epitel organoidler 5,6ve mukozal mikroçevreyi taklit eden örnekler gibi sağlıklı ve patolojik insan dokusu örneklerinin ileri düzeyde kullanılmasına izin verir7. Başka bir örnek, bağırsak değişmez8'infizyolojik durumunu taklit etmek için insan kolonik epitel hücre hattı (Caco2), hücre dışı matris ve mikroakışkan kanalları içeren 'çip üzerindeki bağırsak' tahlildir. Bununla birlikte, in vitro örnekler ne kadar gelişmiş ve yenilikçi olsalar da, normal bir doku mimarisi veya naif hücresel bileşim sağlamaz.
Bunu ele almak için, Yissachar ve arkadaşları son zamanlarda sağlam bağırsak parçalarını koruyan bir ex vivo organ kültürü sistemi geliştirdi9 (Şekil 1) ex vivo, hem in vivo hem de in vitro modellerin avantajlarından yararlanıyor. Bu ex vivo gut organ kültürü sistemi, altı kolon dokusunun çok katlı kültürünü destekleyen, sistemin giriş ve çıkışlarını kontrol ederken benzer koşullar altında deneysel girdilerin incelenmesine izin veren özel yapım bir kültür cihazına dayanmaktadır. Son çalışmalar, bu sistemin bireysel bağırsak bakterilerine bağırsak yanıtlarını analiz etmek için değerli olduğunu göstermiştir9, tüm insan mikrobiyota örnekleri10 ve mikrobiyal metabolitler11. Bu sistem, ilk kez, bu erken konak-mikrobiyota etkileşimlerinin konak, mikrobiyal ve çevresel bileşenler üzerinde yüksek düzeyde kontrol ile incelenmesine izin verir. Ayrıca, deney boyunca sistemin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve manipüle etmesine izin verir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62779/62779fig01.jpg"> Şekil 1: Bağırsak kültürü cihazının şemaları. Bütün bir bağırsak dokusu parçası, odanın çıkış ve giriş portlarına (üstte), lümenin içindeki ve dış orta odanın içindeki orta akışı düzenleyen pompalarla tutturulur. Tüm cihaz (altta) bu tür 6 odacık içerir. Bu rakam Yissachar ve ark. 2017'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62779/62779fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td><güçlü > Cihaz< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 Ölçer Künt İğne</td><td>Mcmaster</td><td>75165a754</td><td></td></tr><tr><td>22 Ayar Künt İğne</td><td>Mcmaster</td><td>75165a758</td><td></td></tr><tr><td>Çok Amaçlı Yapıştırıcı Selant %100 Silikon</td><td>DAP</td><td>688</td><td></td></tr><tr><td>Kübik Vakum Kurutucu VDC-21 + 2 Raflı</td><td></td><td>AAAD4021</td><td></td></tr><tr><td>Cam Slayt 1 mm Kalın</td><td>Corning</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>Mini İnkübatör im-10</td><td></td><td>AAH24315K</td><td></td></tr><tr><td>MPC 301E Vakum POMPASI</td><td></td><td>VI-412711</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Hızlı Dönüşlü Boru Bağlantı Fişleri</td><td>Mcmaster</td><td>51525k121</td><td></td></tr><tr><td>plastik Hızlı Dönüşlü Boru Bağlantı Soketleri</td><td>Mcmaster</td><td>52525k211</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer</td><td>Dow</td><td></td><td>Polidimetilsiloksan, PDMS</td></tr><tr><td>Boru</td><td>Mcmaster</td><td>6516t11</td><td></td></tr><tr><td>Zortrax M200</td><td>Zortrax</td><td></td><td>Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360</td></tr><tr><td>Zortrax M200 Malzemeler: z-ultrat</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Orta</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviyesi (50x), Serum İçermeyen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>HEPES Tamponu (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Iscove'un Fenol Kırmızısı İçeren Modifiye Dulbecco'nun Ortamı (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>N2 Takviyesi (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>Olmayan Esansiyel Amino Asit (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Cerrahi Aletler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Büyük Makas</td><td>Aseltech</td><td>11-00-10</td><td></td></tr><tr><td>Keskin Forseps</td><td>FST</td><td>11297-10</td><td></td></tr><tr><td>İpek Örgülü Cerrahi İplik</td><td>SMI</td><td>8010G</td><td></td></tr><tr><td>Düz Makas</td><td>FST</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>İnce Forseps</td><td>FST</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Organ Sistemi< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 ve mikro; m</td><td>Filtre Ömrü Geni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 ve mikro; m Filtre</td><td>Ömrü Geni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer Kilit Şırınga</td><td>BD</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>Greenough Stereo Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Devridaim Hassas Hava Isıtıcı "CUBE"</td><td></td><td>CUBE-2-LIS Şırınga</td><td></td></tr><tr><td>Pompası</td><td>Yeni Dönem Pompa Sistemleri A.Ş</td>. <td>NEP-NE-1600-EM</td><td></td></tr></tbody></table>

konak-mikrobiyota etkileşimlerini analiz etmek için bağırsak bağırsak organ kültürü sistemi

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

Bağırsak dokusunun yapısı, konakçı ile bağırsak mikrobiyotası arasındaki yakın ve karşılıklı etkileşimleri kolaylaştırır. Bu çapraz görüşmeler yerel ve sistemik homeostazların sürdürülmesi için çok önemlidir; bağırsak mikrobiyota bileşimindeki (disbiyozis) değişiklikler çok çeşitli insan hastalıkları ile ilişkilidir. Konak-mikrobiyota etkileşimlerini inceleme yöntemleri, fizyolojik doku yapısının korunması (in vivo hayvan modelleri kullanırken) ve deney faktörleri üzerindeki kontrol seviyesi (basit in vitro hücre kültürü sistemlerinde olduğu gibi) arasında doğal bir dengeyi kapsar. Bu dengeyi ele almak için, Yissachar ve arkadaşları yakın zamanda bir bağırsak organı kültür sistemi geliştirdiler. Sistem naif bir kolon dokusu yapımını ve hücresel mekanizmaları korur ve ayrıca sıkı deneysel kontrole izin vererek vivoolarak kolayca gerçekleştirilemeyen deneyleri kolaylaştırır. Çeşitli bağırsak bileşenlerinin (epitel, immünolojik ve nöronal elementler gibi) kısa süreli yanıtlarını ışık pertürbasyonlarına (anaerobik veya aerobik mikroplar, farelerden veya insanlardan gelen tüm mikrobiyota örnekleri, ilaçlar ve metabolitler dahil) ayırmak için en uygun olanıdır. Burada, özel yapım bir bağırsak kültürü cihazı kullanarak birden fazla bağırsak parçasının organ kültürü için optimize edilmiş bir protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Luminal pertürbasyonlara konak yanıtları, doku bölümlerinin veya tüm montajlı doku parçalarının immünofluoresans boyanması, floresan yerinde hibridizasyon (FISH) veya zaman atlamalı görüntüleme ile görselleştirilebilir. Bu sistem, yeni nesil sıralama, akış sitometrisi ve çeşitli hücresel ve biyokimyasal tahliller de dahil olmak üzere çok çeşitli okumaları destekler. Genel olarak, bu üç boyutlu organ kültürü sistemi büyük, bozulmamış bağırsak dokularının kültürünü destekler ve yerel bağırsak ortamında konak-mikrobiyota etkileşimlerinin yüksek çözünürlüklü analizi ve görselleştirilmesi için geniş uygulamalara sahiptir.

Bağırsak organ kültürü sistemi doku canlılığını korur ex vivo. Doku canlılığının değerlendirilmesi kültür dönemi boyunca yapıldı. Kolon dokusu parçaları bağırsak organ kültürü sisteminde inkübe edildi ve 2/12/24 saat kültürü takiben sabitlendi. Bağırsak epitel hücre (IEC) tabaka bütünlüğü E-cadherin ve sitokeratin-18 antikorları kullanılarak immünofluoresans lekelenmesi ile doğrulandı. Aynı şekilde, ki-67 boyama ile belirtildiği gibi, kolonik epiteldeki mukus dolu kadeh hücreleri ve lümen içindeki mukus salgısı...

Bu makale, ex vivo deneyleri için yeni bir bağırsak organ kültürü sistemi kullanarak konak mikrobiyom etkileşimlerini analiz etmek için benzersiz bir yöntem salamaktadır.

Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Bağırsak organ kültürü sistemi in vitro ve in vivo tahlillerin avantajlarını birleştirir ve böylece basit in vitro tahliller ile karmaşık in vivo deneyler arasında bir ara deneysel adım görevi görür. Bu tekniğin temel avantajı, sıkı deneysel kontrolün bağırsak fizyolojisinin korunması ile kombinasyonudur. Bu yöntem, konak, mikrobiyal ve çevresel bileşenler üzerinde yüksek düzeyde kontrole sahip belirli uyaranlara bağırsak yanıtlarını analiz etmek için içgörü sağlar.Prosedürü gösterenler laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Alon Shemesh ve laboratuvar müdürümüz Dr. Sivan Amidror olacak. Başlamak için, künt uçlu iğneleri cihaz kalıbı içinde uygun konuma getirin ve cihazın ve kapağın bir seti için yaklaşık 20 gram polidimetilsiloksan veya PDMS karışımı dökün. Hava kabarcıklarını PDMS karışımından çıkarmak için kalıpları 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin, ardından PDMS polimerizasyonunu tamamlamak için kalıpları bir gecede 55 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.PDMS ayarlandığında, iğneleri kalıptan çıkarın ve kültür cihazını ve kapağı plastik kalıplardan dikkatlice serbest bırakın. Pdms kalıntılarını bir cerrahi bıçak kullanarak kuyu anahattından çıkarın. PDMS cihazını ve cihaz kapağını toksik olmayan silikon yapıştırıcı kullanarak 75 ila 50 milimetrelik bir kapak camına takın ve parçaları gece boyunca ayarlamak için bırakın.Yapıştırılmışı cihazın pürüzsüz tarafına uygulayın. Lümen için 12, 22 ölçer iğne ve kuyu için 12, 18 ölçer iğne yerleştirin. Silikon kullanarak tüm iğneleri yerinde sabitle ve gece boyunca ayarlasın.Giriş şırınmalarını temizle ve kuyu ortamının tüm tüplerden bir atık cama aktığından emin olun, ardından giriş şırınnalarını temizleyin ve farklı stimülasyonları kirletmemeye dikkat ederek stimülasyonların tüm tüplerden atık bir bardağa akmasını sağlar. Fareyi feda ettikten sonra, tüm yağ ve bağ dokularını keserek, onu parçalamak ve sindirim sistemini mideden anüse çıkarmak için keskin makas ve tokmak kullanın. Kolonu kesin ve yeni bir tabağa yerleştirin.Dokuyu hafifçe ve sadece kenarlarda tutarken teması en aza indirin. Kolon yıkamayı bir diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirin. Kolon içeriğini metinde açıklandığı gibi hazırlanan 10 mililitre şırınna ile steril IMDM ile hafifçe yıkayın.Dışkıyı bağırsak dokusundan çıkardıktan sonra, kolonu 0,5 mililitre steril IMDM ile dolu yeni bir altı kuyu plakasına yerleştirin. Daha sonra, kolon dokusunu alın ve iki iplikle sıkı bir bağ yaparak 22 kalibrelik iğneye dikkatlice bağlayın. İki nokta üst üste lümen akışına doğru yönlendirmeyi koruyun, böylece proksimal ve distal sırasıyla giriş ve çıkışa eşittir.Tüm dokular için kolon yıkama ve iğneyi tekrarlayın. Giriş ve çıkış tüplerini cihaza bağlayın, ardından pompaları istediğiniz oranlarda çalıştırarak deneye başlayın. Ki67 lekelemede belirtildiği gibi, kolonik epiteldeki mukus dolu kadeh hücreleri ve lümen içindeki mukus salgısı ve kolonik mahzenlerde çoğalma IEC'si tespit edildi.Bu sonuçlar bağırsak kültürü sisteminin bağırsak fonksiyonunu ve yapısı ex-vivo'yu koruduğunu göstermiştir. İki saatlik segmentli filamentli bakteriler veya SFB, girişten sonra, floresan in situ hibridizasyon kullanılarak ince bağırsak villi ile yakın ilişkide tipik SFB filamentleri tespit edildi. Ek olarak, bir iletim elektron mikroskopisi ince bağırsak epitel fırçası sınırının birkaç mikron içinde SFB sundu.Tüm doku örneklerinin gen ekspresyon profilleri SFB ile infüzyondan iki saat sonra üç taraflı olarak üretildi. Kontrol kültürleri mikropsuz veya Bacteroides fragilis monokolonize farelerin dışkı süspansiyonları ile aşılandı. SFB tarafından ikna edilen bu değişiklikler, mikropsuz kontrole kıyasla çoğunlukla küçük genlikteydi.Kolonun yönü son derece önemlidir. Kolonu iğneye tanırken ekstra dikkatli olun. Uygun kravat, kuyunun lümen içeriği ile kirlenmesini önleyecektir.Yeni nesil sıralama, görüntüleme, hücre sıralama ve daha fazlası gibi çok çeşitli okuma teknikleri bu protokolü izleyebilir. Bu okumalar, sağlık ve hastalıkta konak mikrobiyom etkileşimleri hakkında yeni bilgiler sağlar.

an-intestinal-gut-organ-culture-system-for-analyzing-host-microbiota

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Calatayud Arroyo, M. ve diğerleri. In vitro bağırsak konak-mikrob arayüzünde sentetik bakteriyel konsorsiyumunun uygulanabilirliğinin değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018).Bu video, bakteriyellerin canlılığını incelemek için in vitro bağırsak konakçı-mikrop modelini gösteriyor. Caco-2 ve HT29-MTX hücrelerinin ortak kültürü, simüle edilmiş sindirim koşullarında önceden işlenmiş bakterilerle kuluçka geçirilir. Epitel bariyer bütünlüğü transepitelyal elektriksel direnç kullanılarak...

Bakteriyel Yapışma ve İçselleştirmeyi Değerlendirmek İçeriği Değerlendirmek İçerik Bağırsak Modeli

Bu videoda, fare bağırsak dokusu parçaları ile spesifik bağırsak bakterileri arasındaki etkileşimleri incelemek için bir ex vivo bağırsak organ kültürü sistemi kurma metodolojisini açıklıyoruz. Cihaz, ilki bağırsak dokusu lümenini birbirine bağlayan ve içine spesifik bakteri süspansiyonunu sağlayan ve ikincisi ex vivo doku canlılığını korumak için cihazın kuyularına sürekli olarak ortam sağlayan iki çift giriş-çıkış portundan oluşur.

Konak-mikrobiyota etkileşimlerini incelemek için bir ex vivo bağırsak organ kültürü sistemi

Biz, insan bağırsak-on-a-chip microphysiological sistemi kullanılarak uzun bir süre için bir in vitro protokole ko-kültür bağırsak mikrobiyomları ve bağırsak villi açıklar.

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Ex vivo organ kültürü, sağlam doku mimarisi bağlamında biyolojik süreçlerin araştırılmasına izin verir. Burada, bağırsakta doğuştan gelen bağışıklığı ve antimikrobiyal konak savunmasını incelemek için kullanılabilecek bir fare kolonunun ex vivo kültür yöntemini tanıtıyoruz.

<em&gt; Ex Vivo</emAntimikrobiyal Konak savunma Çalışmaları&gt; Kolon Organ Kültür ve Kullanımı

Gut ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri sentetik bir sözlü topluluk, vitro gastrointestinal sindirim ve ince bağırsak epitel modeli birleştirerek yeni bir yaklaşım kullanarak değerlendirildi. Biz hücre istilası patojenler ve çoklu türler biyofilmler değerlendirmek veya bile probiyotik formülasyonları Beka sınamak için adapte edilebilir bir yöntem mevcut.

Sentetik bir bakteriyel konsorsiyum Vitro Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimde canlılık değerlendirilmesi

Burada, fizyolojik şartlarda mide bağırsak, taklit Biyoreaktörler bir dizi kullanarak gut microbiota kolon tüp bebek, kültür için bir iletişim kuralı mevcut.

Uygulama gelişmiş teknoloji insan Gut Microbiota Eğitim Kültür Vitro

Bu protokol, insan dışkı Mikrobiyota bir in vitro toplu kültür fermantasyon sistemi açıklar, inulin kullanarak (iyi bilinen bir prebiyotik ve en yaygın olarak okudu Mikrobiyota Modulators) belirli etkileri tahmin bu sistemin kullanımını göstermek için dışkı mikrobiota kompozisyon ve metabolik faaliyetler üzerinde müdahaleler.

Bir In vitro Batch-kültür modeli ınsan dışkı microbiota üzerinde girişimsel rejimlerin etkilerini tahmin etmek

Burada açıklanan in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.

In Vitro Bath Fermantasyon Sistemleri Kullanılarak Endobiyotikler ve İnsan Bağırsak Mikrobiyotları Arasındaki Etkileşimlerin Analizi

Bu kolaylaştırılmış protokol, karmaşık doku örneklerindeki bakterileri tespit etmek ve görüntülemek için, dokuyu sabitlemekten floresan in situ hibridizasyonlu mikropları boyamaya kadar bir iş akışını detaylandırıyor.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Ayrıntılı protokolümüz, insan bağırsak mukozasını 3D yapılar ve çeşitli hücre tipleri ile simüle eden, mikrobiyal kolonizasyona yanıt olarak bağışıklık tepkilerinin ve hücresel fonksiyonların derinlemesine analizini sağlayan gelişmiş çip üzerinde bağırsak modelinin oluşturulmasını ve kullanımını özetlemektedir.

Bağırsak mukozal bağışıklık tepkilerini analiz etmek için immünokompetan çip üzerinde bağırsak modeli

Çalışma, doku kök hücresinden türetilen bağırsak organoidleri kullanılarak bakteriyel enfeksiyonun in vitro incelenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, organoidlerin iki boyutta nasıl kültürleneceğini ve farklılaştırılacağını, onları yapışkan-invaziv Escherichia coli ile enfekte edeceğini ve epitel bariyer sızıntısı, enfeksiyon görüntüleme ve epitel RNA yanıtı gibi önemli okumaları nasıl değerlendireceğini açıklar.

Konak-bakteri etkileşimlerini incelemek için invazin veya bazal zar ekstraktı üzerine iki boyutlu organoid kültürü

Öğrenin, bağırsak organ kültürü sistemiyle konak-mikrobiyota etkileşimlerini analiz etmeyi. Bu yöntem, deneysel kontrol ile bağırsak fizyolojisinin korunmasını birleştirerek mikrobiyom araştırmalarında değerli bir araç sunar.

Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

Daha fazla video keşfet