Name: Kıkırdak Eksplantlarında Göç ve Alımı İzlemek için Hücre Dışı Veziküllerin Etiketlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Öğrenin, ekstraselüler vezikülleri etiketleyerek kıkırdak eksplantlarında göç ve alımı konfokal mikroskopi ile izleme yöntemini. Bu teknik osteoartrit araştırmalarında terapötik uygulamalar için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, ESF Avrupa Sosyal Fonu ve ERDF Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (MS16/00124) tarafından ortaklaşa finanse edilen Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad tarafından finanse edildi; CP16/00124); Balear Adaları'nın sürdürülebilir turizm vergisi tarafından finanse edilen PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18) tarafından; Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); FUTURMed bünyesindeki FOLIUM doktora sonrası programı (FOLIUM 17/01) tarafından, Balear Adaları'nın sürdürülebilir turizm vergisi ile% 50 ve ESF tarafından% 50 oranında finanse edilir; ve Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03) tarafından.

NOT: Projenin CEI-IB (IB 3656118 PI) tarafından etik olarak onaylanmasından sonra kurumsal yönergelere uygun olarak IdISBa Biobank'tan (IB 1995/12 BIO) kıkırdak eksplantları alınmıştır.
1. Sütun hazırlama
<ol><li>Üreticinin talimatlarını izleyerek veya aşağıdaki gibi sütunları dengele:<ol>
<li>Sütun kapağını çıkarın ve sütunu dengeleyin. Depolama arabelleği elution ile çıkarın.</li>
		<li>Kolonu 2,5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez yıkayın. Her yıkama sırasında, sütunun tüm birimi emmesini bekleyin. NOT: Sütunun kurumasına izin vermeyin.</li>
		<li>Son yıkamadan sonra ve numune hazırlığına kadar sütunu kapakla örtün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. EV etiketleme
NOT: Bu EV etiketleme protokolü, daha önce boyut dışlama kromatografisi (SEC) tarafından yalıtılmış, daha önce açıklanan koşullar21,22olan bir PL-EV örneği kullanır. Ancak, herhangi bir kaynaktan herhangi bir EV örneği bu iletişim kuralıyla kullanılabilir.
<ol><li>EV örneğini ve kontrolü (PBS) konsantre bir tüp kullanarak konsantre edin.<ol>
<li>Numuneleri, EV numunesinin başlangıç hacmine bağlı olarak 15 mL veya 500 μL konsantre tüpüne yerleştirin. Neredeyse kuru bir numune elde edilene kadar tüpleri üreticinin talimatlarına göre santrifüjlayın. NOT: Kontrol örneği herhangi bir boya arka planını kontrol etmek için gereklidir. Bu yöntem belirli bir başlangıç hacmi gerektirmemese de, arıtma adımları sırasında parçacıkların yaklaşık% 10'unun kaybedileceği düşünülmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konsantre numuneleri 200 μL'lik seyreltici C. Resuspend EV numuneleri ve 100 μL'lik kontrol grubu ile yeniden satınlayın ve yeni 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın.</li>
	<li>EV örneğini 100 μL'lik iki aliquot'a ayırın, birini boya ile işaretleyin ve tedavi olarak kullanın (PKH-PL-EV); diğerini işaretsiz bırakın, ancak EV örneği gibi işleyin (NTA-PL-EV) ve EV konsantrasyonu NTA ile ölçmek için kullanın.</li>
	<li>Seyreltici C'de 8 μM PKH26 çözeltisi ile sonuçlanan 2x boya çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Numunede 125 μL seyreltici C başına 1 μL 1 mM PKH26 bağlayıcıyı karıştırın. Örneklere 1:1 oranında eklemek için gereken bir birim hazırlayın.</li>
	<li>PKH-PL-EV'ye 2x boya çözeltisi ekleyin ve 1x boya konsantrasyonu ve 4 μM PKH26 konsantrasyonu elde etmek için numuneleri 1:1 oranında kontrol edin. NTA-PL-EV örneğine aynı miktarda PBS ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Numunelere %5 sığır serum albümin-PBS solüsyonunun 1:1 oranında eklenmesini sağlayın ve son hacmin ~400 μL olduğundan emin olun. NOT: Bu adım, spesifik olmayan boya etkileşimlerinin veya ilişkisiz boyaların kaldırılmasını sağlar.</li>
	<li>Etiketli EV'leri, boyanın sütunla ilişkisiz boyasından ve spesifik olmayan etkileşimlerinden ayırmaya devam edin.</li>
</ol>3. Etiketli-EV yalıtımı
<ol><li>Kapağı sütundan çıkarın, numunenin 400 μL'sini ekleyin (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV veya kontrol) ve elde edilen tüm sıvıyı atın.</li>
	<li>Sonraki adıma geçmeden önce örneğin sütunu tamamen girmesini bekleyin. 600 μL PBS ekleyin ve tüm eluted sıvıyı atın.</li>
	<li>Bir sonraki adıma geçmeden önce PBS'nin sütunu tamamen girmesini bekleyin. 600 μL PBS ekleyin ve 1,5'te 600 μL'lik bir fraksiyon toplayın. mL santrifüj tüpü (EV'ler veya kontrol). NOT: Fazla boyayı numunelerden çıkarmak için bu adımlar gereklidir. Daha saf EV'ler elde etmek için sütuna göre başka bir ayırma gereklidir. Bu nedenle, aşağıdaki adımlar yeni bir eşkenel sütunda (adım 4.1.) veya ilk yıkama adımından sonra aynı sütunda (adım 4.2) gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Daha saf EV'ler elde etmek için sütunu yeni bir EV ayırma adımına hazırlayın. Yeni bir sütunsa, 2.1 adımlarını yineleyin. ve 2.2. Aynı sütunsa, sütunu % 20 izopropanol 2,5 mL ile yıkayın ve ardından 2.1 ve 2.2 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Sütuna 2,5 adımda elde edilen daha önce elflenmiş 600 μL EV ekleyin ve elde edilen birimi atın. Bir sonraki adıma geçmeden önce sıvının sütuna tamamen girmesini bekleyin.</li>
	<li>400 μL PBS ekleyin ve tüm zorlanmış birimi atın. Bir sonraki adıma geçmeden önce sıvının sütuna tamamen girmesini bekleyin.</li>
	<li>600 μL PBS ekleyin ve 1,5 mL santrifüj tüpünde 600 μL'lik bir fraksiyon toplayın. Daha fazla analiz için EV'leri ve kontrol örneklerini kullanın veya gece boyunca 4 oC'de saklayın.</li>
	<li>Kullanılan sütunları ileride kullanılmak üzere depolayın.<ol>
<li>Sütunu % 20 izopropanolden 25 mL ile yıkayın ve elde edilen hacmi atın. Sütunu 2,5 mL PBS ile 3 kez yıkayın.</li>
		<li>1.1.1 adımında kaldırılan depolama arabelleği ekleyin ve arabelleğin sütuna girmesini bekleyin. Sütunu kapakla örtün ve sonraki kullanıma kadar 4 oC'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EV nicelemesi
<ol><li>Aşağıdaki iki adımda açıklandığı gibi NTA-PL-EV örneğinin ve ilk PL-EV örneğinin 1:1.000 seyreltmesini hazırlayın.<ol>
<li>0,2 μm filtreden süzülmüş PBS ile 1:10 seyreltilmiş NTA-PL-EV'nin 1 mL'si ve 1:10 seyreltilmiş ilk PL-EV'nin 1 mL'si hazırlayın.</li>
		<li>0,2 μm filtreden süzülen PBS ile önceki seyreltilmiş numunelerin 1:100 seyreltilmesinin 1 mL'sini hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1:1.000 seyreltilmiş NTA-PL-EV örneğini veya ilk PL-EV örneğini steril bir şırınna kullanarak NTA pompasına enjekte edin. Parçacık konsantrasyonu ve boyut dağılımı belirleme için üreticinin talimatlarını ve önerilerini izleyin. NOT: EV konsantrasyonu numune marş hacmine bağlı olduğundan, doğru bir NTA tayini elde etmek için ara seyreltmeleri okumak ve ayarlamalar yapmak gerekebilir.</li>
</ol>5. İltihaplı OA için tedavi olarak kullanılan EV'ler
<ol><li>Kıkırdağı PBS ile iki kez yıkayın ve steril koşullar altında 3 mm çapında biyopsi zımbası kullanarak kesin. NOT: Hücre kültürü başlığındaki 5.1 ile 5.6 adımlarındaki yordamı gerçekleştirin.</li>
	<li>Eksplantları 37 oC'de%1 penisilin-streptomisin, %5 CO 2 ve %80 nem ile desteklenmiş DMEM-F12 ortamına sahip96kuyu kültür plakasına yerleştirin.<ol>
<li>İnflamasyon odaklı bir OA modeli oluşturmak için hücre kültürü ortamını 10 ng/mL onkostatin M ve 2 ng/mL tümör nekroz faktörü-alfa (TNFα) ile destekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eksplantları 1 × 109 partikül/etiketli EV kuyusu (PKH-PL-EV) ile tedavi edin veya onkostatin M ve TNFα ile desteklenmiş hücre kültürü ortamında kontrol edin. NOT: 1 × 109 parçacık/kuyu içeren numunenin hacmini ölçün ve kontrol için aynı hacmi kullanın.</li>
	<li>Ortamı kıkırdak eksplantları içeren 96 kuyu hücre kültürü plakalarından çıkarın. Her kuyuya 5,3 adımda açıklanan hücre kültürü ortamının 200 μL'lik kısmını ekleyin. NOT: 96 kuyu plakaları fetal sığır serumu (FBS) ile temas etmişse, FBS'den EV'leri çıkarmak için her birini 200 μL PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Tüp bebek testini farklı zamanlarda durdurun: 0, 1, 2, 3, 4 ve 5 saat.</li>
	<li>Kıkırdak eksplantlarını içeren hücre kültürü kuyularını 200 μL PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>4 oC'de 3 saat sabitlemek için dokuya 100 μL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. NOT: PFA ile ilgili adımlar, Güvenlik Veri Sayfası önerilerini izleyerek duman kaputunda gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>PFA'yı çıkarın, 100 μL PBS ekleyin, sabit dokuyu 4 °C'de saklayın ve numuneleri 48 saat içinde işleyin.</li>
</ol>6. Mikroskopi hazırlama ve görselleştirme
NOT: Bu histolojik işlem dehidrasyon, parafin gömme ve rehidrasyon adımlarından oluşur. Bu adımlar genel boya floresanını azaltabilir (PKH26 veri sayfası'nda belirtilen bir sınırlama). Bu nedenle, dondurulmuş kesitleme gibi diğer prosedürler konfokal mikroskopi ile EV görselleştirme için daha uygun olabilir.
<ol><li>Sabit dokuları parafin bloklarına gömün. Dokuyu 6 μm kalınlığında bölümlere kesin.</li>
	<li>Doku bölümlerinin deparaffinize. NOT: Ksilen kullanan tüm adımlar duman kaputunda yapılmalıdır.<ol>
<li>Doku bölümlerini 30 dakika ksilen, 2 dakika için% 100 etanol, 2 dakika için% 96 etanol, 1 dakika için% 75 etanol ve son olarak 30 s damıtılmış suya daldır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku bölümlerini permeabilize edin.<ol>
<li>Dokuya nüfuz etmek için % 0.1 Triton-% 0.1 sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın. Her doku bölümüne 20 μL'lik bir damla ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır. Her bölümü 20 μL PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskobik bir slaytta, floresan korumak için sulu bir montaj ortamı ile 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) içeren bir damla montaj ortamı ekleyin. Adım 6.3.1'den itibaren 3 doku bölümü içeren slaydı örtün.</li>
	<li>Slaytları oda sıcaklığında gece boyunca inkübte edin, ışıktan kornun.</li>
	<li>Konfokal mikroskopiye kadar ışıktan korunarak 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>

<ol><li>Sutton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+the+synovium%2C+synovial+derived+inflammatory+cytokines+and+neuropeptides+to+the+pathogenesis+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis.</a> The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).</li>
<li>Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+articular+cartilage+defects%3A+Focus+on+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering.</a> In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).</li>
<li>Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+and+mesenchymal+stem+cell-based+therapies+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis+and+related+orthopaedic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Maturitas%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions.</a> Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).</li>
<li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li>
<li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li>
<li>Burke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell+based+therapy+for+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis.</a> Clinical and Translational Medicine. 5 (1), e27(2016).</li>
<li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+improve+post-stroke+neuroregeneration+and+prevent+postischemic+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+protect+against+acute+tubular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).</li>
<li>Bruno, S., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+in+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair.</a> Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).</li>
<li>Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+secreted+vesicles+and+intercellular+communications%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).</li>
<li>D'Arrigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+and+extracellular+vesicles+as+new+biological+therapies+for+knee+osteoarthritis%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867(2019).</li>
<li>Ryan, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+inflammation-related+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).</li>
<li>El Backly, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysate+induces+in+vitro+wound+healing+of+human+keratinocytes+associated+with+a+strong+proinflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response.</a> Tissue Engineering. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).</li>
<li>Yuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graefe%27s+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+outcomes+of+phacoemulsification+in+patients+with+chronic+ocular+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).</li>
<li>Del Bue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysate+promotes+in+vitro+proliferation+of+equine+mesenchymal+stem+cells+and+tenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes.</a> Veterinary Research Communications. 31 (Suppl 1), 289-292 (2007).</li>
<li>Klatte-Schulz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+platelet+lysates+and+platelet+rich+preparations+to+stimulate+tendon+cell+biology%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212(2018).</li>
<li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+platelet-rich+plasma+present+a+novel+potential+in+alleviating+knee+osteoarthritis+by+promoting+proliferation+and+inhibiting+apoptosis+of+chondrocyte+via+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470(2019).</li>
<li>Otahal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+chondroprotective+effects+of+extracellular+vesicles+from+plasma-+and+serum-based+autologous+blood-derived+products+for+osteoarthritis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050(2020).</li>
<li>Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+carriers+of+microRNA%2C+proteins+and+lipids+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).</li>
<li>Ortega, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+endolysosomal+trafficking+enhances+release+of+bioactive+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014(2019).</li>
<li>de Miguel Pérez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-miRNAs+as+liquid+biopsy+biomarkers+for+disease+identification+and+prognosis+in+metastatic+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Morelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%2C+intracellular+sorting%2C+and+processing+of+exosomes+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells.</a> Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).</li>
<li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+internalization+of+exosomes+occurs+through+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li>
<li>Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extracellular+vesicles%3A+Current+and+emerging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25, 91(2018).</li>
<li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432(2001).</li>
<li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029(2015).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+in+vivo+tracking+of+the+exosomes+of+murine+melanoma+B16-BL6+cells+in+mice+after+intravenous+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection.</a> Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).</li>
<li>Askenasy, N., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+PKH-labeled+hematopoietic+cells+in+recipient+bone+marrow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.</a> Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).</li>
<li>Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+effect+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+on+a+concanavalin+A-induced+liver+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model.</a> Inflammation and Regeneration. 36, 26(2016).</li>
<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li>
<li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li>
<li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

EV görüntüleme, serbest bırakma ve alma mekanizmaları gibi EV özelliklerinin anlaşılmasına yardımcı olur. Görüntülemeleri, biyodistribasyonlarının izlenmesini ve farmakokinetik özelliklerinin ilaç araçları olarak nitelendirilmesini sağlar. Bununla birlikte, EV görüntüleme ve izleme küçük boyutları nedeniyle zor olabilir, ancak araştırmacıların TÜP BEBEK ve in vivo koşullarda EV'leri izlemelerine yardımcı olmak için birçok görüntüleme cihazı ve etiketleme tekniği geliştirilmiştir23</sup...

Osteoartrit (OA), eklem kıkırdaklının hücre dışı matrisinin ilerleyici ve geri dönüşü olmayan bir iltihaplanma ve yok edilmesi anlamına gelen eklem dejeneratif bir hastalıktır1. Çeşitli artrit formları çok sayıda tedaviye sahip olmasına rağmen2,3,4, bunlar yan etkileri ve sınırlı etkinliği ile kısıtlanır. Erken OA kıkırdak lezyonlarında yaralı kıkırdağın rejeneratif tedavisi için otolog kondrosit implantasyonu kullanılarak doku mühendisliği teknikleri rutin olarak uygulanmaktadır4. Hücre bazlı tedaviler esas olarak kıkırdağı etkili bir şekilde onarabilen fenotipik olarak stabil kondrositlerin veya kondroprogogenitatörlerin sınırlı sayıda nedeniyle kısıtlanır3. Bu nedenle, hastalığın ilerlemesini önlemek ve büyük kıkırdak lezyonlarını yenilemek için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi son derece önemlidir.
Hücre dışı veziklinler (EV' ler) farklı yazarlar tarafından OA için bir tedavi olarak önerilmiştir5,6. EV'ler hücre tiplerinin çoğunluğu tarafından salgılanan membranöz cisimlerdir, hücreler arası sinyalizasyonda yer almaktadır ve kök hücrelerin terapötik etkilerini7,8,9, son zamanlarda rejeneratif tıbba ilgi uyandırdıkları gösterilmiştir10. Mezenkimal stromal hücrelerden (MSC) elde edilen EV'ler, OA için araştırılan ana terapötik EV'lerdir, ancak diğer eklemle ilişkili hücreler EV kaynakları olarak kullanılmıştır, örneğin, kondroprogenitörler veya bağışıklık hücreleri11,12.
Trombosit lizazları (PL' ler) gibi trombosit konsantreleri, kornea ülserleri13 , 14,15veya tendon dokusu rejenerasyon16 gibi farklı yaralanmalarda yara iyileşmesini arttırmak için kullanılır, çünkü trombosit konsantrelerinin EV bileşeninin bu etkilerden sorumlu olabileceği hipotezi nedeniyle17 . Eklemle ilgili hastalıklarla ilgili bazı çalışmalar osteoartrit koşullarını iyileştirmek için tedavi olarak trombosit türevli EV'ler (PL-EV' ler) kullanmaktadır. PL-EV'ler, osteoarthride kondrojenik belirteçlerin ekspresyonunu teşvik eden Wnt/β-catenin yolu18'ietkinleştirerek kondrosit çoğalmasını ve hücre göçünü iyileştirir veya PL-EV'lerle tedavi edilen osteoartritli tavşanlarda daha yüksek kondrojenik protein seviyeleri ve daha az tissular anormallik gösteren19.
EV'ler, hedef hücreye serbest bırakılan proteinler, lipitler ve nükleik asitler içerir ve terapötik uygulamalarıyla ilgili ana özellik olan hücreden hücreye iletişim kurar20. EV'lerin etkileri, hücrelere ulaşmalarına ve daha sonra kargo salınımlarına bağlıdır. Bu etki, metabolik aktivite veya gen ekspresyon modifikasyonu gibi hücrelerde neden olduğu değişikliklerle dolaylı olarak doğrulanabilir. Bununla birlikte, bu yöntemler, EV'lerin işlevlerini uygulamak için hücrelere nasıl ulaştığının görselleştirilmesine izin vermez. Bu nedenle, bu makale, iltihaplı OA kıkırdak eksplantları için bir tedavi olarak kullanılacak bu PL türevi EV'leri etiketlemek için bir yöntem sürmektedir. Konfokal mikroskopi, EV alımını ve eksplantlarda bulunan kondrositlere ilerlemeyi 5 saatlik bir zaman atlamalı olarak izlemek için kullanıldı.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Santrifüj tüpü</td><td>SPL yaşam bilimleri</td><td>PLC60015</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Şırınga BD Plastipak</td><td>BD</td><td>303174</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (İzopropanol)</td><td>Panreac AppliChem</td><td>1.310.901.211</td><td>Milli-Q su ile %20 oranında hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>96 oyuklu kültür plakası</td><td>SPL yaşam bilimleri</td><td></td><td></td>PLC30096</tr><tr><td>Mutlak etanol Pharmpur</td><td>Scharlab</td><td>ET0006005P</td><td>Milli-Q su ile %96 ve %75 etanol hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Pistonlu Biyopsi Punch 3 mm</td><td>Scandidact</td><td>MTP-33-32</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serumu&nbsp; Albümin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>PBS ile %5 oranında hazırlanır</td></tr><tr><td>Kıkırdak eksplantları</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konsantre tüp 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>MCP100C41</td><td></td></tr><tr><td>Konsantre tüp 500 & mikro; L Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı 24 x 60 mm</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 -GlutaMAX orta</td><td>Biowest</td><td>L0092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun PBS (1x)</td><td>Oğlak Bilimsel</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>Gömülü parafin doku blokları</td><td>IdISBa Biyobanka</td><td></td><td>Servis ücreti</td></tr><tr><td>Exo-spin mini-HD sütunlar</td><td>Hücre yönlendirme sistemleri</td>: <td>EX05</td><td></td></tr><tr><td>Feather S35 Microtome Blade</td><td>Feather</td><td>43037</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 & micro; m şırınga filtresi</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-6057</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9635-10UG</td> ile Fluoroshield <td>0.1 & mikro nihai konsantrasyona kadar bir stok çözeltisi hazırlayın; g/&mikro; L PBS-0.1% BSA</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18715.1000</td> içinde seyreltilmiş <td>PBS ile% 4'te hazırlanır ve 4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Genel Hücre Zarı Etiketleme için Kırmızı Floresan Hücre Bağlayıcı Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26 ve Dliuent C dahil</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat dihidrat</td><td>Scharlab</td><td>SO019911000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Mikroskop Slaytları</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>TNF&alfa;</td><td>Ar-Ge D sistemleri</td><td>210-TA-005</td><td>0.01 & mikro nihai konsantrasyona kadar bir stok çözeltisi hazırlayın; g/&mikro; PBS-0.1% BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td> içinde seyreltilmiş L <td>Milli-Q su ile %0.1 Triton-%0.1 sodyum sitrat çözeltisi hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Scharlab</td><td>XI0050005P</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td>F-45-48-11 rotor</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>&</td><td>lambda;= 532 nm'de gömülü lazerli Malvern NS300 Cihazı ve kamera sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Finesse 325 Manuel Mikrotom</td><td>Thermo Scientific & trade;</td><td></td><td></td>A78100101</tr><tr><td>TCS-SPE konfokal mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>5200000271</td><td></td></tr></tbody></table>

kıkırdak eksplantlarında göç ve alımı İzlemek için hücre dışı veziküllerin etiketlenmesi

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Hücre dışı veziklinler (EV'ler), trombosit lisat (PL) gibi hücresel kaynaklarından elde edilen kargoları nedeniyle hücresiz bir tedavi olarak potansiyellerini kanıtlamak için farklı çalışmalarda kullanılır. Tedavi olarak kullanıldığında, EV'lerin hedef hücrelere girmesi ve bunlardan bir yanıt etkilemesi beklenir. Bu araştırmada PL türevli EV'ler osteoartrit (OA) için hücresiz bir tedavi olarak incelenmiştir. Böylece, EV'leri etiketlemek ve kıkırdak eksplantları üzerinde alımlarını test etmek için bir yöntem kuruldu. PL türevli EV'ler lipofilik boya PKH26 ile etiketlenir, bir sütundan iki kez yıkanır ve daha sonra nanopartikül izleme analizi (NTA) ile parçacık nicelesinden sonra 5 saat boyunca in vitro inflamasyon tahrikli bir OA modelinde test edilir. Saatlik olarak, kıkırdak eksplantları sabitlenir, parafinlenir, slaytlara monte etmek için 6 μm bölümlere kesilir ve konfokal mikroskop altında gözlemlenir. Bu, EV'lerin bu süre zarfında hedef hücrelere (kondrositler) girip girmediğinin doğrulanmasına ve doğrudan etkilerinin analiz edilip edilmediğinin doğrulanmasına olanak tanır.

Şekil 1'de EV etiketleme ve alım izleme için şematik bir genel bakış görüntülenir. Tablo 1'de NTA tarafından tespit edilen parçacık konsantrasyonu ve EV boyutu, sütunla etiketlendikten sonra iki kez gerçekleştirilen saflaştırma adımı nedeniyle ev konsantrasyonunun işlem sırasında azaldığını göstermektedir. Bununla birlikte, elde edilen miktar, tedavi için kullanılacak partikül sayısının en uygun aralığındadır. Bu parçacık konsantrasyonu, osteoartrit kıkırdak eksplantlarını t...

Burada, osteoartrit için model olarak kullanılan kıkırdak eksplantlarında göçlerini ve alımlarını izlemek için trombositten türetilmiş hücre dışı veziklikleri etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Kıkırdak Eksplantlarında Göç ve Alımı İzlemek için Hücre Dışı Veziküllerin Etiketlenmesi

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Bu basit protokol, EV'leri etiketlemeye ve konfokal mikroskopi ile izlemeye izin verir. Örneğin, EV görüntüleme, terapötiklerde kullanılırken EV dağılımını değerlendirmede yardımcı olabilir. Bu teknik, herhangi bir özel işleve sahip olmadan konfokal mikroskopi ile EV göçünü ve kıkırdak eksplantlarında alımı kolayca izlemenizi sağlar.Aynı protokol TÜP BEBEK veya in vivo deneyler için DEE'ler için de kullanılabilir. Sütunların önceden hazırlandığından ve ÇEV'lerin başlangıç hacminin, arınma adımı sırasında parçacıkların yaklaşık% 10'unun kaybolacağını göz önünde bulundurarak istenen nihai parçacık konsantrasyonuna ulaşmak için yeterli olduğundan emin olun. Hücre dışı veziklikten veya EV'den, numuneden ve kontrolden konsantre olarak başlayın.Numuneleri, EV örneğinin başlangıç hacmine bağlı olarak 15 mililitre veya 500 mikrolitre konsantre tüpüne yerleştirin. Neredeyse kuru bir numune elde edilene kadar tüpleri üreticinin talimatlarına göre santrifüjlayın. Konsantre EV örneklerini 200 mikrolitre ile ve kontrol grubunu 100 mikrolitre seyreltici C ile yeniden askıya alın ve yeni 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.EV örneğini her biri 100 mikrolitrelik iki aliquot'a ayırın. Aliquotlardan birini boya ile işaretleyin ve tedavi olarak kullanın. Diğerini işaretsiz bırakın, ancak EV örneği gibi işleyin ve nanopartikül izleme analizi ile EV konsantrasyonu ölçmek için kullanın.2x boya çözeltisi hazırlayın, böylece seyreltici C'de elde eden PKH26 çözeltisi konsantrasyonu sekiz mikromolardır. Numunede 125 mikrolitre seyreltici C başına bir milimoler PKH26 bağlayıcı mikrolitre karıştırın. Örneklere eklemek için gereken hacmi 1:1 oranında hazırlayın.1x boya konsantrasyonu ve dört mikromoler PKH26 konsantrasyonu elde etmek için PKH trombosit lysate türevi EV'lere 2x boya çözeltisi ekleyin ve numuneleri 1:1 oranında kontrol edin. NTA trombosit lisat türevi EV örneğine aynı pbs hacmini ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yaslanın.Örneklere 1:1 oranında %5 sığır serum albümin-PBS çözeltisi ekleyin ve son hacmin yaklaşık 400 mikrolitre olduğundan emin olun. Etiketli EV'leri sütunla ilişkisiz boya ve spesifik olmayan boya etkileşimlerinden ayırmaya devam edin. Kapağı sütundan çıkarın, 400 mikrolitre PKH trombosit lisat türevi EV, NTA trombosit lysate türevi EV'ler ekleyin veya elde edilen tüm sıvıları kontrol edin ve atın.Sonraki adıma geçmeden önce örneğin sütunu tamamen girmesini bekleyin. 600 mikrolitre PBS ekleyin ve tüm eluted sıvıyı atın. Bir sonraki adıma geçmeden önce PBS'nin sütunu tamamen girmesini bekleyin.600 mikrolitre PBS ekleyin ve 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünde 600 mikrolitrenin bir kısmını toplayın. Yeni bir sütun için, protokolün başında belirtilen örneklerin konsantrasyonunu içeren adımları yineleyin. Sütuna daha önce elflenmiş 600 mikrolitre EV ekleyin ve eluted birimi atın.Ardından 400 mikrolitre PBS ekleyin ve tüm zorlanmış birimleri atın. Sütuna 600 mikrolitre PBS ekleyin ve 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünde 600 mikrolitrenin bir kısmını toplayın. Kıkırdağı PBS ile iki kez yıkayın ve steril koşullar altında üç milimetre çapında biyopsi zımbası kullanarak kesin.Eksplantları, 37 santigrat derecede%1 penisilin streptomisi, %5 CO2 ve %80 nem ile desteklenmiş DMEM-F12 orta boy 96 kuyu kültür plakalarına yerleştirin. İnflamasyon odaklı bir OA modeli oluşturmak için, hücre kültürü ortamını mililitre onkostatin M başına 10 nanogram ve tümör nekroz faktörü-alfa mililitresi başına iki nanogram ile destekleyin. Eksplantları PKH trombosit lizat türevli EV'lerin kuyusu başına 1 kez 10 ila 9. parçacıklarla tedavi edin veya onkostatin M ve tümör nekroz faktörü-alfa ile desteklenmiş hücre kültürü ortamında kontrol edin.Ortamı kıkırdak eksplantları içeren 96 kuyu hücre kültürü plakalarından çıkarın. Her birine, el yazmasında açıklandığı gibi 200 mikrolitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Tüp bebek testini her saat sıfırdan beş saate kadar durdurun.Kıkırdak eksplantlarını içeren hücre kültürü kuyularını 200 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın. Dört santigrat derecede üç saat boyunca düzeltmek için dokuya% 4 paraformaldehit 100 mikrolitre ekleyin. PFA'yı çıkarın, 100 mikrolitre PBS ekleyin, sabit dokuyu dört santigrat derecede saklayın ve örnekleri 48 saat içinde işleyin.Farklı zaman noktalarında çekilen görüntüler, EV'lerin kondrositlere ulaşana kadar dokuya nasıl girdiğini ve zamanla kondrositlere nasıl girdiğini gösterir. Etiketli EV'ler, bir saatlik inkübasyondan sonra kondrositlerin etrafında zaten yerelleştirilmişti. EV'lerin ilk hacminin istenen son parçacık konsantrasyonuna ulaşmak için yeterli olduğundan emin olun.Unutulmaması gereken bir diğer önemli şey de etiketli EV'leri önümüzdeki 24 saat içinde kullanmaktır. 24 saat içinde kullanılmazsa floresanlarda azalma meydana gelebilir. Bu teknik, araştırmacıların EV görüntülemesini geliştirmelerine ve biyoloji ve terapötiklerdeki EV'leri incelemelerine yardımcı olacaktır.

labeling-extracellular-vesicles-for-monitoring-migration-uptake

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Sunumun Amaç, kıkırdak defektleri, MR görüntüleme ile görüntülendi olabilir matris ilişkili kök hücre implantları üretmek için son derece tekrarlanabilir bir yöntem göstermektir. Kök hücreler, agaroz ile karışık FDA onaylı Ferumoxides, kıkırdak hasarlarının içine implante edilerek 7T MR tarayıcı ile görüntülü olarak etiketlenir.

Ferumoxides implantasyonu Kıkırdak Kusur İnsan Mezenkimal Kök Hücreler Etiketli

Bu videoda, hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin hücresel alımını görselleştirmek ve ölçmek için bir test gösteriyoruz. Bu test, konfokal bir mikroskop kullanarak 3D floresan görüntülemeyi kullanır ve içselleştirilmiş EV'leri hücre yüzeyine yapışanlardan ayırt etmeye izin verir.

Hücre Dışı Vezikül Alım Testi: 3D Floresan Görüntüleme Tekniği Kullanarak Hücre Dışı Veziküllerin Hücresel Alımını Görselleştirmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu iletişim kuralı tarafından far-red floresan intra artiküler (IA) enjeksiyon yoluyla bir sıçan diz osteoartrit (KOA) modelinde etiketleme hücre sebat ve biodistribution insan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin (haMSCs) izlemek için etkili bir yöntem açıklanır.

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

Bu protokol için hızlı izole edilmesi insan tam kan üzerinden ekstraselüler veziküller ve belirli işaretleri karakterizasyonu için tam iş akışı floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile açıklanmaktadır. Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde göstermek ve hücre kültür supernatants için ayarlanabilir.

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Burada, bir 3D biyoreaktör kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerden çok sayıda GMP sınıfı eksozom üretmek için bir protokol sunuyoruz.

Sinovyal Sıvı Mezenkimal Kök Hücre Kaynaklı Eksozomların 3D Biyoreaktör Kültürü ile Büyük Ölçekli Hazırlanması

Makrofajdan türetilmiş küçük hücre dışı vesikleleri PKH boyalarla etiketlemek ve intratekal doğumdan sonra in vitro ve omurilikte alımlarını gözlemlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Vitro ve Omurilikte Floresan Etiketli Küçük Hücre Dışı Veziklin Alımı

Hücre dışı veziklinler (EV' ler) hücresel biyolojiye ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur. Hücrelerin ALDıĞı EV'leri görselleştirmek ve ölçmek için pratik tahlillere ihtiyaç vardır. Mevcut protokol, nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz tarafından EV izolasyonunu takiben konfokal mikroskopi yoluyla üç boyutlu floresan görüntüleme kullanarak EV alma testini önermektedir.

Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Veziklin Alımı Analizi

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Mevcut protokol, temsili EV'leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC'lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV'lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Bu protokol, mezenkimal stromal hücreler tarafından salınan hücre dışı veziküllerin (EV'ler) sıralanmasının ayrıntılı bir tanımını sağlar. Özellikle, cihaz ayarına ve sıralama koşullarının optimizasyonuna odaklanır. Amaç, özelliklerini koruyarak hücre dışı vezikülleri sıralamaktır.

Hücre dışı vezikül izolasyonu için başarılı bir sıralama ayarlama

Öğrenin, ekstraselüler vezikülleri etiketleyerek kıkırdak eksplantlarında göç ve alımı konfokal mikroskopi ile izleme yöntemini. Bu teknik osteoartrit araştırmalarında terapötik uygulamalar için değerlidir.

Kıkırdak Eksplantlarında Göç ve Alımı İzlemek için Hücre Dışı Veziküllerin Etiketlenmesi

Daha fazla video keşfet