Name: Echinococcus granulosusun Strobilated Formlarının Geçici Transdüksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Öğrenin, Echinococcus granulosus'un farklı gelişim evrelerinde üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanarak hızlı geçici transdüksiyon tekniğini. Bu yöntem, kistik ekinokokoz patogenezinin anlaşılması için genetik araştırmalarda yeni olanaklar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Tahran, İran'daki Ulusal Tıbbi Araştırma Geliştirme Enstitüsü'nden (NIMAD) 958680 ödül numarası altında Elit Araştırmacı Hibe Komitesi tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma, Ulusal Tıbbi Araştırma Geliştirme Enstitüsü ve Araştırma Etiği İnceleme Komitesi, No. 958680 tarafından onaylanmıştır. Lentivirüsler BSL-2 organizmaları olarak sınıflandırılır; Bu nedenle, bu protokoldeki tüm laboratuvar kültürü prosedürleri steril laboratuvar uygulamaları kullanılarak gerçekleştirilmiş ve NIH kılavuzlarına göre laminer bir akış başlığı altında yürütülmüştür. Şekil 1 , farklı E. granulosus aşamaları için çalışma protokolünün şematik bir sunumunu göstermektedir.
1. Kist hidatik toplanması
<ol><li>Bir mezbahada rutin olarak kesilen doğal olarak enfekte olmuş koyunlardan karaciğer hidatik kistlerini toplayın.</li>
	<li>Protoskolesleri (PSC'ler) aspire etmeden önce steril gazlı bez ve% 70 alkol kullanarak kist yüzeyini tamamen sterilize edin.</li>
	<li>20-50 mL hidatit sıvısını steril 50 mL konik tüplere aspire edin.</li>
	<li>Boşalttıktan sonra, kisti keskin bir bıçakla lekeleyin, germinal tabakayı steril bir 50 mL konik tüpe aktarın ve PSC'lerin toplanmasını arttırmak için kısa bir süre (~ 2 dakika) sallayın.</li>
	<li>PSC'leri 3-5x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.</li>
	<li>Bir ışık mikroskobu altında PSC'nin yaşayabilirliğini belirlemek için PSC'leri 5 dakika boyunca %0,1 eozin içinde gözlemleyin. Kültür için en az %95 uygulanabilirliğe sahip PSC'ler kullanın.</li>
	<li>PSC çökeltiyi 15-20 dakika boyunca 2 mL pepsin (2 mg / mL, pH 2) ile tedavi edin.</li>
	<li>Tek tek PSC'leri izole etmek için, PBS'deki PSC tortusunu yeniden askıya alın ve iki kat steril gazlı bezden yeni bir steril 50 mL konik tüpe geçirin. NOT: Bir ışık mikroskobu kullanarak 50 μL PSC tortuları üzerinde ortalama üç sayım hesaplayın. Sonraki denemelerde, PSC'leri/μL'yi belirlemek için tahmini değeri kullanın. Her bir kist hidatik izolatı, PCR dizilimi17 veya yüksek çözünürlüklü erime eğrisi analizi18 gibi moleküler yöntemlerle nükleotid polimorfizmlerine dayanarak karakterize edilmelidir.</li>
</ol>2. Yetişkin solucanlar elde etmek için E. granulosus'un PSC'lerinin bifazik yetiştiriciliği 
NOT: İzole PSC'ler, laminer akış kabini Sınıf II altında steril koşullarda kültürlenmelidir. Sonraki adımlara geçmeden önce bifazik kültür ortamının katı ve sıvı fazlarını ayrı ayrı hazırlayın19.
<ol><li>Bifazik kültür ortamını iki aşamadan oluşacak şekilde hazırlayın.<ol>
<li>
Katı faz için, 25 mL'lik bir şişeye 10 mL sığır serumu ekleyin ve 20-30 dakika boyunca 76 ° C'de pıhtılaşmaya bırakın.</li>
		<li>
Sıvı faz (modifiye CMRL) için, 100 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 36 mL% 5 maya ekstresi, 5.6 mL% 30 glikoz (damıtılmış suda), PBS'de 1.4 mL% 5 köpek safrası, 20 mM HEPES tamponu ve 260 mL CMRL-1066 ortamında 10 mM NaHCO3 karıştırın. Son olarak, karışıma penisilin (100 IU / mL) ve streptomisin (100 mg / mL) ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her 25cm2 kültür şişesine 10 mL sıvı faz ortamı ekleyin.</li>
	<li>Kültür şişesine ~5.000 PSC ekleyin ve şişeyi CO 2 inkübatörüne aktarın (37 °C, %5 CO2).</li>
	<li>24-48 saat sonra, PSC'leri katı fazlı (sığır serumu) yeni bir şişeye aktarın ve şişe başına aynı taze sıvı faz ortamından 1 mL ekleyin. Şişeleri CO 2 inkübatörüne aktarın (37 °C, %5 CO2).</li>
	<li>Her 5-7 günde bir, kültür ortamının rengindeki değişikliklere ve farklılaştırılmış PSC'lerin tahmini oranına bağlı olarak ortamı taze sıvı faz ortamı ile değiştirin. NOT: Protoscoleces kültürlendikten sonra çevresel değişikliklere hızlı bir şekilde tepki verir ve çoğu 2-3 hafta içinde farklılaşır. Besin maddelerinin tüketimi ve protoscoleces'in büyümesi ve gelişmesi nedeniyle, kültür ortamının pH'ı değişir ve rengi turuncu ve sarıya doğru kayar.</li>
</ol>3. E. granulosus'un PSC'lerinin monofazik yetiştiriciliği
<ol><li>Monofazik ekimin transdüksiyondan 24-48 saat önce yapıldığından emin olun.<ol>
<li>RPMI ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile25 cm2'lik bir kültür şişesinde kültür ~ 5.000 PSC.</li>
		<li>Şişeleri kullanıma kadar CO 2 inkübatörüne (37 °C, %5 CO2) aktarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Virüs üretimi ve hazırlanması için hücre kültürü
NOT: Kerman Tıp Bilimleri Üniversitesi Patoloji ve Kök Hücre Araştırma Merkezi'nden vektör üretimi için insan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücreleri elde edilmiştir.
<ol><li>5 × 105 HEK293T hücresini, %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içeren 5 mL DMEM içeren25 cm2'lik bir şişeye aktarın.</li>
	<li>HEK293T hücrelerini 37 ° C'de% 5 CO2'de inkübe edin ve her 48 saatte bir tam kültür ortamında geçirin. Son olarak, transdüksiyon20 için düşük pasajlı HEK293T hücreleri kullanın.</li>
</ol>5. Üçüncü nesil lentiviral vektörlerle virüsün üretimi ve hazırlanması
NOT: GFP muhabir genini eksprese etmek için lentivirüs vektörü pCDH513b (transfer vektörü) ve PLPII, PLPI ve PMD2G (yardımcı vektörler) kullanılmıştır. Bkz. Malzeme tablosu ve Ek Şekil S1.
<ol><li>1. Gün:<ol>
<li>HEK293T hücreleri21'i 6 kuyucuklu kültür plakalarında tripsinize ettikten sonra, tohum 7 ×% 10 FBS içeren taze antibiyotik içermeyen DMEM ile kuyu başına 10 4 hücre.
</li>
		<li>Kalsiyum fosfat yöntemi ile transdüksiyon için% 50-60 akıcılıkta hücreler kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2. Gün:<ol>
<li>Deneyden 2-3 saat önce hücre kültürü ortamını % 2 FBS içeren taze antibiyotik içermeyen DMEM ile değiştirin.</li>
		<li>1,5 mL'lik bir tüpte, 7 μg/μL pCDH513b (transfer vektörü), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI ve 2 μg/μL PMD2G (yardımcı vektörler) dahil olmak üzere üçüncü nesil lentiviral plazmidleri karıştırın.</li>
		<li>Karışıma HEPES tamponunu (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES ve 1,5 mM Na2HPO4; optimum pH aralığı, 7,00-7,28) 422 μL'lik bir hacme ekleyin.</li>
		<li>Karışıma 16 μL %1 Tris-EDTA (TE) tamponu ekleyin.</li>
		<li>Tüplere 62 μL 2,5 mM kalsiyum klorür ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
		<li>Bir Pasteur pipeti kullanarak karışıma 500 μL 2x HEPES-tamponlu salin (HBS) ekleyin, damla damla, damla damla. Yarı opak bir çözelti elde edilene kadar hafifçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Karışımı her plakaya yavaşça ekleyin ve yavaş dairesel hareketlerle dağıtın.</li>
		<li>Plakaları% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin ve 4-6 saat sonra ortamı % 10 FBS içeren antibiyotiksiz DMEM ile değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3. Gün:<ol>
<li>Ters çevrilmiş floresan mikroskobu kullanarak başarılı geçici transdüksiyonu ve hücre canlılığını onaylayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4. Gün:<ol>
<li>Her bir kuyucuğun süpernatantını toplayarak virüsleri kültür ortamından toplayın ve kullanıma kadar -70 ° C'de saklayın. NOT: Hasat edilen lentivirüsler konsantre edilebilir ve hassas transfeksiyon için titre edilebilir22.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. E. granulosus'un farklı evrelerinin virüs ile geçici transdüksiyonu
<ol><li>1. Gün:<ol>
<li>Gen transferi için 12 kuyucuklu bir kültür plakası kullanın. Kültür 5 × 103-5 × 104 HEK293T hücreleri üçlü olarak, iç referans olarak tam DMEM ortamı ile.</li>
		<li>Kültür RPMI ve %10 FBS'de üçlü olarak 150 taze PSC.</li>
		<li>Kültür 30% 10 ısı-inaktive FBS içeren DMEM'de üçlü olarak strobilated solucanlar. NOT: Tüm transdüksiyon ortamları antibiyotiksiz olmalıdır. Bu süreçte HEK293T hücreleri, PSC'ler ve strobilated solucanlar için üç adet tedavi edilmemiş kontrol kuyusu bulundurun.</li>
		<li>HEK293T hücrelerini ve solucanın farklı aşamalarını dönüştürmek için 4 μg / mL transfeksiyon reaktifi ile 1 × 106 virüsün bir karışımını hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>Karışımı her plakaya yavaşça ekleyin ve yavaş dairesel hareketlerle dağıtın. Plakaları bir CO 2 inkübatöründe 4-6 saat boyunca inkübe edin (37 ° C,% 5 CO2). Transfeksiyon reaktifinin toksik etkilerini en aza indirmek için her numunenin ortamını aynı tam kültür ortamıyla değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2. Gün:<ol>
<li>HEK293T hücreleri, PSC'ler ve strobilated solucanlar için geçici iletim verimliliğini artırmak üzere 6.1.4-6.1.5 arasındaki adımları yineleyin.</li>
		<li>Tüm plakaları, hücre ortamının tipine bağlı olarak aynı kültür koşullarına sahip bir CO2 inkübatöründe 24-48 saat boyunca inkübe edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3. Gün:<ol>
<li>Floresan mikroskobu kullanarak transdüksiyonun başarılı olup olmadığını kontrol edin. NOT: Gen transfer prosedüründe PCR / qPCR 20,23 veya Western blotting24 teknikleri gibi daha fazla doğrulayıcı tahlil kullanmayı düşünün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Deplazes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+alveolar+and+cystic+echinococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis.</a> Advances in Parasitology. 95, 315(2017).</li>
<li>Borhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcoses+in+Iran%2C+Turkey%2C+and+Pakistan%3A+Old+diseases+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium.</a> Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020(2021).</li>
<li>Eckert, J., Thompson, R. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+aspects+of+echinococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Historical aspects of echinococcosis.</a> Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).</li>
<li>Romig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+and+life+cycle+patterns+of+Echinococcus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species.</a> Advances in Parasitology. 95, 213(2017).</li>
<li>Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcosis%3A+control+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Echinococcosis: control and prevention.</a> Advances in Parasitology. 95, 55(2016).</li>
<li>Deplazes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+alveolar+and+cystic+echinococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis.</a> Advances in Parasitology. 95 (1), 315(2017).</li>
<li>Tsai, I. I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomes+of+four+tapeworm+species+reveal+adaptations+to+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism.</a> Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).</li>
<li>Koziol, U., Brehm, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Echinococcus+genomics+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research.</a> Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).</li>
<li>Zheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+hydatid+tapeworm+Echinococcus+granulosus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).</li>
<li>Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+transporters+in+the+protozoan+parasite+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22International+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania.</a> International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).</li>
<li>Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transfection+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+invadens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).</li>
<li>Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Platyhelminthes%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Transfection of Platyhelminthes.</a> BioMed Research International. 2015, 206161(2015).</li>
<li>Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lentiviral+vector+production+using+polyethylenimine-mediated+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection.</a> Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).</li>
<li>Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+transgenic+schistosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Establishing transgenic schistosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230(2011).</li>
<li>Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of microglial cells.</a> Glia. 50 (1), 48-55 (2005).</li>
<li>Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titering+lentiviral+vectors%3A+comparison+of+DNA%2C+RNA+and+marker+expression+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods.</a> Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).</li>
<li>Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variants+within+the+genus+Echinococcus+identified+by+mitochondrial+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).</li>
<li>Rostami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+technique+for+molecular+epidemiological+studies+of+cystic+echinococcosis%3A+differentiating+G1%2C+G3%2C+and+G6+genotypes+of+Echinococcus+granulosus+sensu+lato%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato.</a> Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).</li>
<li>Mousavi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+morphological+consequences+of+dsRNA-induced+suppression+of+tetraspanin+mRNA+in+developmental+stages+of+Echinococcus+granulosus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus.</a> Parasites and Vectors. 13 (1), 190(2020).</li>
<li>Afgar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-339+and+especially+miR-766+reactivate+the+expression+of+tumor+suppressor+genes+in+colorectal+cancer+cell+lines+through+DNA+methyltransferase+3B+gene+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition.</a> Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsinizing+and+subculturing+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Trypsinizing and subculturing mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755(2008).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499(2009).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031(2012).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).</li>
<li>Dezaki, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ex+vivo+harvested+and+in+vitro+cultured+materials+from+Echinococcus+granulosus+by+measuring+expression+levels+of+five+genes+putatively+involved+in+the+development+and+maturation+of+adult+worms%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms.</a> Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).</li>
<li>Mousavi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-specific+small+interfering+RNA+induces+consistent+expression+suppression+and+morphological+changes+in+Echinococcus+granulosus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+for+parasitic+nematodes+and+platyhelminths%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths.</a> Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).</li>
<li>Elegheert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+mammalian+cells+for+fast%2C+scalable+and+high-level+production+of+soluble+and+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2991(2018).</li>
<li>Mizukami, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+Echinococcus+multilocularis+protoscoleces+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+International%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference.</a> Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).</li>
<li>Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcus+as+a+model+system%3A+biology+and+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Echinococcus as a model system: biology and epidemiology.</a> International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).</li>
<li>Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThompson%2C+RCA+%22Advances+in+Parasitology%22">Advances in Parasitology</a>. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).</li>
<li>Brehm, K., Koziol, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcus-host+interactions+at+cellular+and+molecular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels.</a> Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).</li>
<li>Moguel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transgenesis+of+the+tapeworm+Taenia+crassiceps%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps.</a> SpringerPlus. 4, 496(2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Nematodların moleküler temelini ve Platyhelminthes biyolojisini anlamak, zoonotik parazitlerin patojenitesini anlamak için çok önemlidir27. Etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri12,27 de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasının önünde büyük bir engeldir. Bu çalışma, E. granulosus geçici transdüksiyonunda lentivirüsün mükemmel potansiyelini gös...

Kistik ekinokokkozis (CE), Taeniidae 1,2 familyasında küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus'un neden olduğu en önemli helmint hastalıklarından biridir. E. granulosus için immünodiagnostik ve aşı geliştirme konusunda kapsamlı çalışmalar yapılmıştır. Ancak parazit biyolojisinin moleküler temeli hakkında yetersiz bilgi sahibi olmak, hidatik hastalığının tanı, yönetim ve önlenmesinde önemli sınırlamalar getirmektedir 3,4,5,6.
Son yıllarda, genom dizilimi ve transkriptomik yöntemlerin gelişmesi nedeniyle, çeşitli araştırma grupları 7,8,9 tarafından yassı solucanlar üzerinde çok çeşitli moleküler çalışmalar yapılmıştır. Bununla birlikte, parazitler dünyasında, parazitik yassı solucanlarda gen transfer teknolojisindeki ilerlemeler, bazı protozoalar10,11,12 için geliştirilen yüksek oranda tekrarlanabilir geçici transdüksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında hala sınırlıdır.
Viral dağıtım sistemlerinin kullanımı, son yirmi yılda transgen dağıtımı ve gen / protein araştırmaları için gerekli bir araç olarak ortaya çıkmıştır13. Lentivirus hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri enfekte eder, böylece postmitotik hücreleri enfekte etmeyi mümkün kılar14,15,16. Son kanıtlar, memeli hücrelerinde lentivirüs tabanlı bir transdüksiyon sistemi kullanmanın, önceki knock-in / knock-down tekniklerinin sınırlamalarının çoğunun üstesinden gelme potansiyeli sunduğunu göstermektedir. GFP ekspresyonu gibi uygun moleküler belirteçlere sahip ekspresyon lentiviral vektörlerinin tasarımı ve yapımı daha önce16 olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, E. granulosus'un protoskolekslerinde ve strobilated solucanlarında GFP muhabir geninin lentiviral geçici transdüksiyonunu değerlendiriyoruz.

<table><tbody><tr><td>12 oyuklu kültür plakaları</td><td>SPL Yaşam Bilimleri</td><td>30012</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 kültür şişesi</td><td>SPL Yaşam Bilimleri</td><td>70325</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu kültür plakaları</td><td>SPL Yaşam Bilimleri</td><td>30006</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-500G</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 2.5&nbsp; mM</td></tr><tr><td>CMRL 1066 orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatör</td><td>memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Köpek safrası</td><td></td><td></td><td>Ötenazi yapılmış bir köpekten izole edilmiş ve 0.2 & mu ile sterilize edilmiştir; m şırınga filtresi</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009-5G</td>, <td>çalışma dışlama testi için Eosin'in% 0.1'ini hazırlar</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>DNAbiotech</td><td>DB9723-100ml</td><td>Isı inaktivasyonu&nbsp; nın&nin&nbsp; FBS (40 dakikada 30 dakika > C)</td></tr> <tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)</td> <td>DNAbiotech</td><td>DB9724-100ml</td><td>Isı inaktivasyonu&nbsp; nın&nin&nbsp; FCS (40 dakika içinde 30 dakika > C)</td></tr><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td>BONbiotech</td><td>BN_0012.1.14</td><td>İnsan embriyonik böbrek 293T</td></tr><tr><td>HEPES tamponlu salin (HBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>51558-50ML</td><td>2x konsantre</td></tr><tr><td>Ters floresan mikroskobu</td><td>OLYMPUS</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-10MU</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 100 IU / mL</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Roche</td><td>10108057001</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 2 mg / mL, pH 2</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>DNAbiotech</td><td>DB0011</td> Bu reaktif, DW Polibren (Transfeksiyon reaktifi) Sigma-Aldrich TR-1003-G <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> RPMI ortamında 1 dakikadan daha kısa sürede çözülür <tr><td></td><td>BioIdea</td><td>BI-1006-05</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat (NaHCO3)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137-25G</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 100 &�; g/mL</td></tr><tr><td>Üçüncü nesil lentiviral plazmid (pCDH513b)</td><td>SBI System Biosciences (BioCat GmbH)</td><td>CD513B-1-SBI</td><td>Transfer vektörü (ticari olarak İran Eğitim, Kültür ve Araştırma Akademik Merkezi (ACECR), Meşhed, İran Moleküler Tıp Araştırma Bölümü'nden elde edilmiştir)</td></tr><tr><td>Üçüncü nesil lentiviral plazmit (pLPI ve pLPII)</td><td>İnvitrojen (Yaşam Teknolojileri)</td><td>K4975-00</td><td>Yardımcı vektör (İran Eğitim, Kültür ve Araştırma Akademik Merkezi (ACECR), Meşhed, İran Moleküler Tıp Araştırma Bölümü'nden ticari olarak elde edilmiştir)</td></tr><tr><td>Üçüncü nesil lentiviral plazmit (pMD2G)</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 12259</td><td>Yardımcı vektör (ticari olarak İran Eğitim, Kültür ve Araştırma Akademik Merkezi (ACECR), Meşhed, İran Moleküler Tıp Araştırma Bölümü'nden elde edilmiştir)</td></tr><tr><td>Tris/EDTA Tamponu (TE)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9713-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935-50MG</td><td>1x çalışma solüsyonları (pH 7.4 > 7.6)</td></tr></tbody></table>

echinococcus granulosus'un strobilated formlarının geçici transdüksiyonu

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Kistik ekinokokkozis veya hidatik hastalık, köpeklerin bağırsağında bulunan küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus'un neden olduğu en önemli zoonotik paraziter hastalıklardan biridir. Patogenezin ve hastalık kontrol ve korunma mekanizmalarının anlaşılması için uygulanan genetik araştırmalara acil ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasını engellemektedir. Bu çalışma, E. granulosus'un metacestod ve strobile formlarında lentiviral gen geçici transdüksiyonunun potansiyelini göstermektedir. Protoskoleces (PSC'ler) hidatik kistlerden izole edildi ve strobile solucanlara dönüşmek üzere spesifik bifazik kültür ortamına aktarıldı. Solucanlar, bir transdüksiyon süreci kontrolü olarak HEK293T hücreleri ile birlikte hasat edilmiş üçüncü nesil lentivirüs ile transfekte edildi. Strobillenmiş solucanlarda 24 saat ve 48 saat boyunca belirgin bir floresan tespit edildi ve bu da E. granulosus'ta geçici lentiviral transdüksiyonu gösterdi. Bu çalışma, tenyalarda lentivirüs bazlı geçici transdüksiyona yönelik ilk girişimi sunmakta ve yassı solucan biyolojisi üzerine yapılan deneysel çalışmalarda potansiyel etkileri olan umut verici sonuçları göstermektedir.

Burada, E. granulosus'ta üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak hızlı ve etkili bir geçici transdüksiyon tekniği tanımlanmıştır. PSC'leri, daha önce25,26'da tanımlandığı gibi, strobillenmiş solucanlar elde etmek için bifazik bir kültür ortamında kültürledik. Protoscoleces in vitro 6 hafta sonra strobilated solucanlar haline gelir. Bifazik kültür ortamında, invaginasyonlu PSC'ler (Şekil 2A), evajine PSC'ler (Şekil 2B<...

Üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak Echinococcus granulosus'un farklı gelişim evrelerinde hızlı geçici transdüksiyon tekniğini tanımladık.

Echinococcus granulosus'un Strobilated Formlarının Geçici Transdüksiyonu

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Echinococcus granulosus'un strobilated formlarının geçici işlemi. Üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak Echinococcus granulosus'un farklı gelişim evrelerinde hızlı geçici transdüksiyon tekniğini tanımladık. Kistik ekinokokkozis veya hidatik hastalık, köpeklerin bağırsağında bulunan küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus'un neden olduğu en önemli zoonotik paraziter hastalıklardan biridir.Patogenez, hastalık kontrol ve korunma mekanizmalarını anlamak için uygulanan genetik araştırmalara acil ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasını engellemektedir. Parazitik yassı solucanlarda gen transferindeki ilerlemeler, protozoan parazite kıyasla hala sınırlıdır.Viral dağıtım sisteminin kullanımı, son yirmi yılda transgen iletimi ve gen / protein araştırması için gerekli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, GFP muhabir geninin Echinococcus granulosus'un protoskoleslerine ve strobilated solucanlarına lentiviral geçici transdüksiyonunu değerlendirdik. Şekil 1, Echinococcus granulosus evreleri için çalışma protokolünün şematik bir sunumunu göstermektedir.Birincisi, kist hidatik toplamak. Bir mezbahada rutin olarak kesilen doğal olarak enfekte olmuş koyunlardan karaciğer hidatik kistlerini toplayın. Protoscoleces'i aspire etmeden önce steril gazlı bez ve% 70 alkol kullanarak kist yüzeyini tamamen sterilize edin.20 ila 50 mL hidatik sıvıyı steril 50 mL konik tüplere aspire edin. Boşalttıktan sonra, kisti keskin bir bıçakla temizleyin, germinal tabakayı steril bir 50 mL konik tüpe aktarın ve protoscoleces koleksiyonunu arttırmak için kısa bir süre çalkalayın. Protoscoleces PBS tamponu ile üç ila beş kez yıkayın.Bir ışık mikroskobu altında protoscoleces'in yaşayabilirliğini belirlemek için protoscoleces'i beş dakika boyunca% 0.1 eozin içinde gözlemleyin. Kültür için en az% 95 canlılığa sahip protoscoleces kullanın. Protoscoleces çökeltiyi 15 ila 20 dakika boyunca iki mL pepsin ile tedavi edin.Bireysel protoscoleces'i izole etmek için, protoscoleces tortusunu PBS'de yeniden askıya alın ve iki kat steril gazlı bezden yeni bir steril 50 mL konik tüpe geçirin. İki, yetişkin solucanlar elde etmek için Echinococcus granulosus'un protoskoleslerinin bifazik yetiştiriciliği. Her 25 santimetrekarelik kültür şişesine 10 mL sıvı faz ortamı ekleyin.Kültür şişesine yaklaşık 5.000 protoscoleces ekleyin ve CO2 inkübatörüne aktarın. 24 ila 48 saat sonra, protoskolleri katı fazlı yeni bir şişeye aktarın ve şişe başına aynı taze sıvı faz ortamından bir mL ekleyin. Şişeleri inkübatöre, 37 santigrat derece,% 5 CO2'ye aktarın.Her beş ila yedi günde bir, ortamı taze sıvı faz ortamı ile değiştirin. Üç, bir Echinococcus granulosus'un protoskoleslerinin monofazik yetiştiriciliği. Monofazik ekimin transdüksiyondan 24 ila 48 saat önce yapıldığından emin olun.Kültür RPMI ve% 10FBS ile 25 santimetrekare kültür şişesinde yaklaşık 5.000 protoskosel. Şişeleri kullanana kadar CO2 inkübatörüne aktarın. Dört, virüs üretimi ve hazırlanması için hücre kültürü.500.000 HEK hücresini,% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 mikrogram / mL streptomisin içeren 5 mL DMEM içeren 25 santimetre karelik bir şişeye aktarın. HEK2 hücrelerini% 5 CO2'de 37 santigrat derecede inkübe edin ve her 48 saatte bir tam kültür ortamında geçirin. Son olarak, transdüksiyon için düşük pasajlı HEK hücrelerini kullanın.Beş, üçüncü nesil lentiviral vektörlerle virüsün üretimi ve hazırlanması. İlk gün, HEK hücrelerini 6 kuyucuklu bir kültür plakasında tripsinize ettikten sonra,% 10 FBS içeren taze antibiyotiksiz DMEM ile kuyu başına 70.000 hücre tohumlayın. Kalsiyum fosfat yöntemiyle transdüksiyon için% 50 ila% 60 akıcılıkta hücreler kullanın.İkinci gün, deneyden iki ila üç saat önce hücre kültürü ortamını% 2 FBS içeren taze antibiyotik içermeyen DMEM ile değiştirin. 1,5 mL'lik bir tüpte, 7 mikrogram / mikrolitre pCDH513b transfer vektörü, 4 mikrogram / mikrolitre PLPII, 4 mikrogram / mikrolitre PLPI ve 2 mikrogram / mikrolitre PMD2G yardımcı vektörleri dahil olmak üzere üçüncü nesil lentiviral plazmidleri karıştırın. 422 mikrolitre hacme ulaşmak için karışıma HEPES tamponu ekleyin.Karışıma 16 mikrolitre% 1 TE tamponu ekleyin. Tüplere 62 mikrolitre 2,5 mL kalsiyum klorür ekleyin ve iyice karıştırın. Karışıma 500 mikrolitre 2x HBS tamponu ekleyin, bir Pasteur pipet kullanarak bir ila iki dakika içinde damla damlatın.Yarı opak bir çözelti elde edilene kadar hafifçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Sonunda, karışımı her plakaya yavaşça ekleyin ve yavaş dairesel hareketlerle dağıtın. Plakaları% 5'lik bir CO2 inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin ve dört ila altı saat sonra ortamı% 10 FBS içeren antibiyotiksiz DMEM ile değiştirin.Üçüncü gün, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak başarılı geçici transdüksiyonu ve hücre canlılığını onaylayın. Dördüncü gün, her bir kuyucuğun süpernatantını toplayarak virüsleri kültür ortamından toplayın ve kullanıma kadar negatif 70 santigrat derecede saklayın. Echinococcus granulosus'un farklı aşamalarının virüs ile altı, geçici transdüksiyonu.İlk gün, gen transferi için 12 kuyucuklu bir kültür plakası kullanın. Kültür 5.000 ila 50.000 HEK hücresi, iç referans olarak tam bir DMEM ortamı ile üçlü olarak. Kültür RPMI ve% 10 FBS'de üçlü olarak 150 taze protoskolek.Kültür 30 strobilated solucanlar DMEM ve% 10 ısı ile inaktive FBS'ye üçlü olarak bölünür. HEK hücrelerini ve solucanın farklı aşamalarını dönüştürmek için dört mikrogram / mL transfeksiyon reaktifi ile 1 milyon virüsün bir karışımını hazırlayın. Karışımı her plakaya yavaşça ekleyin ve yavaş dairesel hareketlerle dağıtın.Plakaları bir CO2 inkübatöründe dört ila altı saat boyunca inkübe edin, 37 santigrat derece, % 5 CO2. Transfeksiyon reaktiflerinin toksik etkilerini en aza indirmek için her numunenin ortamını aynı tam kültür ortamıyla değiştirin. İkinci gün, HEK hücreleri, protoskoleksler ve strobillenmiş solucanlar için geçici transdüksiyonun verimliliğini artırmak için önceki iki adımı tekrarlayın.Tüm plakaları, hücre ortamının türüne bağlı olarak aynı kültür koşullarına sahip bir CO2 inkübatöründe 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Üçüncü gün, floresan mikroskobu kullanarak transdüksiyonun başarılı olduğundan emin olun. Temsili sonuçlar.Burada üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak Echinococcus granulosus'ta hızlı ve etkili bir geçici transdüksiyon tekniği tanımlanmıştır. Önceki çalışmalarımıza göre strobillenmiş solucanlar elde etmek için bifazik kültür ortamlarında protoscoleces kültürledik. Protoscoleces, altı haftalık bir in vitro kültürden sonra strobillenmiş solucanlara dönüşür.Bifazik kültür ortamında Echinococcus granulosus'un farklı evreleri gözlenmiştir, bunlar arasında invaginated protoscoleces, Şekil 2A, evaginated protoscoleces, Şekil 2B ve birinci ve üçüncü proglottid formasyonlu strobilated solucanlar, Şekil 2C ile E.Protoscoleces ve sırasıyla monofazik ve bifazik ekimlerden elde edilen strobilated solucanlar GFP eksprese eden lentivirüsler tarafından transfekte edilmiştir, Şekil 3. HEK hücreleri, GFP'yi geçici transdüksiyon süreci kontrolü olarak açıkça ifade etti. Yetişkin solucanlar GFP'yi tegumental tabakada en belirgin şekilde ifade ettiler.Bununla birlikte, protoskoleces 48 saat sonra biraz daha düşük bir GFP ekspresyonu seviyesi göstermiştir. Protoskolekslerin etrafındaki bazı kist sıvı kalıntıları ve/veya germinal tabaka kalıntıları, transfekte edilen örneklerde bazı floresan arka plana neden olmuştur. HEK hücrelerinde ve strobillenmiş solucanlarda floresan yoğunluğu 24 ve 48 saat sonra artmıştır.Nematodların moleküler temelini ve Platyhelminthes biyolojisini anlamak, zoonotik parazitlerin patojenitesindeki en önemli sınırlardan biridir. Etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasının önündeki en büyük engeldir. Bu çalışmanın temel amacı, gelecekteki Ekinokokkoz araştırmalarında kritik olacak olan lentiviral vektör transdüksiyonu sürecini göstermekti.Sonuçlar, strobillenmiş solucanların, genin geçici transdüksiyonuna protoscoleces'ten daha duyarlı olduğunu göstermektedir; bu, strobilated formlardaki geniş tegumental yapının bir sonucu olabilir. Bununla birlikte, lentiviral transdüksiyonun doğası gereği, çok hücreli protoskoleksler ve strobillenmiş solucanlardaki floresan yoğunluğu tipik olarak tek katmanlı HEK hücrelerinden çok daha düşüktür. Echinococcus için genomik ve transkriptomik seviyelerde uygulamalı genetik araştırmalara ve çok çeşitli parazitik ve serbest yaşayan yassı solucan model sistemlerine acil ihtiyaç vardır.Bu nedenle, tenyalara gen transfer sürecinin geliştirilmesi, virüs tabanlı gen haritalama veya CRISPR-Cas9 aracılı gen düzenleme gibi yeni tekniklerin potansiyel kullanımının yolunu açmaktadır. Bu çalışma, bir tenya modelinde lentiviral transdüksiyonu sunmakta ve yassı solucan biyolojisi için potansiyel etkileri olan umut verici sonuçlar göstermektedir. Yine de, yöntemleri iyileştirmek ve bu tekniklerin gelecekteki deneyler için uygulanabilirliğini geliştirmek için daha derinlemesine çalışmalara ihtiyaç vardır.

transient-transduction-strobilated-forms-echinococcus

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri,...

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir...

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

Bu videoda, floresan raportör proteini kodlayan plazmit DNA'sını tavuk Eimeria parazitinin sporozoit formuna iletmek için elektroporasyon tabanlı bir transfeksiyon prosedürü olan nükleofeksiyonu açıklıyoruz.

Parazit Formlarının Nükleofeksiyonu: Floresan Protein Kodlayan Plazmitleri Sporozoit Çekirdeğine Vermek için Elektroporasyon Tabanlı Bir Transfeksiyon Yöntemi

Burada, zebra balığı otik vezikülünde lokalize bir bakteriyel enfeksiyonun oluşturulması ve görüntülenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Parazitik nematodlar Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti için fonksiyonel genomik araç seti transgenez, CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez ve RNAi'yi içerir. Bu protokol, transgenleri ve CRISPR bileşenlerini S. stercoralis ve S . ratti'ye tanıtmak için intragonadal mikroenjeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterecektir.

Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi

Elektroporasyon, eksojen DNA'yı Rickettsia cinsine sokmak için hızlı, geniş çapta benimsenmiş bir yöntemdir. Bu protokol, Rickettsia cinsindeki zorunlu hücre içi bakterilerin dönüşümü için yararlı bir elektroporasyon yöntemi sağlar.

Kene Hücre Hatlarında Floresan Protein İfade Eden Mekik Vektörü ile Rickettsia spp.'yi Dönüştürmek için Bir Elektroporasyon Yöntemi

Bu çalışma, Chagas hastalığından sorumlu patojen olan Trypanosoma cruzi'nin üç in vitro yaşam döngüsü aşamasında ultrayapı genişletme mikroskobunu gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Hücre iskeleti proteinleri ve pan-proteom etiketleme için optimize edilmiş tekniği dahil ediyoruz.

Ultrastrüktürel Genleşme Mikroskobu in Üç İn Vitro Yaşam Döngüsü Aşamaları Trypanosoma cruzi

Bu protokol, Naegleria gruberi trofozoitlerini, trofozoitlerin in vitro olarak geçirilmesi boyunca ve ayrıca kistleme ve kistleme yoluyla sürdürülen bir yapı ile transfekte etmek için bir metodolojiyi tanımlar.

Naegleria gruberi rDNA'nın Moleküler Klonunun N. gruberi Trophozoites'e Transfeksiyonu

Burada, Echinococcus granulosus'tan in vitro kültür koşullarını, izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) artan oluşumunu açıklıyoruz. Küçük EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin tutulumu ve fenotipik modülasyonları, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak incelendi.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Öğrenin, Echinococcus granulosus'un farklı gelişim evrelerinde üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanarak hızlı geçici transdüksiyon tekniğini. Bu yöntem, kistik ekinokokoz patogenezinin anlaşılması için genetik araştırmalarda yeni olanaklar sunar.

Echinococcus granulosus'un Strobilated Formlarının Geçici Transdüksiyonu

Daha fazla video keşfet