Akış Sitometrisi ile Kalite Kontrollü Balgam Analizi
August 9th, 2021
Bu protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna dağıtmak ve standart akış sitometrik platformlarındaki hücresel alt kümelerin daha sonra karakterizasyonu için etkili bir yöntemi açıklar.
Bu protokol, balgam işleme ile ilgili geçmişte yüksek verimli klinik tanı amaçları için akış sitometrisi ile kullanımını zorlaştıran yaygın zorlukları çözer. Bu protokol, antikor ve boya boyama hacimlerini belirlemek için balgam ağırlığı kullanılarak zaman kazanmak için tasarlanmıştır. Boyama inkübasyonu sırasında, aşağı akış adımları için hücre sayımı yapılabilir.
Akış sitometresinde çalışırken herhangi bir sorunu önlemek için doğru yeniden süspansiyon hacmini belirlemek için doğru bir hücre sayısı elde etmek önemlidir. Bu protokol, akciğer sağlığını araştıran araştırma alanlarına ilişkin içgörü sağlayabilir. Örneğin KOAH, astım, akciğer kanseri gibi hastalıklar veya COVID'in etkileri incelenebilir.
Prosedürü gösteren dr. Michael Lai olacak, laboratuvarımdan bir araştırma ve geliştirme bilimcisi. Başlangıç olarak, ayrışma reaktiflerinin hacimlerini belirlemek için balgam örneğini tartın. Numuneyi balgam ağırlığına göre uygun büyüklükteki gemiye aktarın, ardından %0,5 NAC gram başına bir mililitre ve gram başına %0,1 DTT'lik dört mililitre ekleyin.
Örnekleri 15 saniye boyunca maksimum hızda vorteksleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca maksimum hızda kayan. NAC ve DTT'yi nötralize etmek için bu numuneyi 4X Hanks dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ile seyreltin. Ve hızlı girdaplamadan sonra, numuneyi oda sıcaklığında beş dakika sallayın.
Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için hücre süspansiyonunu 100 mikrometre naylon ağ hücresi süzgecinden bir veya daha fazla 50 mililitre konik santrifüj tüpüne filtreleyin. Pelet hücreleri aşağı. Süpernatant aspirasyondan sonra, peletleri bir 15 mililitrelik konik tüpte birleştirin ve aynı koşullar altında HBSS ile yıkayın.
Hücre peletini balgam örneğinin ilk ağırlığına göre belirlenen bir arabellek hacminde yeniden kullanın. Hücre süspansiyonundan bir aliquot alın ve balgam seyreltmenin 10 mikrolitresini% 0.4 trippan mavisi 30 mikrolitre ile karıştırın, ardından canlı / ölü hücre sayısı için bir hemositometrenin sayım odalarına yükleyin. Kompanzasyon tüplerinde balgam etiketle.
Metinde belirtildiği gibi her balgam hücresi tüpüne ve kompanzasyon tüplerine HBSS antikoru ve boyası ekleyin. Balgam hücrelerini tahlil tüplerine ekleyin ve metinde belirtildiği gibi kompanzasyon tüplerine kompanzasyon boncukları ekleyin. Işıktan korunan buz üzerindeki tüm tüpleri 35 dakika boyunca kuluçkaya bırakın.
Daha sonra tüpleri buz gibi HBSS ile doldurduktan sonra, 800 kez G.For compensation tüplerinde 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin, süpernatantı peletlere mümkün olduğunca yakın emiş ve gevşetmek için peletleri hafifçe vurun. Daha sonra, kompanzasyon tüplerine 0,5 mililitre soğuk HBSS ekleyin ve tüpleri akış sitometri analizi için gerekli olana kadar hafif korumalı bir alanda buz üzerinde saklayın. Daha sonra balgamsız, izotip, kan ve epitel tüplerinden süpernatantı aspire edin.
Tüpleri sallayarak peletleri gevşetin. Lekesiz ve izotip tüplere iki mililitre%1 PFA ve kan ve epitel tüplerine 10 mililitre ekleyin. Tüpleri 30 dakika boyunca hafif korumalı bir şekilde buz üzerinde kuluçkaya yatırın, ardından maksimum hızda hızlı bir şekilde girdap yapın ve tekrar 30 dakika daha kuluçkaya yatın.
Daha sonra tüpleri buz gibi HBSS ile doldurun. Daha sonra, tüpleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1,600 kez Santrifüjleyin G.Hücre peletini bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatant aspire edin ve hücreleri gevşetmek için tüpü parmaklarla hareket ettirin, ardından lekesiz ve izotip tüplere 200 mikrolitre soğuk HBSS ekleyin. Toplam hücre sayısına göre kan ve epitel tüpünün yeniden canlandırılması için gerekli HBSS hacmini hesaplayın ve ekleyin.
Akış sitometri analizi yapılana kadar tüm numuneleri dört santigrat derecede buz üzerindeki ışıktan korunan kompanzasyon tüplerinde saklayın. Kullanılan akış sitometresi için uygun başlangıç yordamlarını uygulayın. İleri saçılma ve yan dağılım voltajlarının, boncukları eksenlere çok yakın yerleştirmeden arsayı kaplamak için nist boncuklarını yerleştirmek üzere ayarlandığını sağlamak için Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü veya NIST boncuklarının karışımını kullanın.
Akış hızını LSRII için orta veya Navios EX için yüksek olarak ayarlayın. Hücre popülasyonlarını ölçeğe yerleştirmek için dağılım ve floresan parametreleri için kullanılan her parametre için voltajları ayarlayın. Gerilimleri buna göre ayarlamak için kılavuz olarak gating stratejisine sahip figürleri kullanın. Önce lekesiz balgam örneği, ardından izotip lekeli örnek ve ardından kan tüpü ve epitel tüpü için veri alın.
Lekeleme için antikor veya boya hacimlerini belirlemek için balgam ağırlığı kullanıldı. Balgam ağırlığı ve hücre verimi arasındaki korelasyon güçlü değildi. Balgam örnekleri, hücre veriminin dağılımında kümelenen dört ağırlık kategorisine ayrılmıştır.
Kullanılan her antikor plato fazında bir konsantrasyonda titratlandı ve en yüksek boyama indeksi çalışma konsantrasyonu olarak seçildi. Tüm ağırlık kategorilerinde, ortalama SEC kontaminasyonu, gösterilen canlı hücrelerin yüzdesi ile% 20'den azdı. Sunulan analiz için kullanılan gating stratejisidir.
Nist boncukları, enkazı ortadan kaldırmak için balgam örneğine uygulanan bir kapı kurmak için kullanıldı. Küçük enkaz genişlik kapısı tarafından daha da ortadan kaldırıldı. Canlılık boyası ölü hücreleri ortadan kaldırmak için kullanılırken, singlet kapısı çiftleri çıkardı.
Anti-CD45 antikor etiketlemesi, canlı tek balgam hücrelerinin bir kan hücresine ve kan dışı bir hücre bölmesine ayrılmasına izin veriyordu. Navios EX, LSRII ve Lirik'ten elde edilen profiller karşılaştırıldı. Enkazı, ölü hücreleri, çiftleri ortadan kaldırmak ve kan ve kan dışı profilleri karşılaştırmak için gating stratejisi gösterilmiştir.
Bu teknik, invaziv olmayan bir klinik test olarak kullanılmak üzere akciğer kanseri riskini tespit etmek için bu yöntemleri uygulamamızı sağladı.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, balgam işleme ile ilgili yaygın zorlukları çözerek, yüksek verimli klinik teşhis için akış sitometrisi ile kullanımını kolaylaştırır. Başarılı bir akış sitometrisi analizi için doğru hücre sayımı ve yeniden süspansiyon hacminin önemini vurgular.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Akış Sitometrisi
- Hücre Biyolojisi
- Akciğer Sağlığı Araştırması
Arka Plan
- Balgam işleme, tarihsel olarak akış sitometrisi için zorluklar yaratmıştır.
- Doğru hücre sayımları, etkili analiz için kritik öneme sahiptir.
- Araştırma alanları KOAH, astım, akciğer kanseri ve COVID-19 içerir.
- Bu protokol, klinik teşhis için balgam analizini basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Balgamı tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için verimli bir yöntem sağlamak.
- Standart akış sitometrik platformlar kullanarak hücresel alt grupları karakterize etmek.
- Akciğer sağlığı ve ilgili hastalıklar üzerindeki araştırmaları geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Balgam ağırlığına göre antikor ve boya boyama hacimlerini belirleme.
- Boyama inkübasyonu sırasında hücre sayımı yapma.
- Sonraki analiz için akış sitometrisi kullanma.
- Araştırma içgörüleri için hücresel alt grupları karakterize etme.
Ana Sonuçlar
- Protokol, balgamı başarıyla tek hücreli süspansiyonlara ayırmaktadır.
- Doğru hücre sayımları sağlanmakta ve etkili akış sitometrisi kolaylaştırılmaktadır.
- Akciğer sağlığı ve hastalık mekanizmaları hakkında içgörüler sağlanmaktadır.
- Basitleştirilmiş süreç, klinik teşhis yeteneklerini geliştirmektedir.
Sonuçlar
- Bu protokol, balgam analizi için güvenilir bir yöntem sunar.
- Akış sitometrisi için balgam işlemindeki önceki zorlukları ele alır.
- Bulgular, akciğerle ilgili hastalıklar üzerindeki daha fazla araştırmayı destekler.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in lung disease research by enabling high-throughput, quantitative analysis of sputum via flow cytometry. It transforms a traditionally low-yield, labor-intensive cytology method into a scalable, reproducible platform suitable for biomarker discovery and target validation in respiratory therapeutics. The approach supports mechanistic de-risking by providing immunophenotypic resolution of hematopoietic and epithelial lineages while excluding confounding debris and squamous epithelial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular heterogeneity in lung microenvironment to validate therapeutic targets in inflammatory and oncologic pathways.
- Operational Value: Reduces reliance on specialized cytopathology personnel through automated, standardized phenotyping.
- Predictive Value: Supports target confidence by quantifying immune cell infiltration and epithelial activation states relevant to COPD, asthma, lung cancer, and post-COVID lung pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiparametric readouts of CD45+ and CD45− populations for assay standardization across drug screening campaigns.
- Operational Value: Enables high-throughput sample processing using weight-based reagent normalization, improving reproducibility across sites and operators.
- Platform Reuse: Demonstrated compatibility across Navios EX, LSR II, and Lyric cytometers, supporting cross-platform assay transfer and centralized core lab utilization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses lung-specific macrophage identification as a quality control to confirm sample origin, enhancing confidence in preclinical-to-clinical continuity.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal monitoring of immune and epithelial shifts in disease models, supporting go/no-go decisions in lead optimization.
- Predictive Confidence: Provides a biomarker-ready framework for evaluating target engagement in pulmonary inflammation or tumor microenvironment modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized immune profiling of lung-derived samples, supporting hypothesis testing in early discovery and mechanistic validation in preclinical stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven exploration of lung immune landscapes and stromal interactions in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular readouts suitable for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Generates multiparametric flow cytometry data enabling statistical comparison of treatment effects across experimental groups.
- Translational Research: Supports biomarker alignment through lineage-specific gating and viability-based exclusion of nonviable or contaminating cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, weight-normalized workflow that can be deployed across multiple sites and instrument platforms for consistent data generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from debris and squamous epithelial contamination.
- Operational Value: Improves throughput and reproducibility via sputum weight-based reagent dosing and standardized gating strategies.
- Strategic Value: Enables faster, data-driven go/no-go decisions in respiratory drug programs by providing quantifiable immune and epithelial phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating translatable biomarker data from non-invasive lung samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, gating, and immunophenotyping of primary human cells.
- Dependent on access to flow cytometers with adequate fluorescence detection and scatter resolution.
- Necessitates standardization of staining protocols and QC metrics (e.g., NIST bead normalization) across sites.
- Requires adaptation of antibody panels based on target biology while maintaining viability and singlet gating.
- Limited by sample quality and sputum viscosity, which may affect dissociation efficiency and cell yield.
