Name: Akış Sitometrisi ile Kalite Kontrollü Balgam Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Öğrenin, akış sitometrisi ile balgam analizi yöntemini kullanarak akciğer sağlığı araştırmalarında hücre alt kümelerini karakterize etme tekniğini. Bu protokol, yüksek verimli klinik tanı için hücre sayımı doğruluğunu artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

David Rodriguez'e figür hazırlığındaki yardımı için teşekkür etmek istiyoruz. Balgam örnekleri UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) ve UL1 TR001120 (CTSA hibesi) tarafından desteklenen UT Health San Antonio Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Tesisi'ndeki BD LSR II'de çalıştırıldı.

Balgam işlemenin tüm adımları, uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir.
1. Balgam ayrışmaya başlamadan önce reaktif hazırlama
<ol><li>%1 Paraformaldehit (PFA), buzda numune başına 25 mL çözün ve kullanıma kadar soğuk tutun. DİkKAT: PFA inhalasyon ve cilt teması ile toksiktir. Düzelticiyi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve kullanıma kadar 25 mL aliquots içinde -20 °C'de dondurun.</li>
	<li>Numunenin ağırlığını yaklaşık olarak kavr ve 2.2. adım için yeterli miktarda% 0.1 Dithiothreitol (DTT) çözün ve 37 ° C'ye getirin. (DTT'nin aliquotları kullanılmadan önce -20 °C'de saklanmalıdır.)</li>
	<li>Adım 2.2 için 37 °C'ye kadar yeterli %0,5 N-asetil-L-sistein (NAC) getirin. (NAC haftalık taze hale getirilmeli ve kullanılmadan önce 4 °C'de saklanmalıdır.)</li>
</ol>2. Balgam ayrışması
<ol><li>Ayrışma reaktiflerinin hacimlerini belirlemek için balgam örneğini tartın. NOT: başlangıç ağırlığı ≤3 g ise küçük, >3 g ama ≤8 g ise orta, >8 ise büyük ancak ≤16 g ve bir örnek >16 g ağırlığındaysa ekstra büyük olarak kabul edilir. Protokol boyunca küçük, orta, büyük ve ekstra büyük endikasyonlar kullanılacaktır. Ayrışma ve etiketleme için gereken reaktif miktarı balgam örneğinin boyutuna göre farklılık gösterir.</li>
	<li>Küçük bir numuneyi temiz bir 50 mL konik tüpe, orta bir numuneyi temiz 250 mL plastik tek kullanımlık şişeye veya büyük ve ekstra büyük bir numuneyi temiz bir 500 mL plastik tek kullanımlık şişeye aktarın. %0,5 NAC 1 mL/g örnek ağırlığı ve %0,1 DTT 4 mL/g numune ağırlığı ekleyin.</li>
	<li>Maksimum hızda (15 s için) girdap ve ardından 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (maksimum hızda) kayan.</li>
	<li>NAC ve DTT'yi nötralize etmek için numuneyi dört cilt Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (numune + reaktiflerin toplam hacmine göre) ile seyreltin; Vorteks maksimum hızda hızlı bir şekilde ve maksimum hızda 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kayar.</li>
	<li>Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için hücre süspansiyonunu 100 μm naylon ağ hücresi süzgeçlerinden bir veya daha fazla 50 mL konik santrifüj tüpüne filtreleyin.</li>
	<li>Hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 800 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin, tüm peletleri bir 15 mL konik tüpte birleştirin ve ardından aynı koşulları kullanarak peletleri HBSS ile yıkayın.</li>
	<li>Hücre peletini balgam örneğinin ilk ağırlığına göre belirlenen bir arabellek hacminde yeniden kullanın. NOT: Küçük bir numune 250 μL HBSS'de yeniden sınıflanır. Orta boy bir numune 760 μL HBSS'de yeniden kullanılabilir. Büyük ve ekstra büyük numuneler 1460 μL HBSS'de yeniden sınıflanır.</li>
	<li>Trypan Blue kullanarak canlı/ölü hücre sayısı için hücre süspansiyonunun bir aliquot'ını alın. NOT: Küçük bir numune için 5 μL kullanın. Orta, büyük veya ekstra büyük bir numune için 10 μL kullanın.<ol>
<li>1:40'lık son bir numune seyreltme elde etmek için balgam seyreltmenin 10 μL'sini% 0,4 Trypan Blue'nun 30 μL'si ile karıştırın. Hücre sayısı için hemositometrenin sayım odalarına yükleyin. NOT: Hücre sayıları doğru bir sayı elde etmek için çok düşük veya çok yüksekse son seyreltmeyi ayarlamak gerekebilir. Balgam hücrelerini SEC'lerden ve döküntülerden doğru bir şekilde ayırt etmek için Guiot ve ark.20'ye danışmak burada şiddetle tavsiye edilir. Bu, doğru bir hücre sayısı için gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ekstra büyük numuneden, toplamdan 50 x 106 hücre çıkarın ve toplam 1700 μL hacim oluşturmak için yeterli HBSS ile yeni bir tüp ekleyin. NOT: Bunu protokolün geri kalanı için büyük bir örnek olarak düşünün. Arta kalan örnekler atılabilir veya başka amaçlar için kullanılabilir.</li>
</ol>3. Antikor ve canlılık boyası boyama
<ol><li>Antikor ve boyama boyası seçimi NOT: Tablo 1 , bu protokolde kullanılan antikorları ve canlılık boyasını ve tanımladıkları hücre popülasyonlarını gösterir.<ol>
<li>Balgam hücrelerini içeren tüpleri etiketleyin (etiketler için Tablo 2'ye bakın).</li>
		<li>Tespit edilmemiş hücrelere sahip numune tüpü ve izotip kontrolüne sahip tüp için 5 mL akış sitomemetri tüpleri (kullanılan akış sitometresi ile uyumlu) kullanın. Kan ve epitel tüp örnekleri için 15 mL konik tüp kullanın. NOT: Bu numuneler antikor boyama ve fiksasyonu takiben akış sitometri tüplerine aktarılacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kompanzasyon tüplerini etiketle (Tablo 3). NOT: Kullanılan akış sitometresi ile uyumlu 5 mL akış sitomemetri tüpleri kullanın.</li>
	<li>Sırasıyla Tablo 2 ve Tablo 3'te belirtildiği gibi balgam hücresi tüplerinin ve kompanzasyon tüplerinin her birine HBSS, antikor ve/veya boya miktarını ekleyin. NOT: Tüm tüplerin boyama süresinin tutarlı olduğundan emin olmak için hücre veya kompanzasyon boncukları eklemeden önce tüm tüplere tampon (HBBS), antikorlar ve boya ekleyin.</li>
	<li>Tablo 2'de listelenen balgam hücresi hacmi miktarlarını test tüplerine ekleyin.</li>
	<li>Tablo 3'te listelendiği gibi kompanzasyon tüplerine kompanzasyon boncukları ekleyin.</li>
	<li>Işıktan korunan tüm tüpleri (tahlil ve kompanzasyon tüpleri) 35 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Ardından, tüpleri 4 °C'de 800 x g'da 10 dakika boyunca buz gibi HBSS ve santrifüj ile doldurun.</li>
	<li>Kompanzasyon tüpleri için, süpernatantı peletlere mümkün olduğunca yakın aspire edin ve gevşetmek için peletleri hafifçe vurun.</li>
	<li>Kompanzasyon tüplerine 0,5 mL soğuk HBSS ekleyin, 4 °C'de buzda saklayın ve akış sitometri analizi için gerekli olana kadar ışıktan koruyun.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra (antikor boyama bölümünden 3.6. adım) sonra, yersiz izotip, kan ve epitel tüplerden süpernatantı aspire edin ve tüpleri sallayarak peletleri gevşetin.</li>
</ol>4. %1 Paraformaldehit (PFA) ile fiksasyon
<ol><li>Lekesiz, izotip, kan ve epitel tüplere soğuk% 1 PFA (şimdiye kadar çözülmesi gereken) ekleyin; Lekesiz ve izotip tüplere 2 mL, kan ve epitel tüplerine 10 mL.</li>
	<li>Tüpleri 1 saat boyunca ışıktan korunan buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Vortex 30 dakika sonra maksimum hızda hızlı bir şekilde.</li>
	<li>Tüpleri buz gibi HBSS ile doldurun. Daha sonra, 4 °C'de santrifüj tüpleri 1600 x g'da 10 dakika boyunca.</li>
	<li>Hücre peletini bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatant emiş ve hücreleri gevşetmek için tüpü parmaklarla hareket ettirin.</li>
	<li>Lekesiz ve izotip tüplere 200 μL soğuk HBSS ekleyin.</li>
	<li>Kanın ve epitel tüpünün yeniden canlandırılması için HBSS hacmini toplam hücre sayısına göre hesaplayın. NOT: Resüsyon hacmi = 0,15 x [toplam hücre sayısı (balgam ayrışması adım 8) / 106]. Ekstra büyük bir örnek için hücre sayısı olarak 50 x 106 kullanın.</li>
	<li>Akış sitometrisi analizi yapılana kadar buz üzerinde ışıktan korunan tüm numune ve kompanzasyon tüplerini 4 °C'de saklayın. NOT: Bu iletişim kuralı 24 saatten fazla depolama için sınanmamıştır.</li>
</ol>5. Akış sitometresinde veri toplama
<ol><li>Kullanılan akış sitometresi için uygun başlangıç yordamlarını uygulayın. NOT: Protokolün bu bölümünde, akış sitometresini işleten kişinin, özellikle optik ve akışkan sistemlerin stabilitesini kontrol etmek, ışık saçılımı ve floresan yoğunluğunu standartlaştırma teknikleri ve doğru kompanzasyon matrisini hesaplamak ve uygulamak da dahil olmak üzere günlük prosedürler ile ilgili olarak mevcut cihazın kullanımı konusunda eğitilmeleri varsaymaktadır.</li>
	<li>İleri saçılma ve yan dağılım voltajlarının, boncukları eksenlere çok yakın yerleştirmeden tüm arsayı kapsayacak şekilde yerleştirecek şekilde ayarlandığından emin olmak için Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü (NIST) boncuklarının karışımını kullanın. NOT: Bu adım, 5 μm'den küçük kalıntıların alım sonrası analizler ile ortadan kaldırılabilmesini sağlamak için çok önemlidir. Kullanılan akış sitometresine bağlı olarak, en küçük boncukların eşikle (LSR II veya Lirik kullanılırken) veya yüksek ayırıcıyla (Navios EX akış sitometresini kullanarak) dışlanmadığını unutmayın. Navios EX için, ileri ve yan dağılım için 2, ileri saçılma için 236 ve yan dağılım için 250 voltaj için 2 kazanç kullanılmıştır. LSR II için 165 ileri saçılma gerilimi ve 190 yan dağılım gerilimi kullanılmıştır.</li>
	<li>Akış hızını orta (LSR II) veya yüksek (Navios EX) olarak ayarlayın. NOT: Balgam tüplerini elde etmek için çoğu enstrüman için orta veya yüksek akış hızı kullanılabilir. Bir akış hızının çok yavaş kullanılması veya numunenin çok seyreltilmiş olmasının hücrelerin yerleşmesine neden olabileceğini ve bunun da istenmeyen vortekslerin artmasına neden olabileceğini belirtmek önemlidir. Bu nedenle, 4.6 adımında hesaplanan resüspensyon hacmine bağlı kalmak, hızlı bir şekilde elde edilebilen ancak makineyi tıkamayan hücresel yoğunluğa neden olmalıdır.</li>
	<li>Hücre popülasyonlarını ölçeğe yerleştirmek için dağılım ve floresan parametreleri için kullanılan her parametre için voltajları ayarlayın. Gerilimlerin buna göre nasıl ayarlanacağına rehberlik etmek için gating stratejisine sahip rakamları kullanın. NOT: Alma işleminden önce parametre seçim penceresinde gereken tüm parametrelerin seçildiğinden veya verilerin alınmayacağından emin olun.</li>
	<li>Önce lekesiz balgam örneği, ardından izotip lekeli örnek, sonra da kan tüpü ve epitel tüpü için veri alın. NOT: Hücre süspansiyonu, akış sitometresinin numuneleri tıkanmadan çalıştırmasına izin vermeyecek kadar konsantreyse, numuneler HBSS ile daha da seyreltilebilir.</li>
</ol>

Tüm yazarlar bioAffinity Technologies'in geçmiş veya mevcut çalışanlarıdır.

Balganın hücresel içeriği, genellikle çok fazla enkazla birlikte çok çeşitli hücreler içerir37. Ek olarak, balgam analizi, numunenin ağız boşluğu yerine akciğerden toplandığını doğrulayan bir kalite kontrolü gerektirir38. Bu nedenle, balgamumu akış sitometrisi ile analiz etmek, örneğin çok daha temiz ve homojen bir hücre süspansiyonu serbest bırakan kan için olduğu kadar basit değildir. Bu protokol tüm bu sorunları ele almıştır: hem en küçük hem de en büyük hücre popülasyon...

Akış sitometrelerinin donanım ve yazılımındaki teknik gelişmeler, birçok farklı hücre popülasyonunun aynı anda tanımlanmasını mümkün kıldı1,2,3,4. Örneğin, hematopoetik hücre araştırmalarında akış sitometresinin kullanılması, bağışıklık sisteminin çok daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır2 ve hematopoetik sistemin hücresel hiyerarşisi5, ayrıca çok sayıda farklı kan kanserinin tanısal ayrımı6,7,8. Balgam hücrelerinin çoğu hematopoetik kökenli olmasına rağmen9,10,11, akış sitometrisi tanı amaçlı balgam analizine yaygın olarak uygulanmamıştır. Bununla birlikte, çeşitli çalışmalar balgamdaki bağışıklık hücresi popülasyonlarının değerlendirilmesinin (hücrelerin en önemli alt kümesi) astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) gibi hastalıkların teşhis ve / veya izlenmesinde büyük yardımcı olabileceğini göstermektedir 12,13,14,15. Ayrıca, akış sitometrisinde kullanılabilecek epitel spesifik belirteçlerin varlığı, balgam, akciğer epitel hücrelerindeki aşağıdaki en önemli hücre alt kümesinin sorgulanmasını sağlar.
Farklı doku kökenli birçok farklı hücre popülasyonunun analiz yeteneğine ek olarak, bir akış sitometresi çok sayıda hücreyi nispeten kısa bir sürede değerlendirebilir. Buna karşılık, slayt tabanlı, sitolojik analiz türleri genellikle son derece uzmanlaşmış personel ve / veya ekipman gerektirir. Bu analizler emek yoğun olabilir, bu da balgam örneğinin sadece bir kısmının analiz edilmesine neden olur16.
Üç kritik konu, akış sitometrisinde balgam kullanımının yaygın kullanımını sınırlar. İlk sayı balgam koleksiyonu ile ilgilidir. Balgam, mukusu akciğerlerden ağız boşluğuna dışarı atarak daha sonra bir toplama kabına tüküren bir huff öksürüğü ile toplanır. Mukus ağız boşluğundan geçtiği için SEC kontaminasyonu olasılığı yüksektir. Bu kontaminasyon numune analizini zorlaştırır, ancak sorun bu çalışmada gösterildiği gibi bir akış sitometrik platformunda kolayca düzeltilir.
Herkes kendiliğinden balgam üretemez; bu nedenle, balgam koleksiyonuna invaziv olmayan bir şekilde yardımcı olmak için çeşitli cihazlar geliştirilmiştir17. Nebülizör böyle bir cihazdır ve güvenilir balgam örnekleri ürettiği gösterilmiştir18,19,20. Nebülizör, balgamını invaziv olmayan bir şekilde toplamanın çok etkili bir yolu olmasına rağmen, kullanımı hala uzman personele sahip bir tıbbi tesiste bir ayar gerektirir21. Buna karşılık, akciğer flütü22,23,24 ve acapella16,25 gibi el cihazları çok kullanıcı dostu oldukları için evde kullanılabilir. Bu yardımcı cihazlar hem güvenli hem de uygun maliyetlidir.
Bizim için, acapella akciğer flütü16'dan sürekli olarak daha iyi sonuçlar verdi ve bu nedenle, acapella cihazı balgam koleksiyonları için seçildi. Balgam kullanmanın birincil amacı akciğer kanseri tespit testi geliştirmek olduğu için 3 günlük toplama örneğine karar verildi16. 3 günlük bir örneğin akciğer kanseri tespit olasılığını 1 veya 2 günlük bir örneğe kıyasla artırdığı gösterilmiştir26,27,28. Bununla birlikte, balgam toplamanın diğer yöntemleri farklı amaçlar için tercih edilebilir. Burada açıklanandan farklı bir balgam toplama yöntemi kullanılıyorsa, akış sitometrik analizi için kullanılan her antikor veya boyanın dikkatlice titratlanmasınız önerilir; farklı balgam toplama yöntemlerinin akış sitometrisi için hedeflenen proteinleri nasıl etkilediği hakkında çok az veri mevcuttur.
Öncelikle akış sitometrisi ile ilgili tanılama için balgam kullanma hevesini sönümleyen ikinci konu hücre numarasıdır. Sorun, güvenilir bir analiz için yeterli uygulanabilir hücrelerin toplanmasıdır. İki çalışma, invaziv olmayan yöntemlerle toplanan balgam örneklerinin, bir yardımcı cihaz yardımıyla, klinik tanı veya araştırma çalışmalarında kullanılabilecek yeterli uygulanabilir hücre içerdiğini göstermiştir16,24. Bununla birlikte, bu çalışmaların hiçbiri akış sitometrisi ile ilgili hücre sayıları sorununu ele almamıştır.
Bu protokolün temelini oluşturan çalışmalar için, her çalışma alanı için onaylanmış kurumsal kılavuzları izleyerek akciğer kanserine yakalanma riski yüksek katılımcılardan balgam örnekleri toplanarak alındı. Yüksek riskli katılımcılar 55-75 yaşları arasında, 30 paket yıl sigara içmiş ve son 15 yıl içinde sigarayı bırakmamış olarak tanımlanmıştır. Hastalara acapella cihazının üreticinin talimatlarına göre nasıl kullanılacağı gösterildi29 ve evde art arda üç gün boyunca balgam toplandı. Numune son koleksiyona kadar buzdolabında muhafaza edildi. Son toplama gününde, numune donmuş bir soğuk paketle bir gecede laboratuvara gönderildi. Numuneler alındıkları gün tek bir hücre süspansiyonuna işlendi. Bu balgam toplama yöntemi ile güvenilir bir akış sitometrik analizi için fazlasıyla uygulanabilir hücre elde edilir.
Son olarak ve önceki hücre sayısı sorunu ile ilgili olarak, balgam hücrelerinin mucinous ortamından nasıl serbest bırakılacağı sorusudur. Hücreler nasıl canlı tutulabilir ve akış sitometresini tıkamayan tek bir hücre süspansiyonu oluşturabilir? Pizzichini ve ark.30 ve Miller ve ark.31'in ilk çalışmalarına dayanarak, bu protokol balgam işleme için akış sitometrik analizi için uygun olan tek bir hücre süspansiyonuna kolay ve güvenilir bir yöntem açıklar. Bu yöntem, balgamdaki hematopoetik ve epitel hücrelerini tanımlamak ve bir akış sitometrik platformunda balgam analizini standartlaştıran cihaz ayarları, kalite kontrol önlemleri ve analiz kılavuzları sağlamak için verimli bir antikor etiketleme stratejisi geliştirmek için akış sitometrisinde iyi belirlenmiş kılavuzlar kullanmıştır.

<table><tbody><tr><td>% 1 Paraformaldehit Akış Düzeltme</td><td>Polibilimleri</td><td>25037</td><td></td></tr><tr><td>100 & mikro; M naylon hücre süzgeçleri, Falcon # 352360</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0593-1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik şahin tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti-insan CD19</td><td>BioLegend</td><td>302219</td> Alexa488 anti-insan CD3 BioLegend 300415 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti-insan sitokeratini</td><td>BioLegend</td><td>628608</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 PanCK, CD3 ve CD19 İzotipi</td><td>BioLegend</td><td>400129</td><td></td></tr><tr><td>BV510 anti-insan CD45</td><td>BioLegend</td><td>304036</td><td></td></tr><tr><td>CD66b FITC izotipi</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>CompBead Plus Kompanzasyon Boncukları</td><td>BD Biosciences</td><td>560497</td><td></td></tr><tr><td>Corning Polistiren tek kullanımlık steril şişe 250 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-4</td><td></td></tr><tr><td>Corning Polistiren tek kullanımlık steril şişe 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-10</td><td></td></tr><tr><td>CS& T boncuk</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-insan CD66b</td><td>GeneTex</td><td>GTX75907</td><td></td></tr><tr><td>Sabitlenebilir Canlılık Lekesi</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69183</td><td></td></tr><tr><td>FlowSet</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69184</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NIST Boncuklar, 05 & mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64080</td><td></td></tr><tr><td>NIST Boncuklar, 20 &mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64160</td><td></td></tr><tr><td>NIST Boncuklar, 30 & mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64170</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-insan CD45</td><td>BioLegend</td><td>304039</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 anti-insan EpCAM BD</td><td>Biosciences</td><td>565399</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 CD206 / EpCAM İzotip</td><td>BD Biosciences</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>PE-CR594 anti-insan CD206</td><td>BD Biosciences</td><td>564063</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat dihidrat</td><td>EMD</td><td>SX0445-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi çözeltisi, %0,4</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

akış sitometrisi ile kalite kontrollü balgam analizi

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Akciğerin sağlığını anlamak için hücresel içeriği ve diğer mikroçevronmental özellikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan balgam, geleneksel olarak sitoloji tabanlı metodolojiler kullanılarak analiz edilir. Slaytları okumak zaman alıcı olduğundan ve son derece uzmanlaşmış personel gerektirdiğinden, yardımcı programı sınırlıdır. Ayrıca, geniş döküntüler ve çok fazla skuamöz epitel hücresinin (SEC) veya yanak hücrelerinin varlığı, genellikle bir örneği tanı için yetersiz hale getirir. Buna karşılık, akış sitometrisi, hücresel popülasyonların yüksek verimli fenotiplemesine izin verirken aynı zamanda döküntüleri ve DC'leri hariç tutmaktadır.
Burada sunulan protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna, antikor lekesine ve hücresel popülasyonları düzeltmeye ve akış sitometrik platformunda örnekler almaya yönelik etkili bir yöntemi açıklar. Enkaz, ölü hücreler (SEC'ler dahil) ve hücre çiftlerinin hariç tutulmasını açıklayan bir gating stratejisi burada sunulmaktadır. Ayrıca, bu çalışma, hematopoetik ve epitel soy alt kümelerini karakterize etmek için bir farklılaşma kümesine (CD)45 pozitif ve negatif popülasyona dayanarak uygulanabilir, tek balgam hücrelerinin nasıl analiz edilip edilecektir. Akciğere özgü makrofajların akciğerden örnek elde edildiğinin ve tükürük olmadığının kanıtı olarak tanımlanmasıyla da bir kalite kontrol önlemi sağlanır. Son olarak, bu yöntemin üç akış sitometresinde analiz edilen aynı hastadan balgam profilleri sağlanarak farklı sitometrik platformlara uygulanabileceği gösterilmiştir; Navios EX, LSR II ve Lirik. Ayrıca, bu protokol ek hücresel ilgi işaretlerini içerecek şekilde değiştirilebilir. Bir akış sitometrik platformunda tüm balgam örneğini analiz etmek için bir yöntem burada sunulmaktadır, bu da balgamını akciğer hastalığının yüksek verimli tanısını geliştirmek için uygun hale getirir.

Bu protokol klinik laboratuvar ayarı göz önünde bulundurularak geliştirilmiştir. Protokolün geliştirilmesi sırasında odak noktası basitlik, verimlilik ve tekrarlanabilirlikti. Balgamının işlenmesinde en çok zaman alan adımın hücreleri saymak olduğu bulunmuştur. Bu nedenle protokol, balgam işleme ve hücre etiketlemesi zaman kaybı olmadan hücre sayımından bağımsız olarak gerçekleştirilebilecek şekilde ayarlanır. Numuneyi engelsiz bir çalışma için uygun şekilde seyreltmek için hala gerekli olan doğru bir hücre sayısı, daha ...

Bu protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna dağıtmak ve standart akış sitometrik platformlarındaki hücresel alt kümelerin daha sonra karakterizasyonu için etkili bir yöntemi açıklar.

Akış Sitometrisi ile Kalite Kontrollü Balgam Analizi

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Bu protokol, balgam işleme ile ilgili geçmişte yüksek verimli klinik tanı amaçları için akış sitometrisi ile kullanımını zorlaştıran yaygın zorlukları çözer. Bu protokol, antikor ve boya boyama hacimlerini belirlemek için balgam ağırlığı kullanılarak zaman kazanmak için tasarlanmıştır. Boyama inkübasyonu sırasında, aşağı akış adımları için hücre sayımı yapılabilir.Akış sitometresinde çalışırken herhangi bir sorunu önlemek için doğru yeniden süspansiyon hacmini belirlemek için doğru bir hücre sayısı elde etmek önemlidir. Bu protokol, akciğer sağlığını araştıran araştırma alanlarına ilişkin içgörü sağlayabilir. Örneğin KOAH, astım, akciğer kanseri gibi hastalıklar veya COVID'in etkileri incelenebilir.Prosedürü gösteren dr. Michael Lai olacak, laboratuvarımdan bir araştırma ve geliştirme bilimcisi. Başlangıç olarak, ayrışma reaktiflerinin hacimlerini belirlemek için balgam örneğini tartın. Numuneyi balgam ağırlığına göre uygun büyüklükteki gemiye aktarın, ardından %0,5 NAC gram başına bir mililitre ve gram başına %0,1 DTT'lik dört mililitre ekleyin.Örnekleri 15 saniye boyunca maksimum hızda vorteksleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca maksimum hızda kayan. NAC ve DTT'yi nötralize etmek için bu numuneyi 4X Hanks dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ile seyreltin. Ve hızlı girdaplamadan sonra, numuneyi oda sıcaklığında beş dakika sallayın.Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için hücre süspansiyonunu 100 mikrometre naylon ağ hücresi süzgecinden bir veya daha fazla 50 mililitre konik santrifüj tüpüne filtreleyin. Pelet hücreleri aşağı. Süpernatant aspirasyondan sonra, peletleri bir 15 mililitrelik konik tüpte birleştirin ve aynı koşullar altında HBSS ile yıkayın.Hücre peletini balgam örneğinin ilk ağırlığına göre belirlenen bir arabellek hacminde yeniden kullanın. Hücre süspansiyonundan bir aliquot alın ve balgam seyreltmenin 10 mikrolitresini% 0.4 trippan mavisi 30 mikrolitre ile karıştırın, ardından canlı / ölü hücre sayısı için bir hemositometrenin sayım odalarına yükleyin. Kompanzasyon tüplerinde balgam etiketle.Metinde belirtildiği gibi her balgam hücresi tüpüne ve kompanzasyon tüplerine HBSS antikoru ve boyası ekleyin. Balgam hücrelerini tahlil tüplerine ekleyin ve metinde belirtildiği gibi kompanzasyon tüplerine kompanzasyon boncukları ekleyin. Işıktan korunan buz üzerindeki tüm tüpleri 35 dakika boyunca kuluçkaya bırakın.Daha sonra tüpleri buz gibi HBSS ile doldurduktan sonra, 800 kez G.For compensation tüplerinde 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin, süpernatantı peletlere mümkün olduğunca yakın emiş ve gevşetmek için peletleri hafifçe vurun. Daha sonra, kompanzasyon tüplerine 0,5 mililitre soğuk HBSS ekleyin ve tüpleri akış sitometri analizi için gerekli olana kadar hafif korumalı bir alanda buz üzerinde saklayın. Daha sonra balgamsız, izotip, kan ve epitel tüplerinden süpernatantı aspire edin.Tüpleri sallayarak peletleri gevşetin. Lekesiz ve izotip tüplere iki mililitre%1 PFA ve kan ve epitel tüplerine 10 mililitre ekleyin. Tüpleri 30 dakika boyunca hafif korumalı bir şekilde buz üzerinde kuluçkaya yatırın, ardından maksimum hızda hızlı bir şekilde girdap yapın ve tekrar 30 dakika daha kuluçkaya yatın.Daha sonra tüpleri buz gibi HBSS ile doldurun. Daha sonra, tüpleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1,600 kez Santrifüjleyin G.Hücre peletini bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatant aspire edin ve hücreleri gevşetmek için tüpü parmaklarla hareket ettirin, ardından lekesiz ve izotip tüplere 200 mikrolitre soğuk HBSS ekleyin. Toplam hücre sayısına göre kan ve epitel tüpünün yeniden canlandırılması için gerekli HBSS hacmini hesaplayın ve ekleyin.Akış sitometri analizi yapılana kadar tüm numuneleri dört santigrat derecede buz üzerindeki ışıktan korunan kompanzasyon tüplerinde saklayın. Kullanılan akış sitometresi için uygun başlangıç yordamlarını uygulayın. İleri saçılma ve yan dağılım voltajlarının, boncukları eksenlere çok yakın yerleştirmeden arsayı kaplamak için nist boncuklarını yerleştirmek üzere ayarlandığını sağlamak için Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü veya NIST boncuklarının karışımını kullanın.Akış hızını LSRII için orta veya Navios EX için yüksek olarak ayarlayın. Hücre popülasyonlarını ölçeğe yerleştirmek için dağılım ve floresan parametreleri için kullanılan her parametre için voltajları ayarlayın. Gerilimleri buna göre ayarlamak için kılavuz olarak gating stratejisine sahip figürleri kullanın. Önce lekesiz balgam örneği, ardından izotip lekeli örnek ve ardından kan tüpü ve epitel tüpü için veri alın.Lekeleme için antikor veya boya hacimlerini belirlemek için balgam ağırlığı kullanıldı. Balgam ağırlığı ve hücre verimi arasındaki korelasyon güçlü değildi. Balgam örnekleri, hücre veriminin dağılımında kümelenen dört ağırlık kategorisine ayrılmıştır.Kullanılan her antikor plato fazında bir konsantrasyonda titratlandı ve en yüksek boyama indeksi çalışma konsantrasyonu olarak seçildi. Tüm ağırlık kategorilerinde, ortalama SEC kontaminasyonu, gösterilen canlı hücrelerin yüzdesi ile% 20'den azdı. Sunulan analiz için kullanılan gating stratejisidir.Nist boncukları, enkazı ortadan kaldırmak için balgam örneğine uygulanan bir kapı kurmak için kullanıldı. Küçük enkaz genişlik kapısı tarafından daha da ortadan kaldırıldı. Canlılık boyası ölü hücreleri ortadan kaldırmak için kullanılırken, singlet kapısı çiftleri çıkardı.Anti-CD45 antikor etiketlemesi, canlı tek balgam hücrelerinin bir kan hücresine ve kan dışı bir hücre bölmesine ayrılmasına izin veriyordu. Navios EX, LSRII ve Lirik'ten elde edilen profiller karşılaştırıldı. Enkazı, ölü hücreleri, çiftleri ortadan kaldırmak ve kan ve kan dışı profilleri karşılaştırmak için gating stratejisi gösterilmiştir.Bu teknik, invaziv olmayan bir klinik test olarak kullanılmak üzere akciğer kanseri riskini tespit etmek için bu yöntemleri uygulamamızı sağladı.

quality-controlled-sputum-analysis-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, bronkoalveoler lavaj sıvısındaki çeşitli bağışıklık hücrelerini tanımlamak ve saymak için akış sitometrisinin kullanımını göstermektedir. Başlangıçta, tek bağışıklık hücreleri bir canlılık boyası kullanılarak tanımlanır, ardından yüzey işaretleyici proteinlerin diferansiyel boyanması ile her hücre tipinin kesin sayımı sağlanır.

Bronkoalveoler Lavaj Sıvısındaki İmmün Hücrelerin Flow Sitometri ile Tanımlanması ve Sayımı

Endoserviksten lenfositleri ve monositleri toplamak için sitobrush örneklemesinin kullanılması, kadın genital sistem bağışıklığının analizi için örnekler sağlayan minimal invaziv bir tekniktir. Bu protokolde, akım sitometri testleri için sitobrush örneklerinin toplanmasını ve immün hücre izolasyonunu tarif ediyoruz.

Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Bu yöntem, bakterilerin fagositozunu ve oksidatif patlamayı aynı anda ölçerek granülosit fonksiyonunu değerlendirmek için bir teknik gösterir. Görüntü tabanlı akış sitometrisi, hepsi göreceli fonksiyonel kapasitelerinde farklılık gösteren üç farklı aktive granülosit alt kümesinin tanımlanmasına izin verdi.

Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin İn Vitro

Burada, flow sitometri alerjen yüklü parçacıklar ölçmek için bir protokol mevcut. Ortam partiküler madde parçacıkları adsorbe alerjenlerin taşıyıcıları olarak hareket edebilir. Bu akış sitometrisi, bir yöntem olup çok çapı 0.5 um, bu alerjene yüklü parçacıkları ölçmek için kullanılabilir&gt; askıda katı madde karakterize etmek için kullanılan burada gösterir.

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Akciğerin sağlık durumu, akciğer bronşiollerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin türüne ve sayısına göre yansıtılır. Farelerin alt solunum yollarından yapışkan olmayan hücrelerin ve çözünür faktörlerin izolasyonunu ve çalışılmasını sağlayan bir bronkoalveolar lavaj tekniğini açıklıyoruz.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bu makalede, sitometrisi spektral, fluorochromes ayırt emisyon spektrumları şekilleri kullanan akış sitometrisi yeni bir yaklaşım tarif edilmektedir. Bir algoritma, tazminat değiştirir ve bağımsız bir parametre olarak otomatik floresan tedavi edebilir. Bu yeni yaklaşım, katı organ izole edilmiş hücre uygun analizi sağlar.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Burada biz balgam indüksiyon tekniğini tanımlamak. Bu iletişim kuralı bir fark hücre sayısı gerçekleştirmek ve balgam süpernatant toplamak için işleme balgam ve hücreleri daha fazla çözümleme için da açıklanmaktadır.

Metodoloji balgam indüksiyon ve laboratuvar için

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Burada açıklanan protokoller, nötrofil proteazların insan balgamındaki aktivitesini görselleştirmek ve ölçmek için bir kılavuz sağlar. Bu tür analizlerin uygulamaları anti-enflamatuar tedavilerin değerlendirilmesinden biyobelirteç doğrulamasına, ilaç taramasına ve büyük kohort klinik çalışmalarına kadar yayılmaktadır.

İnsan Balgam Örneklerinde Nötrofil Elastase ve Katepsin G Aktivitesinin İzlenmesi

Son yıllarda, canlı hücre bazlı deneyler, yüzey ve şekilsel antijenlere karşı antikorlar tespit etmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada, hastaların büyük kuşaklarının analiz sağlayarak sitometri yüksek verimli akışını kullanarak bir yöntem açıklanmaktadır. Yeni antikorların tespiti immün aracılı bozuklukların tanı ve tedavi artıracaktır.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Öğrenin, akış sitometrisi ile balgam analizi yöntemini kullanarak akciğer sağlığı araştırmalarında hücre alt kümelerini karakterize etme tekniğini. Bu protokol, yüksek verimli klinik tanı için hücre sayımı doğruluğunu artırır.

Akış Sitometrisi ile Kalite Kontrollü Balgam Analizi

Daha fazla video keşfet