Name: Tüm Fare Kalbinin Mezoskopik Optik Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Keşfedin, fare kalbinin mezoskopik optik görüntülenmesi yöntemiyle üç boyutlu doku organizasyonunu koruyarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerini. Bu protokol kalp hastalıkları araştırmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından 952166 No'lu hibe anlaşması (REPAIR), FISR programı kapsamında MUR, proje FISR2019_00320 ve Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE projesi kapsamında fon almıştır.

Tüm hayvan elleçleme ve prosedürleri, bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/EU sayılı Direktifindeki kılavuzlara uygun olarak ve İtalya Sağlık Bakanlığı'nın ilke ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokol İtalya Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 647/2015-PR). Tüm hayvanlar ENVIGO, İtalya tarafından sağlandı. Bu deneyler için 6 aylık 5 erkek C57BL/6J fare kullanıldı.
1. Çözelti hazırlama
<ol><li>Kimyasal bir başlıkta Fosfat Tamponlu Tuzlu (PBS) (pH 7.6) içinde% 4 Paraformaldehit (PFA) hazırlayın. % 4 PFA alikotlarını birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Hidrojel çözeltisi hazırlayın:% 4 Akrilamid,% 0.05 Bis-akrilamid,% 0.25 Initiatior AV-044'ü kimyasal bir başlıkta 0.01 M PBS'de karıştırın. Tüm hazırlık boyunca reaktifleri ve çözeltiyi buz üzerinde tutun. Hidrojel alikotları birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Temizleme çözeltisi hazırlayın: Deiyonize suda 200 mM Borik asit,% 4 Sodyum Dodesil-Sülfat (SDS) karıştırın; kimyasal bir başlıkta pH 8.6. SDS yağışını önlemek için çözeltiyi 21-37 °C arasında saklayın.</li>
	<li>Deney gününde taze Tyrode çözeltisi hazırlayın: 10 mM Glikoz, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1.2 mM MgCl2 ve 4.7 mM KCl ekleyin; 1 M NaOH kullanarak pH 7.4'e titre edin.</li>
</ol>2. Kalp izolasyonu
<ol><li>Kalp izolasyon prosedüründen 30 dakika önce deri altından 0.1 mL 500 I.U. Heparin enjekte edin.</li>
	<li>30 mL'lik bir şırınga ve üç adet 6 cm'lik Petri kabını taze Tyrode çözeltisi ile doldurun. Petri çanaklarından birinin sınırında küçük bir yarık (3-4 mm derinlikte) yapın ve stereoskopik bir mikroskop altına yerleştirin.</li>
	<li>Şırıngaya 1 mm çapında bir kanül sabitleyin ve Petri kabının yarığına yerleştirin. Şırıngada hava kabarcığı olmadığından emin olun.</li>
	<li>20 mL'lik bir şırıngayı% 4 PFA ile doldurun ve kimyasal davlumbazda tutun. Kaputun altına boş bir Petri kabı hazırlayın.</li>
	<li>Fareyi %3 İzofluran / oksijen ile 1.0 L / dak akış hızında uyuşturun ve yürürlükteki hayvan refahı kurallarına göre servikal çıkık ile feda edin.</li>
	<li>Kurbandan sonra, kürkü göğsün üzerinden çıkarın ve kalbe tam erişime sahip olmak için göğsü açın.</li>
	<li>Kalbi izole edin, daha önce 50 mL Tirode Çözeltisi ile doldurulmuş Petri kabına batırın. Kalbin açığa çıkması için aort kemerinin hemen yakınında aortu kesmek için cerrahi makas kullanın.</li>
	<li>Kalbi stereoskopik bir mikroskop altında aktarın ve kanülasyonu dikkatlice gerçekleştirin. Doku hasarını önlemek için kanülü aortun çok derinlerine (en fazla 2 mm) sokmayın.</li>
	<li>Kalbi kanüle sabitlemek için küçük bir kelepçe ve bir dikiş (boyut 5/0) kullanın.</li>
	<li>Damarlardan kanı çıkarmak için kalbi 30 mL Tirode çözeltisi ile 10 mL / dak sabit bir basınçla perfüze edin.</li>
	<li>Kanülü şırıngadan ayırın ve kalbi Tyrode çözeltisi ile doldurulmuş Petri kabına yerleştirin. Kanülde hava kabarcıkları olmamasına dikkat edin; aksi takdirde, hava kabarcıklarını düzgün bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Soğuk %4 PFA ile doldurulmuş 20 mL şırıngayı kanüle takın ve kalbi aynı sabit basınçta perfüze edin.</li>
	<li>Kalbi gece boyunca 4 °C'de (O / N) 10 mL% 4 PFA'da inkübe edin. Doku bozulmasını önlemek için, 2.6-2.13 adımlarını mümkün olan en kısa sürede uygulayın.</li>
</ol>3. Kalp temizleme
<ol><li>Ertesi gün, kalbi 15 dakika boyunca 4 ° C'de 3 kez 0.01 M PBS'de yıkayın. NOT: Bu adımdan sonra, kalp birkaç ay boyunca 4 ° C'de PBS +% 0.01 sodyum azid (NaN3) içinde saklanabilir.</li>
	<li>Kalbi 3 gün boyunca 4 ° C'de sallamada (15 rpm) 30 mL Hidrojel çözeltisinde inkübe edin.</li>
	<li>Bir kurutucu, bir vakum pompası ve kurutucuyu hem pompaya hem de azot boru hattına bağlayan bir tüp sistemi kullanarak numuneyi oda sıcaklığında gazdan arındırın.<ol><li>Numuneyi kurutucuya yerleştirin ve kapağı üzerinde tutarak şişeyi açın.</li>
		<li>Kurutucuyu kapatın ve azot boru hattını açarak oksijeni tüpten çıkarın.</li>
		<li>Oksijeni kurutucudan 10 dakika boyunca çıkarmak için vakum pompasını açın.</li>
		<li>Pompayı kapatın ve azot boru hattını açmak için kurutucunun düğmesini kullanın. Basınç atmosferik basınca eşit olduğunda, kurutucuyu dikkatlice açın ve şişeyi hızla kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalbi gazdan arındırılmış Hidrojel çözeltisinde 37 °C'de 3 saat dinlendirin.</li>
	<li>Hidrojel düzgün bir şekilde polimerize edildiğinde ve tamamen jelatinimsi göründüğünde, kalbi dikkatlice çıkarın ve numune tutucuya yerleştirin.</li>
	<li>Numune tutucuyu kalple birlikte temizleme odalarından birine yerleştirin ve temizleme çözeltisinin sızmasını önlemek için düzgün bir şekilde kapatın.</li>
	<li>Temizleme çözeltisinin devridaimini başlatmak için temizleme çözeltisi kabının yerleştirildiği su banyosunu ve peristaltik pompayı açın.</li>
	<li>Arıtma prosedürünü hızlandırmak için kaptaki temizleme solüsyonunu haftada bir kez değiştirin.</li>
</ol>4. Hücresel membran boyama
<ol><li>Kalp tamamen berraklaştıktan sonra, numune tutucudan çıkarın ve 24 saat boyunca 50 mL ısıtılmış PBS'de yıkayın. 24 saat boyunca 50 mL PBS + Triton-X'in% 1'inde (PBS-T 1x) tekrar yıkayın.</li>
	<li>Numuneyi 0.01 mg / mL Buğday Gergini Agglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633'ü 3 mL PBS-T 1x'te 7 gün boyunca oda sıcaklığında sallayarak (50 rpm) inkübe edin.</li>
	<li>7 günlük inkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 50 mL PBS-T 1x'te 24 saat çalkalayarak yıkayın.</li>
	<li>Numuneyi 15 dakika boyunca% 4 PFA'da inkübe edin ve ardından PBS'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. NOT: Bu adımdan sonra, kalp birkaç ay boyunca 4 ° C'de PBS +% 0.01 NaN3'te saklanabilir.</li>
	<li>Kalbi, her biri 8 saat boyunca 0.01 M PBS'de (% 20 ve% 47 TDE / PBS) artan konsantrasyonlarda 2,2′-Tiyodiethanol (TDE), gerekli kırılma indisini sağlamak için 0.01 M PBS'de% 68 TDE'nin son konsantrasyonuna kadar inkübe edin (RI = 1.46). Bu, görüntüleri elde etmek için kullanılan RI eşleştirme ortamıdır (RI-medium) 16.</li>
</ol>5. Kalbe montaj ve satın alma
NOT: Optik sistemin tüm bileşenleri Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak listelenmiştir.
<ol><li>Dış küvetin yaklaşık% 80'ini (kuvars, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) RI-medium ile yavaşça doldurun. NOT: Burada, 1,46 RI'yı garanti eden farklı uçucu olmayan çözümler kullanmak mümkündür.</li>
	<li>İç küveti (kuvars, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) aynı RI-medium ile yavaşça doldurun.</li>
	<li>Numuneyi iç küvetin içine batırın. Yukarıda açıklanan numune inkübasyonları, numunenin tutulmadan RI-ortamı içinde sabit kalmasını sağlar.</li>
	<li>İnce cımbız kullanarak numuneyi yavaşça küvetin dibine doğru hareket ettirin ve tarama sırasında doku boyunca uyarma ışığı yolunu en aza indirmek için kalbi uzunlamasına ekseni küvetin ana eksenine paralel olarak düzenleyin.</li>
	<li>Özel fişi iç küvetin üzerine iki vidayla yavaşça sabitleyin.</li>
	<li>Mıknatısları kullanarak numuneyi mikroskop aşamasına monte edin.</li>
	<li>İç küvetin dış küvete batırılması için dikey numune aşamasını manuel olarak çevirin.</li>
	<li>Uyarma ışık kaynağını (638 nm dalga boyu) açın ve düşük bir güç (3 mW sırasına göre) ayarlayın.</li>
	<li>Dokunun iç düzlemini aydınlatmak için motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi hareket ettirin.</li>
	<li>Görüntüleme yazılımını (HCImageLive) açın ve tüm kurulumu kontrol eden özel yazılım tarafından kameranın alma tetikleyicisini çalıştırmak için fotoğraf makinesinin Harici (ışık tabakası) modunda Tetikleyicisini ayarlayın.</li>
	<li>Tarama Ayarları panelinde Otomatik Kaydet'i etkinleştirin ve görüntülerin kaydedilmesi gereken çıktı klasörünü ayarlayın.</li>
	<li>Numuneyi kamera sensörünün FoV'sinin merkezine taşımak için doğrusal çevirmenlerle XY düzlemindeki numune konumunu manuel olarak ayarlayın.</li>
	<li>Tomografik rekonstrüksiyon için kalp sınırlarını tanımlamak üzere doğrusal motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi Z ekseni boyunca hareket ettirin.</li>
	<li>Lazer gücünü, görüntüleme oturumu için hazır olacak şekilde ~20 mW'a yükseltin.</li>
	<li>Tomografik alımı başlatın, görüntüleme yazılımının Sıra Panelindeki Başlat düğmesine tıklayın ve aynı zamanda motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi Z ekseni boyunca 6 μm/s sabit hızda hareket ettirin.</li>
</ol>

<ol><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications%3A+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li>
<li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+genetic+basis%2C+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22EP+Europace%22%5BJournal%5D)">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li>
<li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li>
<li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transaction+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73(2019).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769(2018).</li>
<li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li>
<li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li>
<li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li>
<li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808(2015).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012(2016).</li>
<li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvessel+prediction+in+H%26E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64(2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982(2020).</li>
</ol>

İfşa edilecek bir şey yok.

Bu çalışmada, bütün bir fare kalbini yüksek çözünürlükte temizlemek, lekelemek ve görüntülemek için başarılı bir yaklaşım tanıtıldı. İlk olarak, bir doku dönüşüm protokolü (CLARITY) optimize edildi ve uygulandı, kalp dokusuna uygulanması için biraz modifiye edildi. Gerçekten de, bütün bir kalbin 3B'sinde etkili bir rekonstrüksiyon elde etmek için, ışık saçılması fenomenini önlemek esastır. CLARITY metodolojisi, oldukça şeffaf ve sağlam bir kalp elde etmemizi sağlar, ancak pasif olarak gerçekleştirildiğinde (yaklaşık 5 ay...

Kalp hastalıkları ile ilişkili yapısal yeniden yapılanma elektrik iletimini etkileyebilir ve organın elektromekanik işlev bozukluklarına neden olabilir 1,2. Fonksiyonel değişiklikleri tahmin etmek için kullanılan güncel yaklaşımlar, fibroz birikiminin, vasküler ağacın ve kalbin lif dağılımının genel bir rekonstrüksiyonunu elde etmek için MRG ve DT-MRG'yi yaygın olarak kullanır ve organ boyunca tercihli eylem potansiyeli yayılım (APP) yollarını modellemek için kullanılır 3,4. Bu stratejiler kalp organizasyonuna güzel bir genel bakış sağlayabilir. Bununla birlikte, uzamsal çözünürlükleri, yapısal yeniden yapılanmanın hücresel düzeyde kardiyak fonksiyon üzerindeki etkisini araştırmak için yetersizdir.
Bu çerçeveyi, tek hücrelerin eylem potansiyeli yayılımı üzerinde bireysel roller oynayabileceği farklı bir büyüklük sırasına yerleştirmek zordur. Temel sınırlama, masif (santimetre boyutlu) dokularda yüksek çözünürlüklü görüntüleme (mikrometrik çözünürlük) gerçekleştirmek için standart görüntüleme yöntemlerinin verimsizliğidir. Aslında, biyolojik dokuları 3D olarak yüksek çözünürlükte görüntülemek, doku opaklığı nedeniyle çok karmaşıktır. Tüm organlarda 3D rekonstrüksiyonları gerçekleştirmek için en yaygın yaklaşım, ince kesitler hazırlamaktır. Bununla birlikte, hassas kesitleme, montaj ve görüntüleme önemli çaba ve zaman gerektirir. Numunenin kesilmesini gerektirmeyen alternatif bir yaklaşım, şeffaf bir doku oluşturmaktır. Son yıllarda, dokuları berraklaştırmak için çeşitli metodolojiler önerilmiştir 5,6,7,8. Masif, şeffaf ve floresan olarak etiketlenmiş dokular üretme zorluğu, son zamanlarda gerçek doku dönüşüm yaklaşımları geliştirilerek elde edilmiştir (CLARITY9, SHIELD10). Özellikle, CLARITY yöntemi, bozulmamış bir dokunun, membran lipit çift katmanlarının seçici olarak çıkarılmasıyla yüksek şeffaflık kazandırmayı sağlayan nanogözenekli, hidrojel-hibridize, lipit içermeyen bir forma dönüştürülmesine dayanır. Özellikle, bu yöntem kardiyak preparatta da başarılı bulunmuştur11,12,13,14. Bununla birlikte, kalp aktif bir temizlik için uygun olamayacak kadar kırılgan olduğundan, tam şeffaflık sağlamak için uzun zaman gerektiren pasif yaklaşım kullanılarak temizlenmelidir.
Işık tabakası mikroskobu gibi gelişmiş görüntüleme teknikleriyle birlikte, CLARITY 3D masif kalp dokularını mikrometrik çözünürlükte görüntüleme potansiyeline sahiptir. Işık tabakası mikroskobunda, numunenin aydınlatılması, algılama hedefinin odak düzleminde sınırlı ince bir ışık tabakası ile gerçekleştirilir. Floresan emisyonu, aydınlatma düzlemi15'e dik bir eksen boyunca toplanır. Algılama mimarisi geniş alan mikroskobuna benzer ve bu da edinimi lazer tarama mikroskoplarından çok daha hızlı hale getirir. Numunenin ışık tabakası boyunca hareket ettirilmesi, santimetre büyüklüğündeki numunelere kadar büyük örneklerin tam bir tomografisinin elde edilmesini sağlar. Bununla birlikte, Gauss ışınının içsel özellikleri nedeniyle, yalnızca sınırlı bir uzamsal uzantı için çok ince (birkaç mikron mertebesinde) bir ışık tabakası elde etmek mümkündür, böylece görüş alanını (FoV) büyük ölçüde sınırlar. Son zamanlarda, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için yeni bir uyarma şeması tanıtıldı ve beyin görüntüleme için uygulandı ve izotropik çözünürlük16 ile 3d rekonstrüksiyonlara izin verdi.
Bu yazıda, CLARITY protokolünün ihtiyaç duyduğu takas zamanlamasının önemli ölçüde azaltılmasını sağlayan pasif bir takas yaklaşımı sunulmuştur. Burada açıklanan metodolojik çerçeve, tüm fare kalbinin mikrometrik çözünürlükle tek bir tomografik taramada dakika sırasına göre bir edinme süresiyle yeniden yapılandırılmasına izin verir.

<table><tbody><tr><td>2-2' Tiyodietanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Bio-Rad</td><td>61-0140</td><td></td></tr><tr><td>AV-044 Başlatıcı</td><td>Wako Kimyasalları</td><td>AVP5874</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Akrilamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-042</td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca flaş 4.0 v3</td><td></td></tr><tr><td>Kamera yazılımı</td><td>Hamamatsu</td><td>HC Görüntü</td><td></td></tr><tr><td>Kolimasyon lensi</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Algılama kolu</td><td>Entegre optikler</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Uyarma lensi</td><td>Nikon</td><td>91863</td><td></td></tr><tr><td>Extera & igrave; nal kuvars küvet</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-753</td><td></td></tr><tr><td>Katlanır aynalar</td><td>Thorlabs</td><td>BBE1-E02</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometrik ayna</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211/M</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Canlı</td><td>Hamamatsu</td><td>4.6.1.19</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Dahili kuvars küvet</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-204</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Lazer kaynağı</td><td>Entegre Optik</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Uzun geçiren filtre</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0650</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik taban</td><td>Thorlabs</td><td>KB25/M</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Chem-Lab</td><td>CI-1316-0250</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu traslatör</td><td>Physisk Instrument</td><td>M-122.2DD</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59888</td><td></td></tr><tr><td>Amaç</td><td>Thorlabs</td><td>TL2X-SAP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polycap AS</td><td>Whatman</td><td>2606T</td><td></td></tr><tr><td>Röle lensi</td><td>Qioptiq</td><td>G063200000</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tüp lens</td><td>Thorlabs</td><td>ACT508-200-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Ayarlanabilir lens</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Vakum pompası</td><td>KNF Neuberger Inc</td><td>N86KT.18</td><td></td></tr><tr><td>Su banyo</td><td>Memmert</td><td>WTB</td><td></td></tr></tbody></table>

tüm fare kalbinin mezoskopik optik görüntülenmesi

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Hem genetik hem de genetik olmayan kalp hastalıkları kalpte ciddi yeniden şekillenme süreçlerine neden olabilir. Kollajen birikimi (fibrozis) ve hücresel yanlış hizalama gibi yapısal yeniden modelleme, elektriksel iletimi etkileyebilir, elektromekanik işlev bozukluklarına neden olabilir ve sonunda aritmilere yol açabilir. Bu fonksiyonel değişikliklerin mevcut öngörücü modelleri, entegre olmayan ve düşük çözünürlüklü yapısal bilgilere dayanmaktadır. Bu çerçeveyi farklı bir büyüklük sırasına yerleştirmek, standart görüntüleme yöntemlerinin masif dokuda yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirmedeki etkisizliği nedeniyle zordur. Bu çalışmada, tüm fare kalplerinin mikrometrik çözünürlükle görüntülenmesini sağlayan metodolojik bir çerçeve tanımladık. Bu hedefe ulaşmak, doku transformasyonu ve görüntüleme yöntemlerindeki gelişmelerin birleştirildiği teknolojik bir çaba gerektirmiştir. İlk olarak, sağlam bir kalbi yüksek şeffaflık ve derin lekelenmeye izin veren nanogözenekli, hidrojel hibridize, lipit içermeyen bir forma dönüştürebilen optimize edilmiş bir CLARITY protokolünü açıklıyoruz. Daha sonra, mikron ölçeğinde çözünürlükte mezoskopik bir görüş alanının (mm ölçeğinde) görüntülerini hızlı bir şekilde elde edebilen bir floresan ışık tabakası mikroskobu açıklanmaktadır. MezoSPIM projesini takiben, tasarlanan mikroskop, tek bir tomografik taramada tüm fare kalbinin mikrometrik çözünürlükle yeniden yapılandırılmasına izin verir. Bu metodolojik çerçevenin, sitomimari kargaşanın elektriksel işlev bozukluklarına katılımının açıklığa kavuşturulmasına izin vereceğine ve hem işlevsel hem de yapısal verileri dikkate alan kapsamlı bir modelin önünü açacağına, böylece doku yeniden şekillenmesinden sonra elektriksel ve mekanik değişikliklere yol açan yapısal nedenlerin birleşik bir şekilde araştırılmasını sağlayacağına inanıyoruz.

Geliştirilen pasif temizleme kurulumu, yaklaşık 3 ay içinde temizlenmiş bir yetişkin fare kalbi (10 mm x 6 mm x 6 mm mertebesinde bir boyutta) elde etmeyi sağlar. Kurulumun tüm bileşenleri Şekil 1'de gösterildiği gibi monte edilmiştir. Her bir temizleme odası arasındaki ihmal edilebilir sıcaklık gradyanı (3 ° C mertebesinde), sıcaklığın tüm odalarda uygun bir aralıkta tutulmasını sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/fi...

Doku transformasyonu ve boyamadaki yeni gelişmeleri eksenel olarak taranmış bir ışık tabakası mikroskobunun geliştirilmesiyle birleştirerek tüm fare kalbinin mezoskopik rekonstrüksiyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Tüm Fare Kalbinin Mezoskopik Optik Görüntülenmesi

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Bu metodoloji, temizleme protokolünün iyileştirilmesini Mesos PIM teknolojisinin optik kesitleme göz kabiliyeti ile birleştirerek mikrometrik çözünürlükte mezo skopik rekonstrüksiyonlar gerçekleştirmemizi sağlar. Orijinal üç boyutlu doku organizasyonunu kaybetmeden masif kalp dokularını veya tüm fare kalplerini tek bir taramada tüm çözeltiyi görüntüleme imkanı sağlar. Kalp, tiro çözeltisinde yıkanmış proksimal aort ile kanüle edildikten ve 0.01 molar PBS'de% 4 Paraform aldehit ile sabitlendikten sonra, temizleme protokolüne başlamaya hazırdır.Kalbi 15 dakika boyunca dört santigrat derecede 0.01 molar PBS'de üç kez yıkayın. Bu adımdan sonra, kalp birkaç ay boyunca PBS ve% 0.01 sodyum azidde dört santigrat derecede saklanabilir. Kalbi 20 mililitre hidrojel çözeltisi içinde, dört santigrat derecede üç gün boyunca 15 RPM'de sallanma durumunda inkübe edin.Bir kurutucu, vakum pompası ve kurutucuyu hem pompa bandına hem de azot boru hattına bağlayan bir tüp sistemi kullanarak numuneyi oda sıcaklığında gazdan arındırın. Numuneyi kurutucuya yerleştirin ve kapağı üzerinde tutarak şişeyi açın. Kurutucuyu kapatın ve azot boru hattını açarak oksijeni tüpten çıkarın.Oksijeni kurutucudan 10 dakika boyunca çıkarmak için vakum pompasını açın. Pompayı kapatın ve kurutucunun düğmesini azot boru hattına açın. Ardından azot musluğunu açın.Basınç atmosferik basınca eşit olduğunda, kurutucuyu dikkatlice açın ve şişeyi hızla kapatın. Kalbi gazdan arındırılmış hidrojel çözeltisinde 37 santigrat derecede istirahatte yaklaşık üç saat boyunca tutun. Hidrojel uygun şekilde polimerize edildiğinde ve tamamen jelatinimsi göründüğünde, kalbi dikkatlice çıkarın ve temizleme çözeltisi ile şişedeki bir temizleme çözeltisine yerleştirin.Arıtma prosedürünü hızlandırmak için şişedeki temizleme solüsyonunu her üç günde bir değiştirin. Kalp tamamen berraklaştıktan sonra, şişeden çıkarın ve sallanma durumunda 24 saat boyunca 50 mililitre ısıtılmış PBS'de yıkayın. Sarsıntı durumunda 24 saat boyunca 50 mililitre bir X PBS T içinde tekrar yıkayın.Numuneyi mililitre başına 0.01 miligram buğday tohumu aglutinin Alexa kat 633'te bir X PBS T'nin üç mililitresinde yedi gün boyunca oda sıcaklığında 50 RPM'de sallanma durumunda inkübe edin. Yedi günlük inkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 50 mililitre X PBS T içinde 24 saat çalkalayarak yıkayın. Numuneyi 15 dakika boyunca% 4 PFA'da inkübe edin ve ardından her biri beş dakika boyunca 0.01 molar PBS'de üç kez yıkayın.Kalbi her biri sekiz saat boyunca 0.01 molar PBS'de 20 ve% 47 TDE'de art arda inkübe edin. Ve son olarak, gerekli kırılma indisi 1.46'yı sağlamak için 0.01 molar PBS'de% 68 TDE'de. Dış kuvars kuvetin yaklaşık% 80'ini kırılma indisi ortamı ile nazikçe doldurun.İç kuvars kuvetini aynı kırılma indisi ortamıyla doldurun. Numuneyi iç quvet içine batırın. İnce cımbız kullanarak numuneyi yavaşça quvet'in dibine doğru hareket ettirin ve tarama sırasında doku boyunca uyarma ışığı yolunu en aza indirmek için kalbi uzunlamasına ekseni quvet'in ana eksenine paralel olarak düzenleyin.Özel fişi iç quvet'in üzerine iki vida ile dikkatlice sabitleyin. Mıknatısları kullanarak numuneyi mikroskop aşamasına monte edin. İç quvet'i harici olana batırmak için dikey numune aşamasını manuel olarak çevirin.638 nanometre dalga boyuna sahip uyarma ışık kaynağını açın ve üç miliwatt mertebesinde düşük güce ayarlayın. Dokunun iç plakasını aydınlatmak için motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi hareket ettirin. HC görüntü canlı kamera yazılımını açın ve tüm kurulumu kontrol eden özel yazılım tarafından kameranın alma tetikleyicisini çalıştırmak için kamera tetikleyicisini harici kenar tetik ışığı sayfası modunda ayarlayın.Kamera yazılımında otomatik kaydetmeyi etkinleştirin ve görüntülerin kaydedilmesi gereken çıktı klasörünü ayarlayın. Numuneyi kamera sensörünün görüş alanının merkezine taşımak için doğrusal çevirmenlerle X Y düzlemindeki numune konumunu manuel olarak ayarlayın. Tomografik rekonstrüksiyon için kalp sınırlarını tanımlamak üzere doğrusal motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi Z ekseni boyunca hareket ettirin.Görüntüleme seansına başlamadan önce lazer gücünü yaklaşık 20 miliwatt'a yükseltin. Görüntüleme yazılımının yakalama panelindeki başlat düğmesine tıklayarak tomografi alımını başlatın ve aynı zamanda motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi saniyede altı mikrometre sabit hızda Z ekseni boyunca hareket ettirmeye başlayın. Netlik metodolojisinin TDE ile kırılma indisi ortamı olarak kombinasyonu, numunenin nihai hacmini önemli ölçüde değiştirmez veya numunenin izotropik deformasyonuna yol açmaz.Uyarma optikleri, görüş alanının kenarında 175 mikrometreye kadar ayrılan yaklaşık altı mikrometrelik minimum atık içeren bir ışık tabakası üretti. Kamera yuvarlanan deklanşörün ışık tabakası atıklarının eksenel taraması ile senkronizasyonu, emisyon sinyalinin yalnızca ışık tabakasının israfıyla uyarılan numune kısmında toplanmasını sağladı ve tüm görüş alanı boyunca yaklaşık 6.7 mikrometrelik ortalama F W H M ile sonuçlandı. Mikroskobun Z noktası yayılma fonksiyonu da floresan nanosferin tomografik bir rekonstrüksiyonu ile tahmin edildi ve 6.4 mikrometrelik bir F W H M fit tarafından tahmin edildi.Sistemin tek hücre zarlarını üç boyutta, tüm organda yeterli sinyal-gürültü oranıyla çözme potansiyeli de doğrulandı. Gazdan arındırma prosedürü, protokolün en kritik adımıdır. Düzgün bir şekilde gerçekleştirilmezse, doku bir temizleme çözeltisinde inkübasyon sırasında belirtilen hasarlarla karşılaşabilir.Sunulan protokol, farklı biyolojik yapıları entegre eden bütün bir organ rekonstrüksiyonunu elde etmek için çoklu boyama protokolü ile birleştirilebilir ve patolojik modelleri incelemek için uygulanabilir.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yüksek frekans Doppler ultrason bölgesel miyokard fonksiyonunu değerlendirmek için yeni bir teknoloji. Bu çalışma, miyokard gerilme, iskemi-Reperfüze (IR) fare kalp dp / dt ve mitral yetersizliği tekrarlanan ölçümler için bu çok yönlü bir görüntüleme platformu uygulanabilirliği gösteren ilk kanıt sunmaktadır.

Yüksek frekanslı Yüksek çözünürlüklü Ekokardiyografi: İskemi-Reperfüze murin Kalp Miyokard Strain, kontraktilite ve Mitral Yetmezliğinde Non-invaziv Tekrarlanan Ölçüm İlk Kanıt

Bu video, bir anestezi fare ekokardiyografi yapmak için bir demiryolu monte edilmiş yüksek frekanslı ultrason probu kullanımını gösterir. Yöntemleri, Renkli Doppler, gerilme analizi, yanı sıra genel ve hedefli kontrast görüntüleme gibi daha yeni, daha güçlü araçlar için ek olarak iki geleneksel iki boyutlu ve M-mod ölçümleri kalp fonksiyonu açıklar.

Murin Ekokardiyografi ve Ultrasonik Görüntüleme

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Bu yazıda yüksek çözünürlüklü, floresan etiketli fare beyinleri ince beyin anatomisi ile, yeniden tam deneysel prosedürü açıklar. Açıklanan protokol numune hazırlama ve temizleme, görüntüleme, veri post-processing ve çok ölçekli görselleştirme için montaj örneği içerir.

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Bu çalışma, otoimmün miyokarditten etkilenen farelerde kardiyak anormallikleri değerlendirmek için invaziv olmayan bir araç olarak manyetik rezonans mikroskopi görüntülemenin başarılı bir şekilde kurulduğunu göstermektedir.  Veriler, tekniğin canlı hayvanlarda hastalığın ilerlemesini izlemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Fare Manyetik Rezonans Görüntüleme Mikroskopi tarafından Deneysel Otoimmün Miyokardit Kardiyak anormallikler noninvaziv değerlendirilmesi

Burada, bir yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte, farenin sağ atrium ve özellikle Çin-atriyal düğümden elektriksel aktivitenin optik haritalama için bir protokol mevcut.

Fare Çin-atriyal düğüm yüksek çözünürlüklü optik Haritalama

Bu çalışmada optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) fare kalp çalışmaya kullanmaktadır.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Murine miyositlerin izolasyonu ve aynı anda gerilim veya kalsiyum izlerinin nasıl elde edilecegini, eşzamanlı dijital hücre geometrisi ölçümleri ile floresan fotometri kullanarak sarcomere kısaltma izleriyle birlikte saglamak için metodolojiyi savuruyoruz.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Burada, septal arter kanüle edildiği ve basınçlandırıldığı için kılcal yataklar ve perisitler de dahil olmak üzere damar ağacı bileşenlerinin yanı sıra basıncı koruyan arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının eks vivo izlenmesi ile canlı murine kalp dokusundaki koroner mikrositülasyonu incelemek için bir protokol sunulmaktadır.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Protokol, kemirgen kalplerindeki karmaşık kardiyak yapıları araştırmak için uyarlanmış doku temizleme yöntemleriyle birlikte gelişmiş ışık tabakası mikroskobunu kullanır ve kardiyak morfogenezin anlaşılması ve yeniden şekillenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Kemirgen kalplerinde kalp yapısını ortaya çıkarmak için ışıklı tabaka görüntüleme

Burada, murin kardiyovasküler sistemindeki biyomekanik ve biyomoleküler değişiklikleri değerlendirmek için in vivo dört boyutlu ultrason görüntüleme ve ex vivo kütle spektrometresi görüntülemeyi kullanmak için bir protokol açıklıyoruz. Bu teknik, yaşlanan hayvanlarda cerrahi olarak indüklenen miyokard enfarktüsünde ve vasküler değişikliklerde kardiyak yeniden şekillenmeyi analiz etmek için uygulanır.

Murin Kardiyovasküler Yeniden Şekillenmesinin Multimodal Çalışması: Dört Boyutlu Ultrason ve Kütle Spektrometresi Görüntüleme

Keşfedin, fare kalbinin mezoskopik optik görüntülenmesi yöntemiyle üç boyutlu doku organizasyonunu koruyarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerini. Bu protokol kalp hastalıkları araştırmaları için değerlidir.

Tüm Fare Kalbinin Mezoskopik Optik Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet