Kardiyak Trabeculae Ex Vivo'nun Eşzamanlı Brightfield, Floresan ve Optik Tutarlılık Tomografik Görüntülemesi

Bu prosedürün genel amacı, mekanik fonksiyonun, iyonik dinamiklerin ve kasılan kalp dokusunun geometrik değişiminin eşzamanlı olarak ölçülmesine olanak sağlayan üç görüntüleme sisteminin tek bir cihaza entegrasyonunu göstermektir. Özellikle, dokunun kuvvet üretimini, kalsiyum geçicilerini, lokal yer değiştirmelerini ve şekil değişimini ölçüyoruz. Bu görüntüleme yöntemlerinin kombinasyonu, etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için büyük etkileri olan kalp hastalığında önemli soruların cevaplamasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, kas aktivitesinin heterojenliğini incelememizi sağlar. Bu protokolde kullanılan cihaz, aynı örneği görüntüleme yeteneğine sahip üç görüntüleme sistemi, bir brightfield mikroskobu, floresan mikroskobu ve optik tutarlılık tomografı içerir. Floresan emisyonu ve parlak alan iletim görüntüsünü ayırmak için bir dizi dikroik ayna kullanılır.

Bu cihazın temel özellikleri, bağımsız olarak çalışan iki montaj kancası, üç optik olarak net eksenli bir ölçüm odası ve brightfield ve OCT kameraları bir uyarıcı ile senkronize eden harici bir tetik hattıdır. Bu videoda, kardiyak trabeculae'nin nasıl izole edilir, hazırlanır ve görüntülanır ve bazı temsili sonuçlar sunulur. Bir kalbi uyuşturulduktan sonra diseksiyon odasına aktarın.

İki kavisli toparlama kullanarak, aortu perfüzyon kanülü üzerine çekin. Aortu bir asa ile yerinde tutun. Bu arada, diseksiyon çözeltisinin perfüzyon kanülden akmasını sağlamak için boru hattını açın.

Koroner vaskülat kandan temizlendikten ve kalp diseksiyon çözeltisi ile tamamen perfüzyona uğradıktan sonra, bir dikiş kullanarak aortu yerine sabitleyin. Kanülleri döndürerek kalbi, sol koroner arterin üst yüzeyde görülebilmesi için konumlandırın. Kalbin tepesini diseksiyon odasının dibine sabitle.

İki aryayı da kes. Septumun sağ tarafı boyunca kalbin tepeye kadar kesin. Açılan sol ventrikülü diseksiyon odasının tabanına sabitle.

Daha sonra, septumun sol tarafı boyunca keserek, sağ ventrikülü açın ve diseksiyon odasının tabanına da sabitleyin. Sağ ventrikülde serbest çalışan bir trabecula tanımlayın. Yay makası ve bir perlep kullanarak trabecula'yı çevreleyen duvar dokusunu kesin.

Daha sonra, duvar dokusunu ikiye bölün, trabecula yönüne ortogonal. Duvar dokusunu, boyutu kullanılan montaj konfigürasyonuna uygun olana kadar kırpın. Ekscislenmiş trabecula'yı diseksiyon odasında bırakın.

Sıcak suyu, damıtılmış suyu yıkayın ve ardından çözeltiyi ölçüm odasından superfusate edin. Parlak alan mikroskobu ışık kaynağını açın ve yakalamayı etkinleştirmek için F1 tuşuna basın. Aşağı akış kancasını brightfield görüntüsünde ortalanana kadar manuel olarak ayarlayın.

Motoru etkinleştirmek için sıfır aşağı akış eksenini tıklatın, sonra aşağı akış devre dışı bırakın. Kancanın sonu varsayılan ilgi alanı bölgesinin kenarıyla hizalanana kadar aşağı akış ayar noktası kaydırıcısını hareket ettinin. Aşağı akış eksenini yeniden sıfırla, sonra aşağı akış ayar noktası kaydırıcısını 1.000'e taşıyın.

İşlemi yukarı akış kancasıyla tekrarlayın, ancak yukarı akış eksenini yeniden sıfırlayıp sıfırlandıktan sonra yukarı akış ayar noktası kaydırıcısını hareket ettirmeyin. Bağlamaya taşı'yı tıklatın. Ana anahtarı değiştirerek denetleyici alt sistemlerini hızlı bir şekilde açmadan önce lamba anahtarını değiştirerek floresan aydınlatma sistemini başlatın.

Ön paneldeki mod düğmesine ve ardından iki, sonra bir düğmesine basarak çalışma modunu turbo boşaltmaya geçirin. Dış denetimi etkinleştirmek için çevrimiçi düğmeye basın. Ölçüm odasından geçen süperfüzyon akışını duraklatın.

Montaj haznesini diseksiyon çözeltisi ile doldurun. Bir mililitrelik bir şırınna kullanarak trabeculayı diseksiyon odasından montaj odasına taşıyın. Trabecula'nın yerçekimi yoluyla montaj odasına inmesine izin verin.

Montaj odasındaki sıvı seviyesini, kancaların orta kısmıyla aynı seviyede olacak şekilde düşürin. Aşağı akış ayar noktası kaydırıcısını hareket ettirerek trabecula'nın bolluk uzunluğunu yansıtmak için kancalar arasındaki mesafeyi ayarlayın. Görselleştirmeye yardımcı olmak için bir mikroskop kullanarak, uç doku parçalarından birini forsepsle hafifçe kavrayın ve yukarı akış kancasına monte edin.

Diğer uç doku parçasını aşağı akış kancasına monte edin. Güvenli bir şekilde monte edildikten sonra, odaya hareket ettirerek trabecula'yı ölçüm odasına geri taşıyın ve süperfüzyon akışına devam edin. Uyaran frekansını bire, uyaran süresini 10'a ve uyaran voltajını 10'a ayarlayın.

Uyarana basarak uyarılmaya başlayın. Brightfield aydınlatma sistemini açın. F1 tuşuna basın ve kullanıcı arabiriminin çizgili bir alanını içeren bir ilgi alanı seçin.

Vurgulanan bölgedeki ortalama sarkom uzunluğunu hesaplamak için işlem sarkomu uzunluğunu tıklatın. Ortalama sarkom uzunluğu yaklaşık 2,32 mikron olana kadar kas uzunluğunu artırın. Merkezdeki merkez setpoint kaydırıcısını ve aşağı akış kancasının kenarının brightfield görüntüsünde görülebilmesi için ayırma kontrol sekmesini ayarlayarak kası hareket ettirin.

10 seğirme için floresan bilgilerini toplayın. Merkez setpoint değerini 200 artırın ve floresan bilgi değerinde 10 seğirme daha toplayın. Brightfield görüntüsü yukarı akış kancasını içerene kadar bu işlemi yineleyin.

Son pencerenin floresan bilgilerini toplayın. Merkez ayar noktası değerini sıfır olarak ayarlayarak trabecula'yı merkezi bir konuma döndürün. Uyaran frekansını 0,2 Hertz'e düşürün ve K-H süperfüzyonundan Fura-2 yükleme çözümüne geçin.

Floresan sinyalini her 10 dakikada bir ölçün. PMT sinyal sekmesinde sinyali görselleştirin. 360 nanometre sinyali 10 kat arttıktan sonra, uyaran frekansını bir Hertz'e döndürün ve K-H süperfüzyon çözeltisine geri dönün.

Sinyal dengelenene kadar her 10 dakikada bir oran ölçümünü kontrol edin, bu noktada veri toplama başlayabilir. Kası, aşağı akış kancasının kenarının brightfield görüntüsünde bulunduğu konuma getirin. Floresan kaynağını etkinleştir'e tıklayarak floresan bilgilerini yakalayın.

Donanım verilerini akışına başlayın. Brightfield görüntüleme kullanıcı arayüzünde, yakalama modunu harici tetikleyiciye ayarlayın, kare hızını 100 Hertz'e çıkarın ve yakalanacak görüntü sayısını 100'e ayarlayın. Bu pencerenin parlak alan görüntüleme verilerini kaydetmek için control-shift-S ve ardından F1 tuşuna basın.

Merkez ayar noktası değerini 200 artırın ve brightfield yakalama işlemini tekrarlayın. Görüntüleme verileri son pencere için toplanana kadar tarama protokolüne devam edin. Merkez ayar noktası değerini sıfır olarak ayarlayarak trabecula'yı merkezi bir konuma döndürün.

Ana tuşu çevirerek, güç düğmesine ve ardından SLD'ler düğmesine basarak OCT aydınlatma kaynağını açın. Galvanometre kafasını örtün ve arka plan parazit desenini ölçmek ve ölçümden çıkarmak için arka planı al'ı tıklatın. Görüntü yakalama modunu canlı görüntü olarak ayarlayın.

X ve Y ofset değerlerini ayarlayarak trabecula'yı X ve Y eksenlerinde ortala. Trabecula ortalandığında, yukarı ve aşağı akış kancalarına karşılık gelen pozisyonları bulmak için Y konumunu ayarlayarak y ekseni boyunca tarayın. Bu konumları not edin.

Y aralığını, bu değerler arasındaki mutlak farka 10'a bölün. Görüntü yakalama modunu tetiklenen uyarana ayarlayın, X ile 100 arasında aralık ve etkin parametreleri ayarla düğmesini tıklatın. Akış verilerini tıklatın ve sonra alın.

Burada sunulan trabecula'nın tüm uzunluğu için bölgesel kalsiyum ve parlak alan bilgilerini yakalamak için yedi kas pozisyonu gerekliydi. Üst üste binen pozisyonların her birinden elde edilen ortalama kuvvetin bu rakamı, seğirme kuvvetinin bu hareketle bozulmadığını ve kuvvet üretimi eyleminin pozisyon bağımlılığı olmadığını ortaya koyuyor. 100 Hertz hızında optik tutarlılık tomografisi kullanılarak toplanan bu taramalar ImageJ eklentisi Weka kullanılarak segmentlere ayrılmıştır.

Her kesit, yanal ve derinlik çözünürlükleri arasındaki fark nedeniyle bozuk görünür. Bu, her ekseni kendi çözünürlüğüyle bağımsız olarak ölçeklendirerek düzeltildi. Trabecula'nın ham C taramasını ölçeklendirdikten sonra, kas yaklaşık silindiriktir.

Ölçüm odası duvarının yansıması bazen kas verileriyle çakışabilir, ancak segmentasyon yazılımı bunu hesaba katmak için eğitilebilir. Segmentlere ayrıldığında, kasın uzunluğu boyunca kesitsel alan seğirme boyunca hesaplanabilir. Bu özel trabecula'nın küçük bir dalı olduğunu unutmayın.

Dalın hareketi trabecula boyunca yaklaşık olarak yarı yolda belirgindir. Son olarak, parçalanmış görüntüler geometrik modellerin yapımına yardımcı olmak için kafeslere dönüştürülebilir. Yedi pozisyonun her birinde saniyede 100 kare hızında yakalanan görüntüleme verileri, trabecula'nın tek bir tam görüntüsünü oluşturmak için birbirine dikildi.

340 ve 380 nanometre eksitasyon ışığı ile ilişkili atlanmış floresan oranı, trabecula Fura-2 ile yüklendikten sonra hücre içi kalsiyumla ilişkilidir. Her pencereden ortalama 10 hücre içi kalsiyum geçicisi görüntülendikleri bölge ile hizalanır. Bu trabecula için geçicilerin zirvesi makul derecede tutarlı görünse de, diyastolik kalsiyum uzunluğu boyunca azaldı.

Benzer şekilde, yer değiştirme takibi ve sarkom uzunluğu hesaplamalarının sonuçları da bölgesel değişkenliğin varlığını göstermektedir. Kullanılan işaretsiz izleme tekniği, her pikselin ötelemeyi hesaplayabilir. Sarkom uzunluğu tahminlerinin uygunluğu, Gauss'un FFT sinyaline uygun genişliğine ve genliğine göre test edildi.

Bu durumlar kas bölgesinde sıfır ile 500 mikron arasında karşılanmadığından, sarkom uzunluğu bilgisi orada hesaplanamadı. İlişkili yer değiştirmeler göz önüne alındığında, bu bölgedeki sarkomların seğirmenin kontrengi aşamasında uzaması muhtemeldir. Bu videoyu izledikten sonra, kardiyak trabeculae'yi nasıl izole edebileceğinizi ve onları güvenilir bir şekilde multimodal görüntülemeye nasıl hazırlayacağınızı iyi anlamalısınız.

Bu işlem, kardiyak doku kasılmasının fizyolojik olarak bilgilendirilmiş sonlu eleman modellerinin yapımı için gerekli bir veri kümesi toplamak için bir yol oluşturur.