Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi (MMC) kullanılarak Otomatik Mikrobiyal Yetiştirme ve Uyarlanabilir Evrim

Bu yöntem, geleneksel mikrobiyal yetiştirme yöntemleriyle ilgili sorunların çözülmesine yardımcı olabilir. Otomatik mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrim için düşük maliyetli, operasyon dostu ve sonuç açısından güvenilir bir deneysel platform sağlar. Bu teknoloji operasyonları otomatikleştirir ve işgücü tüketimini daha da azaltır.

Ve aynı zamanda, güvenilir sonuçlar ve basit işlemlerle iyi bir kültür performansına sahiptir. Teknoloji esas olarak büyüme eğrisi ölçümü, uyarlanabilir laboratuvar evrimi ve tek faktörlü çok seviyeli analiz gibi mikrobiyoloji araştırma alanlarında kullanılmaktadır. Şırınga iğnesini 0.41 milimetre iç çapa ve 0.71 milimetre dış çapa hızlı bir konektör A ve reaktif şişesine bağlayarak deneyin hazırlıklarına başlayın.

Daha sonra tüm ekipmanı 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklav yapın. Mikroakışkan çipi takmak için, operasyon odasının kapısını açın ve optik fiber probu kaldırın. Elektrik alan deliklerini iğnelerle hizaladıktan sonra, çipi yavaşça talaş kaidesine yerleştirin, ardından iki konumlandırma sütununu konumlandırma deliklerine yerleştirin ve optik fiber probu yerleştirin.

Daha sonra, çip üzerindeki hızlı A konektörünü, makalede açıklandığı gibi konum numarasına göre mikrobiyal mikrodamlacık kültür sisteminin veya MMC'nin ilgili portuna bağlayın. İşiniz bittiğinde, operasyon odasının kapısını kapatın. 10 mililitre başlangıç bakteri çözeltisi elde etmek için kültürlenmiş Escherichia coli MG1655 süspansiyonunu 0.05 ila 0.1 OD600 arasında bir OD600 ile seyreltin.

MMC'yi başlatmak için, Başlatma sekmesini tıklatın. Başlatma arayüzü göründüğünde, yetiştirme sıcaklığını 37 santigrat derece ve fotoelektrik sinyal değerini 0,6 olarak ayarlayın. Başlatma yaklaşık 20 dakika sürecektir.

Daha sonra, temiz tezgahın üzerine sterilize edilmiş bir reaktif şişesi yerleştirin ve kapağı sıkın. Şırınga iğnesinden yan tüpe kadar üç ila beş mililitre MMC yağını reaktif şişesine enjekte etmek için 10 mililitrelik steril bir şırınga kullanın. Ardından, yağın iç duvara tamamen sızmasını sağlamak için reaktif şişesini yavaşça eğin ve döndürün.

Şişeye beş mililitre ilk bakteri çözeltisi enjekte ettikten sonra, beş ila yedi mililitre MMC yağı enjekte ederek reaktif şişesini doldurun. Reaktif şişesinin bağımsız hızlı konektörü A'yı çıkarın ve numune enjeksiyon işlemini tamamlamak için hızlı A konektörünü şişenin hızlı B konektörüne takın. İşiniz bittiğinde, reaktif şişesini metal banyoya koymak için operasyon odasının kapısını açın.

Çipin C2 konektörünü ve reaktif şişesinin hızlı A konektörünü dışarı çekin. Reaktif şişesinin yan boru konektörünü C2 konektörüne ve üst boru konektörünü O2 konektörüne bağlayın. Ardından operasyon odasının kapısını kapatın.

Büyüme eğrisi ölçümünün işlevini seçmek için, parametre ayarı arayüzünde Büyüme Eğrisi'ne tıklayın, sayıyı 15 olarak girin. Ardından OD algılama anahtarını açın ve dalga boyunu 600 nanometre olarak ayarlayın. Damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat sekmesine tıklayın.

İşlemin tamamlanması 15 dakika sürecektir. Ana arayüzde bir mesaj isteyen bir açılır pencere göründüğünde, reaktif şişesini çıkarmak ve C2 ve O2 konektörlerini bağlamak için işlem odasının kapısını açın. Kapıyı kapattıktan sonra, damlacıkları otomatik olarak yetiştirmek ve OD değerlerini tespit etmek için açılır penceredeki OK düğmesine tıklayın.

Büyüme eğrisi durağan aşamaya ulaştığında, OD verilerini dışa aktarmak için Veri Dışa Aktarma düğmesini tıklatın. Veri kaydetme yolunu seçin ve yetiştirme döneminde kaydedilen OD değerini CVS biçiminde dışa aktarın Büyüme eğrisini çizmek için Excel ve Origin 9.0 gibi haritalama yazılımları kullanın. İlk bakteri çözeltisinin, taze ortamın ve MMC yağının gerekli hacimlerini, daha önce açıklandığı gibi taze ortamda ilk bakteri çözeltisi için ayrı sterilize edilmiş reaktif şişelerine enjekte edin.

Uyarlanabilir evrimin işlevini seçmek için, yazılımdaki ALES'e tıklayın. Parametre ayarı arayüzünde, OD algılama anahtarını açın, ardından makalede açıklanan tüm parametreleri ayarlayın ve damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat sekmesine basın. İşlem yaklaşık 25 dakika sürecektir.

Her alt yetiştirme döneminde, damlacıkların maksimum OD değerlerinin önemli ölçüde artıp artmadığını gözlemleyin. Artış gerçekleşirse ve deneme gereksinimlerini karşılıyorsa, OD verilerini dışa aktarmak için veri dışa aktarma düğmesine tıklayın. Hedef damlacıkları MMC'den çıkarmak için, damlacık çıkarma işlevini seçmek üzere tarama sekmesine tıklayın.

Ardından Topla seçeneğini seçin ve hedef damlacıkların sayısını tıklayın. İşiniz bittiğinde, Tamam'a tıklayın. Açılır pencerenin bir mesaj istemesini bekleyin. Ardından CF hızlı konektörünü toplama için mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve Tamam'a tıklayın. Yazılım arabirimi bir mesaj isteyen yeni bir pencere açtığında bir ila iki dakika sonra, CF hızlı bağlayıcısını geri takın ve MMC'nin çalışmaya devam etmesini sağlamak için Tamam'a tıklayın.

Bir sonraki hedef damlacık damlacık tanıma alanına ulaştığında, daha önce belirtildiği gibi toplayın. Damlacığı çıkarmak ve 90 milimetrelik katı bir plakaya yerleştirmek için 2,5 mikrolitrelik bir pipet kullanın, ardından damlayı üç santimetre yan uzunluğa sahip cam üçgen kaplı bir çubukla eşit şekilde yayın, ardından damlayı 72 saat boyunca 37 santigrat derece sabit sıcaklık inkübatöründe yetiştirin. Daha sonra, dakikada 200 rotasyonda ve 48 ila 72 saat boyunca 37 santigrat derecede sallanan bir inkübatörde 10 mililitre taze ortam içeren 50 mililitrelik bir sallama şişesinde her bir koloniyi ayrı ayrı yetiştirmek için üç ila beş bağımsız bakteri kolonisi seçin.

Kuluçkadan sonra, kültürlenmiş bakteri çözeltisini gliserol tüpünde depolamak için ilgili standart düzenlemeleri izleyin. Temsili analiz, tüm adaptif evrim sürecinde 50 damlacığın büyüme eğrilerini göstermektedir. Metanol esansiyel Escherichia coli suşu veya MeSV2.2'nin başlangıçta yavaş büyüme gösterdiği ve ardından hızlı büyüme gösterdiği gözlendi.

Tüm adaptif evrim sürecindeki damlacık altısının büyüme eğrisi ayrı ayrı çizildi. İlk nesildeki maksimum OD600 değeri 0.37 idi, bu da son alt yetiştirme döneminde 0.58'e yükseldi, bu da damlacık altıdaki suşun bariz bir adaptif evrim gerçekleştirdiğini gösteriyor. Ayrıca, damlacık altı suşu ve başlangıç geriniminin büyüme eğrileri karşılaştırıldı.

Damlacık altı suşu, sabit fazda ilk suştan daha yüksek bir maksimum spesifik büyüme hızı ve hücre konsantrasyonu sergiledi. En önemli şey, alet çipinin ve reaktif şişesinin bağlantısının doğru olduğundan emin olmaktır, bu da işlemlerin normal şekilde ilerlemesi için damlacıklardır. Bu yöntem, araştırmacılara mikroorganizmaların yetiştirilmesi için yeni bir fikir verir ve aynı zamanda suşların uyarlanabilir evrimi için verimli ve düşük maliyetli bir platform sağlar.