Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi (MMC) kullanılarak Otomatik Mikrobiyal Yetiştirme ve Uyarlanabilir Evrim
18 Şubat 2022
Bu protokol, otomatik mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrim yürütmek için Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültürü sisteminin (MMC) nasıl kullanılacağını açıklamaktadır. MMC, mikroorganizmaları otomatik ve sürekli olarak yetiştirebilir ve alt yetiştirebilir ve nispeten yüksek verim ve iyi paralelleştirme ile büyümelerini çevrimiçi olarak izleyebilir, işçiliği ve reaktif tüketimini azaltabilir.
Bu yöntem, geleneksel mikrobiyal yetiştirme yöntemleriyle ilgili sorunların çözülmesine yardımcı olabilir. Otomatik mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrim için düşük maliyetli, operasyon dostu ve sonuç açısından güvenilir bir deneysel platform sağlar. Bu teknoloji operasyonları otomatikleştirir ve işgücü tüketimini daha da azaltır.
Ve aynı zamanda, güvenilir sonuçlar ve basit işlemlerle iyi bir kültür performansına sahiptir. Teknoloji esas olarak büyüme eğrisi ölçümü, uyarlanabilir laboratuvar evrimi ve tek faktörlü çok seviyeli analiz gibi mikrobiyoloji araştırma alanlarında kullanılmaktadır. Şırınga iğnesini 0.41 milimetre iç çapa ve 0.71 milimetre dış çapa hızlı bir konektör A ve reaktif şişesine bağlayarak deneyin hazırlıklarına başlayın.
Daha sonra tüm ekipmanı 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklav yapın. Mikroakışkan çipi takmak için, operasyon odasının kapısını açın ve optik fiber probu kaldırın. Elektrik alan deliklerini iğnelerle hizaladıktan sonra, çipi yavaşça talaş kaidesine yerleştirin, ardından iki konumlandırma sütununu konumlandırma deliklerine yerleştirin ve optik fiber probu yerleştirin.
Daha sonra, çip üzerindeki hızlı A konektörünü, makalede açıklandığı gibi konum numarasına göre mikrobiyal mikrodamlacık kültür sisteminin veya MMC'nin ilgili portuna bağlayın. İşiniz bittiğinde, operasyon odasının kapısını kapatın. 10 mililitre başlangıç bakteri çözeltisi elde etmek için kültürlenmiş Escherichia coli MG1655 süspansiyonunu 0.05 ila 0.1 OD600 arasında bir OD600 ile seyreltin.
MMC'yi başlatmak için, Başlatma sekmesini tıklatın. Başlatma arayüzü göründüğünde, yetiştirme sıcaklığını 37 santigrat derece ve fotoelektrik sinyal değerini 0,6 olarak ayarlayın. Başlatma yaklaşık 20 dakika sürecektir.
Daha sonra, temiz tezgahın üzerine sterilize edilmiş bir reaktif şişesi yerleştirin ve kapağı sıkın. Şırınga iğnesinden yan tüpe kadar üç ila beş mililitre MMC yağını reaktif şişesine enjekte etmek için 10 mililitrelik steril bir şırınga kullanın. Ardından, yağın iç duvara tamamen sızmasını sağlamak için reaktif şişesini yavaşça eğin ve döndürün.
Şişeye beş mililitre ilk bakteri çözeltisi enjekte ettikten sonra, beş ila yedi mililitre MMC yağı enjekte ederek reaktif şişesini doldurun. Reaktif şişesinin bağımsız hızlı konektörü A'yı çıkarın ve numune enjeksiyon işlemini tamamlamak için hızlı A konektörünü şişenin hızlı B konektörüne takın. İşiniz bittiğinde, reaktif şişesini metal banyoya koymak için operasyon odasının kapısını açın.
Çipin C2 konektörünü ve reaktif şişesinin hızlı A konektörünü dışarı çekin. Reaktif şişesinin yan boru konektörünü C2 konektörüne ve üst boru konektörünü O2 konektörüne bağlayın. Ardından operasyon odasının kapısını kapatın.
Büyüme eğrisi ölçümünün işlevini seçmek için, parametre ayarı arayüzünde Büyüme Eğrisi'ne tıklayın, sayıyı 15 olarak girin. Ardından OD algılama anahtarını açın ve dalga boyunu 600 nanometre olarak ayarlayın. Damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat sekmesine tıklayın.
İşlemin tamamlanması 15 dakika sürecektir. Ana arayüzde bir mesaj isteyen bir açılır pencere göründüğünde, reaktif şişesini çıkarmak ve C2 ve O2 konektörlerini bağlamak için işlem odasının kapısını açın. Kapıyı kapattıktan sonra, damlacıkları otomatik olarak yetiştirmek ve OD değerlerini tespit etmek için açılır penceredeki OK düğmesine tıklayın.
Büyüme eğrisi durağan aşamaya ulaştığında, OD verilerini dışa aktarmak için Veri Dışa Aktarma düğmesini tıklatın. Veri kaydetme yolunu seçin ve yetiştirme döneminde kaydedilen OD değerini CVS biçiminde dışa aktarın Büyüme eğrisini çizmek için Excel ve Origin 9.0 gibi haritalama yazılımları kullanın. İlk bakteri çözeltisinin, taze ortamın ve MMC yağının gerekli hacimlerini, daha önce açıklandığı gibi taze ortamda ilk bakteri çözeltisi için ayrı sterilize edilmiş reaktif şişelerine enjekte edin.
Uyarlanabilir evrimin işlevini seçmek için, yazılımdaki ALES'e tıklayın. Parametre ayarı arayüzünde, OD algılama anahtarını açın, ardından makalede açıklanan tüm parametreleri ayarlayın ve damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat sekmesine basın. İşlem yaklaşık 25 dakika sürecektir.
Her alt yetiştirme döneminde, damlacıkların maksimum OD değerlerinin önemli ölçüde artıp artmadığını gözlemleyin. Artış gerçekleşirse ve deneme gereksinimlerini karşılıyorsa, OD verilerini dışa aktarmak için veri dışa aktarma düğmesine tıklayın. Hedef damlacıkları MMC'den çıkarmak için, damlacık çıkarma işlevini seçmek üzere tarama sekmesine tıklayın.
Ardından Topla seçeneğini seçin ve hedef damlacıkların sayısını tıklayın. İşiniz bittiğinde, Tamam'a tıklayın. Açılır pencerenin bir mesaj istemesini bekleyin. Ardından CF hızlı konektörünü toplama için mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve Tamam'a tıklayın. Yazılım arabirimi bir mesaj isteyen yeni bir pencere açtığında bir ila iki dakika sonra, CF hızlı bağlayıcısını geri takın ve MMC'nin çalışmaya devam etmesini sağlamak için Tamam'a tıklayın.
Bir sonraki hedef damlacık damlacık tanıma alanına ulaştığında, daha önce belirtildiği gibi toplayın. Damlacığı çıkarmak ve 90 milimetrelik katı bir plakaya yerleştirmek için 2,5 mikrolitrelik bir pipet kullanın, ardından damlayı üç santimetre yan uzunluğa sahip cam üçgen kaplı bir çubukla eşit şekilde yayın, ardından damlayı 72 saat boyunca 37 santigrat derece sabit sıcaklık inkübatöründe yetiştirin. Daha sonra, dakikada 200 rotasyonda ve 48 ila 72 saat boyunca 37 santigrat derecede sallanan bir inkübatörde 10 mililitre taze ortam içeren 50 mililitrelik bir sallama şişesinde her bir koloniyi ayrı ayrı yetiştirmek için üç ila beş bağımsız bakteri kolonisi seçin.
Kuluçkadan sonra, kültürlenmiş bakteri çözeltisini gliserol tüpünde depolamak için ilgili standart düzenlemeleri izleyin. Temsili analiz, tüm adaptif evrim sürecinde 50 damlacığın büyüme eğrilerini göstermektedir. Metanol esansiyel Escherichia coli suşu veya MeSV2.2'nin başlangıçta yavaş büyüme gösterdiği ve ardından hızlı büyüme gösterdiği gözlendi.
Tüm adaptif evrim sürecindeki damlacık altısının büyüme eğrisi ayrı ayrı çizildi. İlk nesildeki maksimum OD600 değeri 0.37 idi, bu da son alt yetiştirme döneminde 0.58'e yükseldi, bu da damlacık altıdaki suşun bariz bir adaptif evrim gerçekleştirdiğini gösteriyor. Ayrıca, damlacık altı suşu ve başlangıç geriniminin büyüme eğrileri karşılaştırıldı.
Damlacık altı suşu, sabit fazda ilk suştan daha yüksek bir maksimum spesifik büyüme hızı ve hücre konsantrasyonu sergiledi. En önemli şey, alet çipinin ve reaktif şişesinin bağlantısının doğru olduğundan emin olmaktır, bu da işlemlerin normal şekilde ilerlemesi için damlacıklardır. Bu yöntem, araştırmacılara mikroorganizmaların yetiştirilmesi için yeni bir fikir verir ve aynı zamanda suşların uyarlanabilir evrimi için verimli ve düşük maliyetli bir platform sağlar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, otomatikleştirilmiş mikrobiyal kültür ve uyarlanabilir evrime yönelik Mikrobiyal Mikrodamla Kültür sistemini (MMC) tanımlar. Kültür performansını artırırken emeği ve reaktif tüketimini azaltarak düşük maliyetli, kullanıcı dostu bir platform sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Otomatikleştirilmiş Kültür
- Uyarlanabilir Evrim
Arka Plan
- Geleneksel mikrobiyal kültür yöntemleri emek yoğun ve kaynak tüketebilir.
- Otomatikleştirilmiş sistemler mikrobiyal araştırmalarda verimliliği ve güvenilirliği artırabilir.
- MMC sistemi mikrobiyal büyümenin sürekli izlenmesine olanak tanır.
- Bu teknoloji özellikle büyüme eğrisi ölçümü ve uyarlanabilir laboratuvar evrimi için yararlıdır.
Çalışmanın Amacı
- Mikrobiyal kültür için güvenilir ve verimli bir yöntem sağlamak.
- Kültür sürecini otomatikleştirmek ve el emeğini azaltmak.
- Mikrobiyoloji alanında uyarlanabilir evrime yönelik çalışmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Bir şırınga iğnesini hızlı bağlayıcı ve reaktif şişesine bağlama.
- Sürekli mikrobiyal kültür için MMC sistemini kullanma.
- Yüksek verimli analiz için büyümeyi çevrimiçi izleme.
- Basit operasyonel prosedürlerle deneyler yürütme.
Ana Sonuçlar
- MMC sistemi iyi kültür performansı gösterir.
- Sonuçlar, emek tüketimini azaltarak güvenilir sonuçlar gösterir.
- Bu yöntemle uyarlanabilir evrimin verimli bir şekilde yürütülebileceği gösterilmiştir.
- Mikrobiyal çalışmalarda yüksek verim ve eşzamanlılık sağlanmaktadır.
Sonuçlar
- MMC sistemi, mikrobiyoloji araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Mikrobiyal kültür ve evrimin sürecini basitleştirir.
- Bu teknoloji mikrobiyal çalışmalarda önemli gelişmelere yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The Microbial Microdroplet Culture (MMC) system addresses key limitations in conventional microbial cultivation by enabling automated, high-throughput growth monitoring and adaptive evolution with reduced labor and reagent consumption. This platform supports early-stage discovery workflows where reproducible, quantitative microbial phenotypes are essential for target validation and lead identification. Its integration of droplet generation, online OD monitoring, and sub-cultivation enhances data reliability and parallelization, improving predictive confidence in strain engineering efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microbial growth phenotypes under controlled conditions to support functional target validation and pathway de-risking.
- Operational Value: Automates inoculation, cultivation, and monitoring steps, reducing manual variability and increasing reproducibility across biological replicates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative OD600 measurements across thousands of microdroplets, enabling high-resolution phenotypic screening for adaptive traits.
- Operational Value: Standardizes culture conditions through precise fluid control and environmental regulation, improving assay consistency and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports adaptive laboratory evolution (ALE) studies to model strain adaptation, providing mechanistic insights for enzyme engineering and metabolic pathway optimization.
- Operational Value: Facilitates isolation of evolved droplets and downstream validation in shake flasks, bridging microfluidic screening with conventional microbiological workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The MMC system fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven strain characterization and adaptive evolution prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Enables controlled cultivation and real-time growth tracking to assess genetic modifications and environmental responses in microbial strains.
- Screening: Provides droplet-based, parallel cultivation with online OD detection for high-throughput screening of growth variants under selection pressure.
- Analytics: Outputs time-resolved OD600 data for growth curve analysis, enabling quantitative comparison of microbial fitness across generations.
- Translational Research: Links microfluidic screening to offline validation via droplet extraction and shake flask cultivation, supporting continuity from discovery to preclinical evaluation.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, automated platform for repeated use in microbial strain development programs, reducing retooling costs across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in strain performance by enabling reproducible, high-resolution growth measurements and adaptive evolution tracking.
- Operational Value: Reduces hands-on time and reagent use through automation of inoculation, sub-cultivation, and sampling steps.
- Strategic Value: Accelerates strain optimization cycles, supporting faster go/no-go decisions in metabolic engineering and enzyme development programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial strains based on quantitative evolutionary trajectories and growth kinetics.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with microfluidic chip handling, syringe-based reagent loading, and optical calibration for OD detection.
- Depends on stable temperature control (37°C), precise fluidics, and biocompatible oil phases to maintain droplet integrity and prevent evaporation.
- Necessitates standardized protocols for droplet generation, sorting, and extraction to ensure cross-user reproducibility and data comparability.
- Involves adaptation steps when transferring evolved droplets to solid media and shake flasks for offline validation and characterization.
- Limited by the need for sterile reagent preparation and proper sealing to avoid contamination during extended cultivation runs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Preparations for the Experiment
1:48
Growth Curve Measurement in Microbial Microdroplet Culture System (MMC)
4:25
Adaptive Evolution in Microbial Microdroplet Culture System (MMC)
6:41
Results: The Adaptive Evolution of the Methanol-Essential Escherichia coli (MeSV2.2) in MMC
7:36
Conclusion
