Name: Gıda Kaynaklı Patojenlerin Biyokontrolü için Bakteriyofaj Etkinliği Yüksek Verimli Ayarlarla Değerlendirildi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Öğrenin, yüksek verimli ayarlarla bakteriyofaj kokteyllerinin antibakteriyel etkinliğini değerlendirmeyi. Bu yöntem, gıda kaynaklı patojenlerin biyokontrolü için optimize tedaviler tasarlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), Canada Foundation for Innovation (Project # 38710) ve Major Innovation Fund, Alberta tarafından desteklendi. Dr. John Kastelic'e taslağı düzenlediği için teşekkür ederiz.

1. Tampon ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>500 mL triptik soya suyu (TSB) (15 g TSB tozu ve 500 mL ultra saf su) ve otoklav yapın. NOT: Bu, oda sıcaklığında 3 aya kadar veya 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>500 mL triptik soya agar (TSA) (20 g TSA tozu ve 500 mL ultra saf su) ve otoklav yapın. NOT: Bu, 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>500 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS; 4 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,77 g Na2HPO4 ve 0,12 g KH2PO4, 500 mL ultra saf su), pH'ı ölçün ve 25 °C'de 0,2'± 7,2'ye ayarlayın ve otoklav. NOT: Bu, 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>200 mL 1 M MgSO4 (49.294 g ve 200 mL ultra saf su) yapın ve 0.22 μm poliethersülfon filtre ile sterilize edin.</li>
	<li>10 mM MgSO4 (mTSB; 15 g TSB tozu, 500 mL ultra saf su ve 5 mL 1 M MgSO4) ve otoklav ile 500 mL TSB yapın; otomatik kapatılmış ortamı oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Aseptik tekniği uygulayın. Serolojik bir pipet kullanarak, 1 M MgSO4'ün 5.0 mL'sini dikkatlice aktarın; karıştırmak için hafifçe döndürün.</li>
</ol>2. Bakteri kültürünün hazırlanması
<ol><li>Bakteriyel Araştırma Laboratuvarı Kültürünü (BRLC) hazırlamak için gliserol stok şişelerini dondurucu envanterinden çıkarın ve laboratuvara aktarın.</li>
	<li>Tek kullanımlık bir aşılama döngüsü veya eşdeğeri kullanın, şişeye daldırın, inoculum (dondurulmuş çamur) kazımasını çıkarın ve seviye II biyolojik güvenlik kabini içinde bir TSA plakasına veya eşdeğerine çizgi çizin. Plakayı 15−18 saat boyunca 37 ± 2 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hazırlanan BRLC plakalarını torbalayın ve 4 °C'de saklayın. NOT: BRLC için genel son kullanma süresi: Nesilden sonra 4 °C'de 14 gün.</li>
	<li>BRLC plakalarından 10 mL TSB'de test edilecek her E. coli O157 suşundan tek bir koloni aşılayın ve 9 kütüğe ulaşmak için 18 saat boyunca 37 °C'de statik olarak kuluçkaya yatırın10 CFU/mL.</li>
	<li>4-5 log10 CFU/ml (veya diğer istenen inoculum seviyesi) elde etmek için 10 mM MgSO4 içeren mTSB kullanarak her bir E. coli O157 suşu olan gece kültürlerinin seri seyreltilmesini hazırlayın (ertesi sabah).</li>
	<li>Bakteri karışımını hazırlamak için toplamda (veya isndenildiği gibi) 4-5 log10 CFU/mL elde etmek için her bir suşun bir gecede kültürünün eşit hacmini karıştırın.</li>
	<li>Seyreltilmiş bakteri kültürünü bekleyen kullanım için hemen 4 °C'ye yerleştirin.</li>
	<li>İzole kolonileri elde etmek için TSA plakalarında inokülum kültürünü 10 veya 100 kat ve plaka 0,1 mL aliquots'u seyreltin.</li>
</ol>3. Faj çalışma çözümlerinin hazırlanması
<ol><li>Standart yöntemleri izleyerek taranacak her faj için yüksek titreli çalışma stoklarını (≥108 PFU/mL) yayın4. NOT: Faj stokları için genel son kullanma süresi, nesilden sonra 4 °C'de plastik bir şişede 3 aydır.</li>
	<li>Lizis kinetiği için ~108 PFU/mL gibi istenen titeri elde etmek için, 10 mM MgSO4 içeren mTSB ile bireysel faj preparatlarını seyreltin. Her çalışan stoğun eşit hacimlerini tüm olası kombinasyonlarda aynı titreyle karıştırarak faj kokteylleri hazırlayın.</li>
</ol>4. Bireysel faj ve faj kokteylleri için in-vitro liziz kinetiğinin hazırlanması
<ol><li>Mikro plaka testini ayarlamak için steril 96 kuyulu mikro plakalarda Sütun 1-8'deki her fajın seri 10 kat seyreltmelerini hazırlayın. NOT: Bir bakteri suşuna karşı dört faj, her plakada bitişik sütunlarda, yinelenen olarak test edilebilir. Kalan dört sütun, fajsız ve mTSB boş olan kontroller içindir (Şekil 1).</li>
	<li>96 kuyulu mikro plakanın Sütun 1 ila 12'sinden kuyularına 180 μL mTSB yerleştirin.</li>
	<li>Mikro plakanın üst sırasının (Satır A) 1-8'indeki kuyulara 20 μL seyreltilmiş bireysel faj veya faj kokteyli (~108 PFU/mL) ekleyin.</li>
	<li>Fajsız ve Boş kontrol için Sütun 9, 10 ve 11'in üst kuyusuna 20 μL mTSB ekleyin.</li>
	<li>12 kanallı pipetle plakayı seyreltin. 20 μL'yi satırdan satıra aktarın. Kuyu içeriğini nazik, tekrarlanan aspirasyon, fırlatma (en az beş kez) ve seyreltmeler arasındaki ipuçlarını değiştirerek karıştırın. Son satırdan 20 μL çıkarın (H Satırı). NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için filtreli uçların kullanılması önerilir.</li>
	<li>Her suş için bir rezervuar kurun, seyreltilmiş kültürün 2-3 mL'lik kısmını rezervuara aktarmak için 1 mL pipet kullanın. 1-10 sütunları için, her kuyuya seyreltilmiş bakteri kültürünün 20 μL'lik kısmını eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Her ekleme arasında ipuçlarını değiştirin.</li>
	<li>Mikro plakayı istediğiniz koşullarda örtün ve kuluçkaya yatırın (örneğin, 10 saat için 37 °C veya 22 saat için 22 °C).</li>
	<li>2 saat veya istenen diğer aralıklarla, mikro plakaları inkübatörden çıkarın.</li>
</ol>5. Optik yoğunluğun belirlenmesi
<ol><li>Microplate Reader kullanarak 600 nm'de (OD600nm) optik yoğunluk haline gelen optik yoğunluğu inceleyin. NOT: Test plakası hazırlığından önce test protokolünün programda kurulması ve kaydedilmeleri önerilir.</li>
	<li>Mikro plaka okuyucuyu açın ve programı açın.</li>
	<li>Başlangıç Seçenekleri penceresinde Basit modu seçin ve Görev Yöneticisi'nde Yeni Protokol Oluştur'u seçin (Tamamlayıcı Şekil 1a,b).</li>
	<li>Plaka Türünü Seç penceresinden, açılan listeden 96 Kuyu Plakası'nı seçin (Tamamlayıcı Şekil 2).</li>
	<li>Algılama yöntemi için Absorbance'ı , okuma türü için Bitiş Noktası/Kinetik seçeneğini ve optik türü için Monokromatörler'i seçin. Tamam'a tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 3).</li>
	<li>Okuma Adımı için dalga boyları için 600 nm girin ve okuma hızı için Normal'i seçin. Tamam'a tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 4).</li>
	<li>Test sıcaklığını ayarlamak için Kuluçka onay kutusunu tıklatın ve İnkübatör Açık'ı seçin. Sıcaklık kutusuna istediğiniz sıcaklığı girin. Tamam'a tıklayın. Kuluçka sırasında plaka kapağında yoğuşma olmasını önlemek için Degrade kutusuna bir değer (1-3) girerek bir sıcaklık gradyanı ayarlayın . Tamam'a tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 5a). NOT: 37 °C kuluçka sıcaklığı için Sonraki Adımla Devam Etmeden Önce Önceden Isın onay kutusunu tıklatın. Bu adım 22 °C'deki (RT) test durumu için gerekli değildir.</li>
	<li>Ardından, Kinetik Kurulumu açmak için Kinetik onay kutusunu tıklatın. Çalışma süresini 37 °C inkübasyon için 10 saat veya RT için 22 saat olarak ayarlayın. Tamam'a tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 5b).</li>
	<li>Her kinetik okuma için gerekirse sallama koşulu ayarlamak için Yordam penceresindeki Sallama onay kutusunu tıklatın (Tamamlayıcı Şekil 6a).</li>
	<li>Sallama Modları için Doğrusal'ı seçin ve Süre'yi 30 sn olarak değiştirin Doğrusal Frekans değerini 731 cpm (2 mm) olarak ayarlayın ve Tamam'a tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 6b).</li>
	<li>Protokol Özeti Diyaloğu penceresinde, Plaka Düzeni'ni tıklatın ve Boşluklar, Test Denetimleri ve Örnekler'i seçin. İleri'ye tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 7). NOT: Negatif denetim için Farklı Denetim Türü Sayısı'na 1 girin.</li>
	<li>Her kuyu türünün ayarlarını tanımladıktan sonra Son'a tıklayın.</li>
	<li>Sol taraftaki arabirimde bir Kuyu Kimliği seçin ve sonra bunu plaka düzeni dulunda gösterilen matrise atayın. Tamam'a tıklayın (Ek Şekil 8).</li>
	<li>Plakayı Oku düğmesine tıklayın ve protokolü .prt dosyası olarak kaydedin ve Kaydet'e tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 9).</li>
	<li>Plakayı takın ve Tamam'ı tıklatın.</li>
	<li>Deneme tamamlandıktan sonra, denemeyi .xpt dosyası olarak kaydedin ve Kaydet'e tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 10).</li>
	<li>Daha fazla analiz için ileti penceresi kutusundaki Evet düğmesini tıklatarak verileri Excel'e verin (Tamamlayıcı Şekil 11).</li>
	<li>Tercihi kaydetmek için Evet/Hayır Kaydet seçimine ve Bir Daha Sorma onay kutusuna tıklayın.</li>
</ol>6. Veri analizleri
<ol><li>Yukarıda açıklandığı gibi en az iki bağımsız deneyi tekrarlayın. Tüm bağımsız denemelerden sonuçları derleyin. OD600'ün her fajla işlenmiş ve içermeyen kültürden ortalama ve standart sapması hesaplayın.</li>
	<li>OD değerlerinin karekökünü 600 nm'de gerçekleştirin ve her bakteri suşu ve sıcaklığı için uygun bir istatistiksel model kullanarak analiz edin. NOT: SAS yazılımı için, KARMA model ve araçları ayırt etmek için en az kareler (P < 0.05) seçilir. Her suş için, zaman ve MBI'ler arasında genel anti-O157 etkinliğinin farklı olduğu her faj tedavisine A−G panelleri atayın (P < 0.05).</li>
	<li>Tespit edilebilir bakteri üremesine karşılık gelen OD600nm değerine ≤ 0,01'e göre üstün faj etkinliği tanımlayın (algılama sınırı:300 CFU/mL).<ol>
<li>Uygun bir istatistiksel model kullanarak zamanın, kuluçka sıcaklığının, E. coli O157 suşlarının, MBI'lerin ve faj türlerinin faj etkinliği üzerindeki etkilerini analiz edin. NOT: SAS yazılımı için GLIMMIX'i rastgele önlemlerle kullanın.</li>
		<li>Farklı çevresel ve biyolojik ilgi faktörleri için üstün etkinliği karşılaştırmak için Oran Oranlarını Hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+and+their+derivatives+for+the+treatment+and+control+of+food-producing+animal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).</li>
<li>Czaplewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+antibiotics-a+pipeline+portfolio+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).</li>
<li>Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+in+bacterial+infections+treatment%3A+one+hundred+years+after+the+discovery+of+bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Escherichia+coli+O157+on+beef+at+37%2C+22+and+4%C2%B0C+by+T5-%2C+T1-%2C+T4-and+O1-like+bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4°C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages.</a> Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), (2018).</li>
<li>Ly-Chatain, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+factors+affecting+effectiveness+of+treatment+in+phages+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiololgy%22%5BJournal%5D)">The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy.</a> Frontiers in Microbiololgy. 5, 51(2014).</li>
<li>Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-based+biocontrol+strategies+and+their+application+in+agriculture+and+aquaculture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).</li>
<li>Bourdin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coverage+of+diarrhoea-associated+Escherichia+coli+isolates+from+different+origins+with+two+types+of+phage+cocktails%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails.</a> Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).</li>
<li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+individual+bacteriophages+does+not+predict+efficacy+of+bacteriophage+cocktails+for+control+of+Escherichia+coli+O157%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiololgy%22%5BJournal%5D)">Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157.</a> Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712(2021).</li>
<li>Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+bacteriophage+T5virus+on+growth+of+Shiga+toxigenic+Escherichia+coli+and+Salmonella+strains+in+individual+and+mixed+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures.</a> Virology Journal. 17, 3(2020).</li>
<li>Brüssow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+needed+for+phage+therapy+to+become+a+reality+in+Western+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine.</a> Virology. 434 (2), 138-142 (2012).</li>
<li>Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+cocktails+and+the+future+of+phage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage cocktails and the future of phage therapy.</a> Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).</li>
<li>Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+therapy%3A+developments+and+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage therapy: developments and directions.</a> Antibiotics. 9 (3), Basel, Switzerland. 135(2020).</li>
<li>Niu, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+range+and+lytic+capability+of+four+bacteriophages+against+bovine+and+clinical+human+isolates+of+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan eder.

Bu protokol, STEC9 ve Salmonella10 da dahil olmak üzere gıda kaynaklı patojenlere karşı faj etkinliğini sistemsel olarak değerlendirmek için sağlam bir yaklaşım tanımlamaktadır. Kritik bir adım, bakterinin geceleme kültürünü seyreltirken, önceden soğutulmuş ortam kullanırken ve seyreltmeyi bir buz kovasıyla manipüle ederken potansiyel bakteri üremesini en aza indirmesi tavsiye edilir. Ek olarak, bakteri kültürünü seyreltmeden önce faj seyreltme hazırlandı. Numaralandırma adımı 2.8, uygulanan nihai MOI'nin hesaplanması için gerçek sayıda bakteriyel inoculum sağladı. Faj hazırlamada genellikle 4-6 saat bakteri kültüründe enfekte olmuş filtre fajı ile hazırlanan ham fajlysates kullanılır. Faj enfeksiyaklığı ile ilişkili kritik adım her zaman 3 ay içinde hazırlanan faj iş stoklarını kullanmaktır. Son derece doğru pipetleme (özellikle çok kanallı pipet kullanırken) ve yaklaşımın homojenliği de karşılaştırılabilir ve yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. 10 mM Mg2+ ile desteklenmiş modifiye TSB, fajların adsorpsiyonunu ve enfeksiyonunu optimize etmek için fajları, bakteri kültürünü ve baz ortamı seyreltmek için kullanıldı.
Bakteriler kütük aşamasında, hatta inkübatör sıcaklığının altında çoğaldıkça, potansiyel bakteri üremesini en aza indirmek için kütük faz kültürü yerine seyreltilmiş geceleme kültürünün kullanılması önerilir.
Önerilen protokolün sınırlamaları vardır. İlk olarak, mikro plaka sadece 200 μL tutabildiğinden, uzun süreli inkübasyon önemli buharlaşmaya neden olabilir ve önerilmez. Bu durumda, test yavaş büyüyen bakteriler için uygun olmayabilir. İkincisi, önerilen protokol fajların amplifikasyonunu izleyemedi. Üçüncü olarak, bu protokol faj tedavisinin sonucunu belirleyen kritik bir faktör olan faj direncinin gelişimini zaman içinde izleyemedi11,12. Kapsamlı bir et suyu kültürü sisteminde ve diğer biyolojik matrislerde anti-faj mutantlarının ortaya çıkmasını önlemede taramadaki en etkili kokteylin daha fazla performansını değerlendirmek için takip deneyleri gereklidir.
Geleneksel antimikrobiyallerin aksine, fajların biyolojik doğası pratik ortamlarda biyokontrol ve terapötik kullanımın karmaşıklığını etkiler. Geleneksel olarak, faj kokteyllerinin rasyonel seçimi öncelikle litik aktiviteye ve ana faj aralığına dayanmaktadır. En güçlü litik aktiviteye ve en geniş konak aralığına sahip faj adayları genellikle 13,14 önerilir. Bununla birlikte, mevcut çalışmaya dayanarak, rV5 ve T1 gibi fajlar, tek başına T4 ve T5 kadar virülan olmasa da, T4 ve / veya T5 ile birleştirildiğinde genel biyokontrol sonucunu büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Sonuç olarak, faj kokteyllerinin üstün etkinliğini elde etmek için, potansiyel faj kombinasyonlarının istenen çevresel koşullar altında hedeflenen konak suşlarına karşı antibakteriyel aktivitesinin sistemik olarak taranması önerilir. Ek olarak, faj adayları için reseptörlerin belirlenmesi ve çeşitli reseptörlere sahip fajların dahil edilmesi, konak bağlanma rekabetini önleyebilir, anti-faj mutantlarının hızlı gelişimini engelleyebilir ve biyokontrol sonuçlarını iyileştirebilir13.
Bu yöntem, faj liziz kinetiğinin yüksek aktarım hızı biçiminde doğru ölçülmesini sağladı. Ayrıca, çeşitli fajların antibakteriyel etkinliği üzerinde çeşitli biyolojik ve çevresel faktörlerin sistematik olarak değerlendirilmesini sağladı ve böylece faj kokteyllerinin formülasyonunu optimize edilmiş sonuçlarla kolaylaştırdı. Yöntemin gelecekteki uygulamalarının ve gelişiminin, fajların floresan etiketlemesi ile faj kokteyllerindeki her fajın etkinliğini yerinde izlemeyi içerdiği varsayılıyor. Önerilen protokole ek olarak, bir konağı birlikte enfekte ederken fajlar arasındaki sinerjik ve kolaylaştırılmış etkileri teşvik eden genetik belirleyicileri anlamak, uygun faj kokteyllerinin üstün etkinlikle formülasyonunu kolaylaştıracaktır.

Bakteriyofajlar (fajlar), bakteri hücrelerini doğal olarak istila eden, bakteri metabolizmasını bozan ve bakterinin lizizine neden olan virüslerdir. Geleneksel antimikrobiyallerin (örneğin antibiyotikler) aksine, faj konak spektrumları nispeten dardır, sadece hedeflenen bir bakteri türü veya suş kümesini enfekte edebilir ve bu nedenle hayvan ve insan sağlığına fayda sağlayan mikrobiyota üzerindeki ikincil etkileri en aza indirmelidir. Antimikrobiyal direncin (AMR) artmasıyla, fajlar ve türevleri, insanlarda ve hayvanlarda AMR bakteriyel enfeksiyonları da dahil olmak üzere bakteriyel bulaşıcı hastalıkları kontrol etmek için alternatif antimikrobiyallere yol açar1,2. Fajlar, yüzeysel enfeksiyonlara ve insanların üst solunum sistemi ve gastrointestinal sisteminin enfeksiyonlarına neden olan 20 > bakteriyel patojenlere karşı terapötik potansiyeli doğruladı3.
Tarımsal ortamlarda, faj bazlı bir biyokontrol stratejisi, bakteriyel patojenleri kontrol etmek için fajların terapötik kullanımıdır. Faj biyokontrolü, çeşitli gıdalarda gıda kaynaklı patojenlerin (örneğin, Shiga-toksin üreten Escherichia coli (STEC), Salmonella ve Listeria) dekontaminasyonunda etkili olan yeşil bir teknoloji olarak kabul edilir4,5. Ek olarak, fajlar, istenen sonuçları iyileştirmek ve çevresel etkileri azaltmak için geleneksel antimikrobiyal sistemlere (örneğin kimyasallar, buhar ve sıcak su pastörizasyonu) entegre edilebilen gıda işleme yüzeylerini ve hayvan postlarını dezenfekte etmek için dezenfektan olarak kullanılabilir. Hayvanlarda zoonotik bakterileri azaltmak için fajların kullanımı da umut vericidir1. Bununla birlikte, çeşitli gıda üretim sistemlerinde popüler olarak uygulanacak faj biyokontrol yaklaşımından kaynaklanan sonuçları iyileştirmek için teknik zorlukların ele alınmasına ihtiyaç vardır. Temel zorluk, bakterilere dirençli mutantların gelişimi nedeniyle fajların etkinliğinin bozulması5 ve çevresel stresörlere maruz kalmaya bağlı bakteri fizyolojislerindeki değişikliklerdir6.
Faj direnci riskini en aza indirmek için faj kokteylleri (yani birden fazla faj kombinasyonu) önerilmektedir ve tarım ve su ürünleri ortamlarında biyokontrol gücünü artırmıştır7. Bununla birlikte, çeşitli çalışmalardan, faj kokteyllerinin her zaman tek bir fajın yönetiminden daha iyi etkinlik sunmadığını kanıtlamıştır. Örneğin, 3 T4 benzeri fajdan oluşan bir kokteyl, E. coli suşlarına karşı daha dar bir konak aralığına sahipti8. Ayrıca, Tequintavirus'un bir üyesi olan AKFV33, uygulanan kuluçka sıcaklıklarına rağmen E. coli O157'yi sığır etinden çıkarmada dört fajlık bir kokteylden daha fazla etkililiğe sahipti4. Son zamanlarda, bireysel fajların etkinliğinin, birden fazla faj arasındaki etkileşimler etkinliği değiştirebileceğinden, O1579'un kontrolü için faj kokteyllerinin etkinliğini tahmin etmediği bildirilmiştir. En önemlisi, faj cins ve kombinasyonları, hedeflenen suşlar ve MBI'ler ve kuluçka sıcaklıkları ve zamanları gibi çok sayıda faktör fajlar arasındaki etkileşimleri etkileyebilir. Bu nedenle, faj sinerjisini veya kolaylaştırmayı değerlendirmek veya en azından belirli çevresel koşullar altında minimum faj düşmanlığını sağlamak için fajların belirli bakterilere karşı kombinasyonlarını dikkatlice taramak, optimal sonuçlar için hayati derecede önemlidir. Burada, çeşitli faya kombinasyonlarının çeşitli çevresel koşullar altında gıda kaynaklı patojenlere karşı etkinliğini sistematik olarak değerlendirmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yaklaşımın yararı, fajların antibakteriyel etkinliğini etkileyeceği tahmin edilen tüm olası biyotik ve abiyotik faktörlerin doğal ortamlarda taranmasını sağlamaktır. Protokolde, STEC O157 ve enfekte edici fajları örnek olarak bunların sınanmıştır.

<table><tbody><tr><td> Temel malzemeler, reaktifler ve ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Aşılama döngüleri</td><td>VWR</td><td>12000-806</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Sigma</td><td>1374361</td><td>MgSO4.7H2O</td></tr><tr><td>Şeffaf Kapaklı Petri</td><td>Kapları Fisher</td><td>FB0875713</td><td>Çapı: 100 mm, steril</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td>Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-300XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014405</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite Çoklu Pipet L12-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite Pipet, Unv. SL-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014412</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Uçları RT LTS 1000&micro; L FL 768A/8-düşük tutma</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>30389213</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Uçları SR LTS 20&micro; L F 960A/5</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17005860</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Uçları SR LTS 300&micro; L 768A/4</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17005867</td><td>filtresiz</td></tr><tr><td>Rezervuar</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>89094-662</td><td></td></tr><tr><td>Steril, şeffaf, 96 oyuklu kapaklı düz tabanlı polistiren mikroplakalar</td><td>Fisher</td><td>168055</td><td></td></tr><tr><td>Triptik soya agar (TSA)</td><td>Sigma</td><td>105458-0500</td><td></td></tr><tr><td>Triptik soya suyu (TSB)</td><td>Sigma</td><td>105459-0500</td><td></td></tr><tr><td>T-Şekilli Hücre Yayıcılar</td><td>VWR</td><td>76299-566</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analog Vorteks Karıştırıcı</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Kompakt Mikrobiyolojik İnkübatörler</td><td>Fisher</td><td>50125590H</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Karıştırıcı Ocaklar</td><td>FIsher</td><td>13-889-335</td><td></td></tr><tr><td>Poligon Karıştırma Çubukları</td><td>FIsher</td><td>14-512-125</td><td>uzunluk: 20 mm</td></tr><tr><td>Synergy Neo2 Hibrit Çok Modlu Okuyucu</td><td>Fisher</td><td>BTNEO2M</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SAS SAS Institute</td><td>9.4</td><td></td></tr></tbody></table>

gıda kaynaklı patojenlerin biyokontrolü için bakteriyofaj etkinliği yüksek verimli ayarlarla değerlendirildi

Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

Bakteriyel patojenler dünya çapında gıda güvenliği sistemlerine sürekli olarak meydan okuyor. Isıya ve dezenfektana dirençli bakterilerin ortaya çıkmasıyla ilgili artan endişelerle, yeni antibakteriyel ajanlara acilen ihtiyaç vardır. Bakteriyofaj tabanlı bir biyokontrol stratejisi, tarımsal ortamlarda bakteriyel patojenleri kontrol etmek için fajların terapötik kullanımıdır. Faj biyokontrolü, gıda kaynaklı patojenlerin arındırılmasında etkili olan sürdürülebilir bir teknoloji olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. Etkili biyokontrol sonuçları sağlamak için, faj kombinasyonlarının gerekli çevresel koşullar altında hedeflenen bakterilere karşı sistematik olarak taranması çok önemlidir. Faj kokteyllerinin antibakteriyel etkinliği faj cins ve kombinasyonundan, hedeflenen bakteri suşlarından, enfeksiyonun çokluğundan, sıcaklık ve zamandan etkilenebilir. Üstün etkili bir faj kokteyli formüle etmek için önerilen yöntem, bireysel fajların ve faj kokteyllerinin gıda kaynaklı bakteriyel patojenleri hedeflenen koşullar altında öldürmedeki etkinliğini sistematik olarak değerlendirmekti. İstenilen sıcaklık ve sürelerde optik yoğunluk ölçülerek bakteriyel öldürme etkinliği izlendi. Üstün faj etkinliği bakteriyel büyümenin tamamen inhibisyonu ile belirlendi. Önerilen yöntem, faj kokteyllerinin üstün antibakteriyel etkinlikle formüle edilerek formüle edilerek formüle edilinin kolaylaştırılması için sağlam, kanıta dayalı bir yaklaşımdır.

Protokolün ardından, anti-O157 faj etkinliğinin çeşitli faj kombinasyonları, sıcaklıklar, zamanlar ve MOI'lerle karşılaştırılması gerçekleştirildi. İnkübasyon sıcaklığı ve zamanlarının etkileri, MBI'ler, fajlar ve anti-E. coli O157 etkinliğinin artırılmasında kullanılan bakteriyel suşlar Tablo 1'de (oran oranı tablosu)9'da sunulmuştur. 0.01'≤ optik bulanıklık ölçümünün yüzdesi (%) her deneysel durum altında her faj preparatı tarafından analiz edildi. Bu analize dayanarak, anti-O157 faj etkinliği 22 °C'de (P &lt; 0.001) ve MOI = 1000'de (P &lt; 0.001) 14, 16 veya 18 saat inkübasyondan sonra en üst düzeye çıkarıldı ve sırasıyla fajla tedavi edilen kültürün büyümesinin% 75'i ve% 89'u tamamen inhibe edildi. Genel olarak, 11 faj preparatı arasında, T1, T4 ve rV5 kokteyli O157'ye karşı en etkili (P &lt; 0.05). Buna ek olarak, inkübasyon sıcaklıkları, zamanları, MBI'ler ve test edilen fajlar arasında, Fajlara duyarlılık değişti, O157 suşları co281-31N gerinim co281-31N ile test edildi en hassas (P &lt; 0.001) ve 3081 (P &lt; 0.001) fajlara karşı en az duyarlı.
Test edilen her bakteriyel suşun faj öldürici kinetiğini anlamak için, OD600 değeri her kuluçka sıcaklığında her örnekleme süresine, MBI'lere ve faj tedavisine karşı çizilmiştir. Fajların 37 °C'de E. coli O157 3081'e karşı etkinliğinin temsili sonuçları Şekil 2'de gösterilmiştir. Fajla tedavi edilen kültürün büyüme eğrisinin inhibisyonunu değerlendirmeden önce fajsız kontrol kültürünün büyüme eğrisinin normal olması sağlanır. Şekil 2'ye göre, T4'ün dahil edilmesi, 37 °C'de bakteri üremesini tamamen inhibe etti, her örnekleme zamanında 1 kadar düşük bir MOI'de. Faki'lerden bağımsız olarak, fayanın çeşitli sıcaklıklarda zaman içinde bakteri üremesini nasıl engellediğine genel bakmak için, tüm MBI'lerden ortalama OD600nm değeri (MOI &gt; 0) her örnekleme süresine ve faj tedavisine göre çizilmiştir (Şekil 3). 37 °C ile karşılaştırıldığında, T4 ve T1 + T4 fajları gibi belirli faj öldürme etkinliği 22 °C'nin üzerinde geliştirilmiştir. Fajlar arasındaki genel anti-O157 etkinliğini özetlemek ve karşılaştırmak için bir başka yaklaşım Tablo 2 ve Tablo 39'da gösterilmiştir. OD600 değeri her örnekleme süresinden ve MOI'den ortalama alındı ve faj etkinliğini en yüksekten (A) en düşük seviyeye (F: 37 °C ve D: 22 °C) derecelendi. Bu tablo en iyi faj tedavisinin tanımlanmasını kolaylaştırır. Örneğin, 3081 suşu için T4 ve T5 + T4 (Panel A) faj T4'te en etkili tedavi olurken, faj T4'e ek olarak T1 + T4, T1 + T4 + rV5 ve 4 faj kokteyli (Panel A) 22 °C'de en etkili tedaviydi.
Bu protokol aynı zamanda faj etkinliğini hedeflenen çeşitli bakteri suşlarıyla karşılaştırmamızı ve faj hazırlamayı özelleştirmemizi sağladı. Örneğin, fajları seçerken, 3081 suşu hariç 37 °C'de, faj T1 + T4 + rV5, faj tiplerine bakılmaksızın diğer tüm suşlara karşı en önemli etkililiğe sahipti. 22 °C'de, 4-faj kokteyl test edilen tüm suşlara karşı en etkili olanıydı. En iyi MSI'ler, deneysel koşullar altında potansiyel üstün etkinliği garanti eden tam liziz (OD600 ≤ 0.01) ile sonuçlandı (Tablo 2 ve Tablo 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg"> Şekil 1: Önerilen 96 kuyu mikro plaka test düzeni. Her fajın seri 10 kat seyreltmeleri, steril 96 kuyulu mikro plakaların Sütun 1-8'inde hazırlanır. Bir bakteri suşuna karşı dört faj, her plakada bitişik sütunlarda, yinelenen olarak test edilebilir. Kalan sütunlar denetimler içindir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg"> Şekil 2: 37 °C'de E. coli O157 suşu 3081 büyüme eğrileri tedavi edilir ve her MBI'de fajlarla tedavi edilmez. Veriler iki bağımsız denemeden derlenmiştir. Çubuklar standart sapma sunar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg"> Şekil 3: E. coli O157 gerinim büyüme eğrileri 3081 suşları. (A) Büyüme eğrileri 37 °C'de. (B) Büyüme eğrileri 22 °C'de. Her eğri, MBI'ler arasında fajlarla muamele edilen ve tedavi olmayan bireysel ve karışık kültürleri temsil eder. Veriler iki bağımsız denemeden derlenmiştir. Çubuklar ortalamanın standart hatasını sunar (reference9'dan izin ayla uyarlanmıştır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: İnkübasyon sıcaklıklarında, kuluçka sürelerinde, MOI'lerde, fajlarda ve E. coli O157 suşlarında (referans9'dan izin alarak uyarlanmıştır) üstün faj etkinliğinin E. coli O157'ye karşı olasılığını karşılaştıran oran oranları <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank">bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 2: 37 °C'de E. coli O157'ye karşı genel faj etkinliği (referans9'dan izin ayla uyarlanmıştır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank"></a>
Tablo 3: 22 °C'de E. coli O157'ye karşı genel faj etkinliği (referans9'dan izin ayla uyarlanmıştır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank"></a>
Tamamlayıcı Şekiller 1-11: Mikro plaka okuyucu işlemi ve prosedürlerinin anlık görüntüleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, bakteriyofaj kokteyllerinin antibakteriyel etkinliğini taramak için yüksek aktarım hızı ayarlarını kullanmak için sağlam bir yöntem açıklar.

Gıda Kaynaklı Patojenlerin Biyokontrolü için Bakteriyofaj Etkinliği Yüksek Verimli Ayarlarla Değerlendirildi

Bacterial pathogens continually challenge food safety systems worldwide. With increasing concerns about the emergence of heat- and sanitizer-resistant ...

Bu kolay gerçekleştirilir protokolü, faj kokteylleri olarak da bilinen çeşitli bakteriyofaj kombinasyonlarının antibakteriyel etkinliğini, yüksek verimli bir ortamda farklı koşullar altında değerlendirir. Tekniğin temel avantajları, bir dizi çevresel koşulda faj etkinliğini etkileyebilecek sıcaklık gibi farklı biyotikleri ve abiyotik faktörleri akışa alma yeteneğidir. Bu yöntem, biyokontrol ve terapötik sonuçları iyileştirmek ve bakteriyel konaklar ile bakteriyofajlar arasındaki etkileşimi belirlemek için uygun faj kokteyllerinin tasarımını kolaylaştırabilir.Başlangıç olarak, çapraz kontaminasyonu önlemek için filtrelenmiş uçları kullanarak mikro plaka testini ayarlayın. İlk olarak, 96 kuyulu mikro plakanın bir ila 12'sine sütunların kuyularına 180 mikrolitre mTSB ekleyin, ardından tahlilleri kurmak için steril 96 kuyu mikro plakalarının bir ila sekizinde her fajın seri on kat seyreltmelerini hazırlayın. Mikro plakanın üst sıra A'sının bir ila sekiz kuyusuna 20 mikrolitre bireysel faj veya faj kokteyli ekleyin.Fajsız ve boş kontrol için, sütunların üst kuyusuna dokuz ila 12 arasında 20 mikrolitre mTSB ekleyin. Pipetleme yaparken, kuyu içeriğini en az beş kez nazik ve tekrarlanan aspirasyonla karıştırın ve seyreltmeler arasında ipuçlarını değiştirin. Son H sırasından 20 mikrolitre çıkarın, ardından seyreltilmiş kültürün iki ila üç mililitresini bir mililitre pipet kullanarak rezervuara aktararak test edilen bakteri suşu için bir rezervuar kurun.Çok kanallı bir pipet kullanarak, her ekleme arasında ipuçlarını değiştirirken sütunlardaki her kuyuya 20 mikrolitre seyreltilmiş bakteri kültürü ekleyin. Mikro plakayı 37 santigrat derecede örtün ve kuluçkaya yatırın. İki saat aralıklarla, mikro plakayı inkübatörden çıkarın ve bir mikro plaka okuyucu kullanarak plakayı okuyun.Alternatif olarak, plakayı bir mikro plaka okuyucusunda kuluçkaya yatırın ve zamanla okuyun. Mikro plaka okuyucu kullanarak 600 nanometredeki optik yoğunluğu incelemek için programı bir mikro plaka okuyucu üzerinde açın. Başlangıç seçenekleri penceresinde Basit Mod'u seçin ve ardından Görev Yöneticisi'nde Yeni Bir Protokol Oluştur'u seçin.Plaka Türünü Seç penceresinden, açılan listeden 96 kuyu plakasını seçin. Algılama yöntemi olarak, okuma türü için Absorbance'ı seçin, optik türü için Uç Nokta/Kinetik seçeneğini belirleyin, Monokromatörler'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Okuma Adımı için dalga boyları için 600 nanometre girin, okuma hızı için Normal'i seçin ve test için sıcaklığı ayarlamak OK.To tıklayın, Kuluçka onay kutusunu tıklatın ve İnkübatör Açık'ı seçin.Sıcaklık kutusuna istediğiniz sıcaklığı girin ve tamam'ı tıklatın. 37 santigrat derece inkübasyon sıcaklığı için bir sonraki adımla devam etmeden önce Ön Isıt onay kutusunu tıklatın, ancak 22 santigrat derecedeki test koşulları için seçenek gerekli değildir. Kuluçka sırasında plaka kapağındaki yoğuşmayı önlemek için, degrade kutusuna bir değer girerek sıcaklık gradyanını ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, kinetik kurulumu açmak için Kinetik onay kutusunu tıklatın.Çalışma Süresini 37 santigrat derece inkübasyon için 10 saat veya oda sıcaklığı için 22 saat olarak ayarlayın ve okuma aralığı olarak iki saat girin, ardından Tamam'a tıklayın. Her kinetik okuma için gerekirse, sallama koşulu ayarlamak için yordam penceresindeki Salla onay kutusunu tıklatın. Sallama Modu olarak Doğrusal'ı seçin ve Süreyi 30 saniye olarak değiştirin. Doğrusal Frekans değerini dakikada 731 döngüye ayarlayın ve protokol özeti diyaloğu penceresinin OK.In tıklatın, Plaka Düzeni'ne tıklayın, Boşluklar, Test Kontrolleri ve Örnekler'i seçin ve İleri'yi tıklatın.Her kuyu türünün ayarlarını tanımladıktan sonra Son'a tıklayın. Sol taraftaki arayüzde bir kuyu kimliği seçin, Plaka Düzeni penceresinde gösterilen matrise atayın ve Tamam'a tıklayın. Okuma Plakası düğmesine tıklayın, protokolü bir prt dosyası olarak kaydedin ve Kaydet'e tıklayın. Plakayı takın ve Tamam'ı tıklatın. Deneme tamamlandıktan sonra, denemeyi xpt dosyası olarak kaydedin ve Kaydet'e tıklayın.Daha fazla çözümleme için ileti penceresi kutusundaki Evet düğmesini tıklatarak verileri Excel'e verin. Evet/Hayır Kaydet seçimine tıklayın ve tercihi kaydetmek için bir daha sorma onay kutusunu tıklatın. Protokolün ardından, faj etkinliğinin çeşitli faj kombinasyonları, sıcaklıklar, zamanlar ve enfeksiyonların çokluğu veya MBI'ler ile karşılaştırılması gerçekleştirildi.Bu analize dayanarak, anti-O157 faj etkinliği 22 santigrat derecede 14, 16 veya 18 saatlik inkübasyondan sonra en üst düzeye çıkarıldı. Bakterilerin faj öldürme kinetiğini anlamak için, 600 nanometredeki OD değerleri örnekleme süresi, MBI'ler ve faj tedavisine karşı çizildi. Tedavi edilen 37 santigrat derecedeki temsili bakteri üreme eğrileri gösterilmiştir.T4, düşük MOI'de bile her örnekleme zamanında bakteri üremesini tamamen engelledi. Faj inhibe bakteri üremesini analiz etmek için, tüm MOI'lerden ortalama OD değerleri her örnekleme süresine ve faj tedavisine karşı çizildi. İki sıcaklıkta temsili grafikler, örneğin T1 artı T4 için faj öldürme etkinliğinin 37 santigrat dereceye kıyasla 22 santigrat derecede artırıldığını ortaya koydu.Genel faj etkinliğinin karşılaştırılması, en iyi faz tedavisinin tanımlanmasını kolaylaştıran gösterilmiştir. Örneğin, Escherichia coli strain 3081 için, T4 ve T5 plus T4 fajları ile tedavi 37 santigrat derecede en etkili tedaviydi. Bununla birlikte, 22 santigrat derecede, T4'e ek olarak, faj T1 artı T4, T1 artı T4 artı rV5 ve dört faj kokteyli etkili oldu.Bu prosedürü gerçekleştirirken, özellikle çok kanallı pipet kullanırken son derece doğru pipetleme ve yaklaşımın homojenliği karşılaştırılabilir ve yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Taramada en etkili kokteylin daha fazla performansını değerlendirmek için takip deneyleri gereklidir, bu da geniş bir et suyu kültür sisteminde ve diğer biyolojik matrislerde antifaj mutantlarının ortaya çıkmasını önler.

bacteriophage-effectiveness-for-biocontrol-foodborne-pathogens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Niu, Y. D., ve ark. Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings. J. Vis. Exp. (2021)Bu video, E.coli bakteri kültürlerine karşı faj kokteyllerinin litik aktivitesini değerlendirmek için mikroplaka tabanlı bir analizi göstermektedir. Optik yoğunluktaki değişikliklerin, faj gücünü ve bakterilerin tamamen inhibe edilmesi için gereken konsantrasyonu nasıl ortaya çıkardığını...

Optik Yoğunluk Ölçümleri Kullanılarak Faj Aracılı Bakteriyel Büyüme İnhibisyonunun Değerlendirilmesi

Bir yöntem olup, aynı anda antijenlere karşı yüz Faj gösterimli birleştirici sentetik antikor kütüphanelerinden, ölçeklenebilir, yüksek verimli seçimleri yürütmek için görsel eşliğinde tarif edilmektedir. Bu paralel yaklaşımı kullanarak, standart bağışıklık tahlillerinde işlevsel çeşitli antijenler için yüksek bir çekim ve özelliğe gösteren antikor fragmanları izole ettik.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

Burada, varsayılan faj genlerinin fonksiyonel karakterizasyonu için fenomik yaklaşımlar sunuyoruz. Teknikler, katabolik metabolizmaya etkileri ölçebilen yerleşik metabolomik yöntemine ek olarak, konakçı anabolik metabolizmayı izleyebilen gelişmiş bir tahlil, Çoklu Fenotip Test Plakaları (MAP'ler) içerir.

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Diğer bakterilere karşı inhibe edici bileşiklerin üretimi için bakteri kültürlerini taramak için basit bir yöntem açıklıyoruz.

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

T7 bakteriyofaj numaralandırmak için bir tekrarlanabilir, doğru ve zamanı verimli kantitatif PCR (qPCR) yöntemi burada açıklanmıştır. Protokol açıkça fajının genomik DNA hazırlık, PCR reaksiyon hazırlama, qPCR Bisiklet koşullarını ve qPCR veri analizi açıklar.

T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR

Bu protokol, kehanetlerin konakçıları üzerindeki etkisinin ortaya çıkmasını sağlar. Bakteri kültürleri, lizojenik durumu en iyi destekleyen ve spontan indüksiyonu sınırlayan koşullar kullanılarak senkronize edilir. RT-qPCR, kehanet kısıtlı genleri ve faj kontrolünden ayrılmamış genleri, litik replikasyon döngüsü sırasında eksprese edilenlerden kesin olarak ayırır.

Ilıman Bakteriyofajların Lizojenleri Üzerindeki Etkisini Transkriptomik Yoluyla Anlamak

Aktinomisetler ve diğer yavaş büyüyen bakteriler için uygun olan bakteriyofajların varlığında uzun süreli bakteri büyümesini ölçmek için optik yoğunluğa dayalı bir mikroplaka yöntemi tanımlanmıştır. Bu yöntem, buharlaşmayı ve kapak yoğuşmasını azaltmak için modifikasyonlar ve eğrinin altındaki alan, büyüme maksimumu ve göreceli virülans dahil olmak üzere virüs enfeksiyonu ölçümlerini hesaplamak için R kodunu içerir.

Aktinobakteriyofaj enfeksiyonunu karakterize etmek için uyarlanmış optik yoğunluk tabanlı mikroplaka testi

Bakterileri enfekte eden virüsler olan bakteriyofajlar (fajlar), bağırsak mikrobiyomunun ayrılmaz bir bileşenidir. Bu simbiyotik sakinler bakteriyel zindeliği ve popülasyon dinamiklerini yönlendirse de, bağırsak homeostazını ve hastalığını nasıl etkiledikleri hakkında çok az şey anlaşılmıştır. Bu protokol, diğer faj-bakteri çiftlerine uyarlanabilen bir fare modeli içinde izole edilmiş T4 fajlarını inceler.

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Yeryüzünde her yerde bulunan ve çeşitli olan bakteriyofajlar, bakteri konakçıları içinde enfekte eder ve çoğalır, mikrobiyal ekosistemlerde çok önemli bir rol oynar. Önemlerine rağmen, varlıkları endüstriyel süreçleri bozabilir. Salmonella kültürlerinden bakteriyofajları ortadan kaldırmak için bakteriyel lipopolisakkaritleri kullanan bir yöntem geliştirdik.

Enfekte Salmonella Kültürlerinden Bakteriyofaj Giderimi

Burada, siyanofajları (ve konakçılarını) izole etmek için deniz ve tatlı su ekosistemlerinin öfotik bölgelerinden örnekleme yöntemlerini ve tek genotipleri zenginleştiren ve virüs-konak etkileşim dinamiklerini karakterize eden örnekleme sonrası süreçleri açıklıyoruz.

Fotosentetik Mikropların ve Virüslerinin Çevresel Örneklemesi: Tarladan Laboratuvara

Öğrenin, yüksek verimli ayarlarla bakteriyofaj kokteyllerinin antibakteriyel etkinliğini değerlendirmeyi. Bu yöntem, gıda kaynaklı patojenlerin biyokontrolü için optimize tedaviler tasarlamaya yardımcı olur.

Gıda Kaynaklı Patojenlerin Biyokontrolü için Bakteriyofaj Etkinliği Yüksek Verimli Ayarlarla Değerlendirildi

Daha fazla video keşfet