Zebrafish Gastrula'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Derin ve Mekansal Kontrollü Hacim Ablasyonları
15 Temmuz 2021
Embriyonik gelişim, hücre hareketinin büyük ölçekli koordinasyonunu gerektirir. İki fotonlu ekscitasyon aracılı lazer ablasyon, büyük derin hücre gruplarının mekansal olarak kontrol edilen 3 boyutlu ablasyonunu sağlar. Ek olarak, bu teknik , in vivo olarak toplu olarak göç eden hücrelerin mekanik ortamlarındaki pertürbasyonlara reaksiyonlarını araştırabilir.
Embriyolar içinde hücreler birbirleriyle etkileşime girerek kimyasal ve mekanik bilgi alışverişinde bulunurlar. Bu etkileşimleri kontrol etmenin etkili bir yolu, bazı hücreleri öldürmek ve komşu hücreler üzerindeki sonuçları izlemektir. Tarif ettiğimiz yöntem, komşu dokulara zarar vermeden embriyo içinde bile hücreleri doğru bir şekilde alevlendirmemizi sağlar.
İlk lazeri ablasyon dalga boyu 820 nanometreye, ikinci lazeri de mCherry görüntüleme dalga boyu 1.160 nanometreye ayarlayarak iki foton mikroskobu hazırlayın. Optik yolda hareketli aynalar kullanarak, tarama kafaları giriş ve çıkışındaki iki lazer ışınını hizalayın, ardından ilk lazerin maksimum gücünü 820 nanometrede ölçün. Güç ölçeri hedefin altına yerleştirin, siyah odayı kapatın ve ilk lazer gücünü %100'e ayarlayın Güç ölçerde veri toplamayı başlatın, lazer deklanşörini açın, ardından çıkış gücünü ölçün ve 300 miliwatt'a ulaşmak için gereken lazer gücünün yüzdesini hesaplanın.
İlk lazeri 920 nanometre GFP heyecan dalga boyunu ve gücü %7 olarak ayarlayın İkinci lazer gücünü %15'e ayarlayın Pmt dedektörlerini yeşil ve kırmızı çizgiler için etkinleştirin ve yeşil ve kırmızı çizgi PMT hassasiyetini 65 olarak ayarlayın. Görüş alanını 400 x 400 mikrometreye, görüntü çözünürlüğünü 512 x 512 piksele ve tarama frekansını 800 hertz'ye ayarlayın. 3D zaman atlamalı görüntüleme modunu seçin, ardından bir klasör oluşturun ve her alımdan sonra verileri kaydetmek için Otomatik Kaydet'i etkinleştirin.
Isıtma odasını monte edin ve 28 santigrat dereceye ayarlayın. Odanın ve hedefin ısınması için en az 10 dakika bekleyin. Floresan stereomikroskop altında, embriyoları GFP'yi ifade eden %70 epiboly olarak tanımlayın.
Plastik bir Pasteur pipet kullanarak, agarose kaplı tabakta üç ila dört seçilmiş embriyoyu aktarın ve ince önlüklerle dikkatlice kaynatın. Küçük bir cam şişeye, %2 agarose içeren penisilin-streptomisilin embriyo ortamı çözeltisinin mililitresini ekleyin ve şişeyi 42 santigrat derecede önceden ısıtılmış, kuru blok ısıtıcıya yerleştirin. Ateş cilalı bir cam pipet kullanarak, agarose'a çok fazla embriyo ortamı eklememeye dikkat ederek, kafeinsiz bir embriyoyu şişeye aktarın.
Kalan embriyo ortamını pipetten atın. Embriyoyu, cam alt kabın kaydıramasını örtecek kadar agarose ile birlikte geripirat. Agarose'yi embriyo ile yemeğin cam kaydırağı üzerine üfleyin, embriyonun havaya veya yemeğin plastik tarafına dokunmamasını sağlayın.
Ardından, cam kaydırağın etrafındaki odayı agarose ile doldurun. Kirpik kullanarak embriyoyu hedeflenen bölgenin en üstünde olacak şekilde yönlendirin. Beş dakika sonra, agarose tamamen ayarlandığında, cam kaydırağa birkaç damla penisilin-streptomisin embriyo ortamı ekleyin.
Cam alt kabı ısıtılmış hazneye hedefin altına yerleştirin. Odayı kapatmadan önce hedefi penisilin-streptomisinin embriyo ortamına daldır. Işık yolunu oküler olarak ayarlamak için kaydırıcıyı hareket ettinin.
Floresan lambayı açın. Bir embriyo bulun ve odağı yüzeyine ayarlayın. Floresan lambayı kapatın ve siyah odayı kapatmadan önce ışık yolunu PMT'lere ayarlayın.
Canlı görüntülemeye başlayın ve eksenel mezodermi bulun. İyi bir sinyale sahip olmak için lazer güçlerini ayarlayın. Aşamayı embriyonun en üstüne taşımak için kırmızı kanalı kullanın ve bu pozisyonu Z sıfıra eşit olarak atayın.
Bir dakikalık bir zaman adımı ve iki mikrometreden oluşan bir Z adımı seçin. İlk dilimi eksenel mezodermden 15 mikrometre, son dilimi ise eksenel mezoderm'in 15 mikrometre altına ayarlayın. Bir ablasyon öncesi filmin 10 ila 15 dakikasını kaydedin.
Canlı görüntülemede, polster konturunun yerini tespit edin, ardından, ilgi çekici elektro-optik modülatör bölgesini veya EOM-ROI aracını kullanarak, polster'ın genişliğini kapsayan 20 piksel genişliğinde bir dikdörtgen çizin ve dikdörtgeni polster'ın ortasına yerleştirin. Tütsülenecek en yüksek ve en düşük düzlemlerin eksenel konumuna dikkat edin, yatırım getirisinin düzlemlerin hiçbirinde yumurta sarısı hücresiyle çakışmamasını sağlayın. Sahneyi ablatlanacak en düşük Z konumuna getirin.
İlk lazer dalga boyunun 820 nanometreye ayarla ve 300 miliwatt çıkış gücü elde etmek için daha önce hesaplandıkça güç yüzdesini girin. Görüntüleme frekansını 200 hertz ve ilk lazer görüntüleme EOM'yi sıfıra ayarlayın. Yatırım getirisi tedavi modunu seçtikten sonra, EOM'yi kapatın ve tedaviyi sıfır kareden hemen sonra başlayacak şekilde ayarlayın.
Görüntüleme modunu Timelapse'e getirin ve Otomatik Kaydetme'yi devre dışı bırakın. Zaman adımında Hızlı modu seçtikten sonra, tedavi çerçevelerinin sayısını ve kare sayısını hedeflenen derinliğe karşılık gelen değere ayarlayın. Görüntülemeye başlayın.
EOM tedavisi sırasında PMT deklanşörü kapanacağından satın alma siyah olmalıdır. Ardından, sahneyi bir sonraki Z konumuna getirin ve benzer şekilde ablasyon gerçekleştirin. Polster'ın tepesine ulaşılana kadar her Z pozisyonunda tekrarlayın.
Ablasyon işlemi tamamlandığında, ilk lazeri 920 nanometreye ayarlayın ve daha önce seçilen görüntüleme gücüne ayarlayın. İlk lazer görüntüleme EOM'yi 100'e getirin ve Tam alan modunu tercih edin. Görüntüleme sıklığı 800 hertz olmalı ve her düzlemin ablatlanıp ablatlanmadığını kontrol etmek için tüm yığını canlı modda incelemeden önce EOM kapatılmalıdır.
Ablasyon onaylandıktan sonra, görüntüleme modu olarak 3B Zaman atlamalı'yı seçin. Otomatik Kaydetme'yi yeniden etkinleştirin ve 40 ila 60 dakika boyunca ablasyon sonrası filmi kaydetmeye başlayın. Ablasyon sonrası filmde, hedeflenen hücrelerin etkili bir şekilde ablatlanıp ablatlanmadığını kontrol edin.
Polsterler boyunca ablasyonlar embriyolara zarar vermemelidir, ablated embriyoların normal morfolojisi döllenme sonrası 24 saate kadar gözlenebilir. Lazer ablasyonların başarılı sonuçlarında, üst üste binen dokular alttaki yapıların ablasyonundan etkilenmedi. Çok yoğun bir tedavi veya çok az tedavi, lazer ablasyonda başarısızlıklara neden oldu.
Başarısız ablasyon örneği, polster'ın üzerindeki hücrelerin, polsterin üzerindeki odak düzleminde otoflüoresan döküntülerle belirgin olan ablated olduğunu göstermektedir. Başka bir etkisiz girişimde, hücreler ağartıldı, ancak ablated değildi ve düşük floresan sinyalleri hala sağlam hücre hatlarını ortaya koyuyor. Son olarak, yetersiz lazer tedavisi nedeniyle bazı hücreler ağartılmış bile değildi.
Kabarcıkların oluşumu, çok yoğun bir lazer tedavisinin neden olduğu kavitasyondan kaynaklanmaktadır. Z yığınları, hem sitoplazmik GFP hem de nükleer mCherry sinyallerini kaydeden başarılı bir ablasyonda 40 dakika boyunca her dakika yakalandı. Ek olarak, polster'ın ön yarısına ait çekirdekler bir macenta noktası ile işaretlenir ve zamanla, ablasyondan önce ve sonra izlenir.
Göç kalıcılığının bir ölçüsü olarak, ablasyon öncesi ve sonrası hücrelerin yön otomatik korelasyonu çalışılmıştır. Polster'ın ön kısmına ait hücreler, ablasyondan önce kalıcı bir hareket gösterdi, bu da ablasyondan sonra büyük ölçüde azalır ve bu da kolektif yönelimli göç kaybını gösterir. Lazerlerin düzgün bir şekilde hizalaması ve lazer gücünün ölçülmesi, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir.
Ayrıca, ablasyon sonrası ilk görüntülerde ablasyon verimliliğini kontrol etmek de önemlidir. Embriyo içindeki hücrelerin göç etmesine rehberlik eden hücre-hücre etkileşimlerinin rolünü sorgulamak için lazer ablasyonları kullanıyoruz. Ancak prosedür, hücrelerin veya dokuların organizmanın derinliklerinde tam olarak ablatılması gereken diğer birçok soruya kolayca uyarlanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, embriyonik gelişim sırasında hücre etkileşimlerini araştırmak için iki-foton eksitasyonu aracılı lazer ablasyonun kullanımını inceler. Belirli hücreleri ablasyon ile yok ederek, araştırmacılar komşu hücreler üzerindeki etkileri gözlemleyebilir ve bunun sonucunda kolektif hücre göçü ve mekanik etkileşimler hakkında bilgiler elde eder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Embriyonik Gelişim
Arka Plan
- Embriyolar içindeki hücreler, kimyasal ve mekanik sinyallerle iletişim kurar.
- Ablasyon teknikleri, hücre ölümünün etkilerini gözlemleyerek bu etkileşimleri incelemeye yardımcı olabilir.
- İki-foton mikroskobu, çevre dokuları zarar vermeden hücreleri hassas bir şekilde hedeflemeye izin verir.
- Bu yöntem, canlı ortamda hücre dinamikleri hakkındaki anlayışımızı artırır.
Çalışmanın Amacı
- Embriyonik ortamlarda hücre ablasyonunun komşu hücreler üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Kollektif göç eden hücrelerin mekanik tepkilerini değerlendirmek.
- Mekansal olarak kontrollü hücre ablasyonu tekniklerini geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Ablasyon ve görüntüleme için özel lazer dalga boylarına sahip bir iki-foton mikroskopunun hazırlanması.
- Hareketli aynalar kullanılarak lazer ışınlarının hizalanması.
- Etkili ablasyonu sağlamak için lazer gücünün ölçülmesi.
- Ablasyonun hücre davranışı üzerindeki etkilerini analiz etmek için veri toplama.
Ana Sonuçlar
- Hedeflenen hücrelerin bitişik dokulara zarar vermeden başarılı bir şekilde ablasyonu.
- Ablasyon sonrası komşu hücrelerde değişen davranışların gözlemlenmesi.
- Hücre göçünü yönlendiren mekanik etkileşimlere dair bilgiler.
- Gelişimsel biyolojide iki-foton lazer ablasyonunun etkinliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- İki-foton lazer ablasyonu, embriyolardaki hücre etkileşimlerini incelemek için değerli bir araçtır.
- Teknik, kolektif hücre dinamiklerinin detaylı gözlemlenmesine izin verir.
- Bulgular, embriyonik gelişim süreçlerinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Precise spatial control in cellular ablation enables mechanistic interrogation of tissue-level processes in complex biological systems. This approach supports target validation by isolating specific cellular contributions to morphogenetic movements, reducing ambiguity in pathway interpretation. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking subcellular perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selectively ablating defined cell populations to assess functional consequences.
- Operational Value: Provides spatially controlled perturbation to clarify causal relationships in cellular interactions without confounding damage to adjacent tissues.
- Translational Value: Supports mechanistic de-risking by validating target roles in developmental processes relevant to congenital disorders or regenerative medicine.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducible readouts of cellular behavior changes post-ablation, enabling assay standardization.
- Operational Value: Facilitates preparation of validated biological systems for compound screening by establishing baseline dynamic responses to targeted perturbations.
- Scalability Value: Adaptable across scales (microns to >100 microns) and developmental stages, supporting reuse in diverse assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent perturbation strategies in disease-relevant zebrafish models.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing clear phenotypic readouts following target modulation.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by demonstrating that ablation of specific tissues recapitulates expected migratory or signaling defects.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven ablation to validate targets before lead identification, with outputs informing go/no-go decisions based on phenotypic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating axial mesendoderm function in gastrulation models.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, quantifiable ablation parameters and reproducible cellular response tracking.
- Analytics: Provides directional persistence and migration tracking readouts that allow comparative analysis of cellular behavior pre- and post-perturbation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use in transgenic zebrafish lines expressing GFP and mCherry, enabling longitudinal imaging.
- Enterprise Reuse: Framed as a reusable capability for deep tissue ablation across cell types and scales, not limited to a single experimental endpoint.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through spatially resolved ablation that isolates mechanistic contributors to collective cell migration.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser power calibration, EOM-ROI targeting, and Z-stack validation across ablation depths.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false positives in target validation through direct functional interrogation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking ablation phenotypes to developmental defects with translational relevance.
Implementation Considerations
- Required expertise in two-photon microscopy alignment, laser power calibration, and EOM-ROI configuration for precise ablation targeting.
- Instrumentation needs include tunable lasers (820 nm ablation, 920 nm and 1,160 nm imaging), PMT detectors, and stage control for Z-stack acquisition.
- Cross-team standardization requires shared protocols for laser power measurement (300 mW exit power), imaging frequency settings (200 Hz ablation, 800 Hz imaging), and ROI dimensions (20-pixel rectangle).
- Adaptation considerations include adjusting ablation depth, laser power percentage, and Z-step size for different tissue types, developmental stages, or target volumes.
- Practical limitations include dependence on precise laser alignment and power measurement to avoid off-target effects such as bleaching, cavitation bubbles, or incomplete ablation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Preparation of the Two-photon Microscope
2:19
Mounting the Embryo
3:46
Locating the Embryo and Pre-Ablation Imaging
4:53
Target Location, Laser Ablation and Post-ablation Verification
7:20
Results: Analysis of the Zebrafish Embryo Before and Post Ablation
9:07
Conclusion
