Name: Optogenetik TAEL/C120 Sistemini Kullanan Zebra Balığı Embriyolarında Işık Kaynaklı GFP İfadesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Keşfedin, optogenetik TAEL/C120 sistemiyle zebra balığı embriyolarında ışık kaynaklı GFP ifadesini. Bu yöntem, gen fonksiyonlarını in vivo çalışmak için uzamsal ve zamansal kontrol sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Stefan Materna'ya ve Woo ve Materna laboratuvarlarının üyelerine bu protokolle ilgili yararlı öneriler ve yorumlar için teşekkür ederiz. Anna Reade, Kevin Gardner ve Laura Motta-Mena'ya bu protokolü geliştirirken değerli tartışmalar ve içgörüler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (NIH; R03 DK106358) ve Kaliforniya Üniversitesi Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi (CRN-20-636896) 'a S.W.

Bu çalışma Kaliforniya Merced Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) onayı ile gerçek gerçekleştirildi.
1. Zebra balığı geçişi ve embriyo toplama
<ol><li>Sahte aktivasyonu en aza indirmek için TAEL transkripsiyonel aktivatör veya C120 kontrollü muhabir geni içeren ayrı transgenik zebra balığı hatlarını koruyun.</li>
	<li>Hem TAEL hem de C120 bileşenlerini içeren çift transgenik embriyo üretmek için standart yöntemler9 kullanarak her hattan 6-8 yetişkin zebra balığını çaprazlama (Şekil 1B). NOT: Alternatif olarak, her iki bileşen de standart yöntemler kullanılarak mRNA veya plazmid DNA'nın mikroenjeksiyon yoluyla geçici olarak ifade edilebilir10.</li>
	<li>Yumurta suyu (damıtılmış suda çözünmüş 60 μg/mL Instant Ocean deniz tuzu) içeren Petri kaplarında, test edilecek durum başına yaklaşık 30 embriyo ile embriyoları toplayın.</li>
	<li>Ortam ışığının istenmeyen aktivasyonunu en aza indirmek için bulaşıkları ışık geçirmez bir kutuya yerleştirin veya alüminyum folyo ile örtün (bkz. Tablo 1).</li>
</ol>2. Küresel ışık indüksiyonu
<ol><li>Aynı anda birkaç embriyoya aktif mavi ışık vermek için mavi ışık (465 nm) LED panel kullanın.</li>
	<li>LED paneli embriyo içeren Petri kaplarına göre konumlandırın, böylece embriyolar tarafından alınan ışığın gerçek gücü, bir ışık gücü ve enerji ölçer ile ölçülen yaklaşık1,5 mW / cm 2 olacaktır (Şekil 2A).</li>
	<li>TAEL transkripsiyonel aktivatör5,8'e fotodamage riskini azaltmak için 3 saatten fazla aydınlatıyorsa, ışığı bir zamanlayıcı rölesi kullanarak 1 saataçık/1saat kapalı aralıklarla darbeler. NOT: Aydınlatma süresinin belirli uygulamalar için optimize edilmesi gerekebilir. Bu protokolde 30 dk, 1 saat, 3 saat ve 6 saat aydınlatma süresi örnekleri verilmiştir.</li>
	<li>Yoğuşmadaki hafif saçılmaları en aza indirmek için Petri kabı kapaklarını çıkarın.</li>
	<li>Kontrol embriyoları içeren Petri kaplarını ışık geçirmez bir kutuya yerleştirin veya koyu kontroller için alüminyum folyo ile örtün.</li>
</ol>3. qRT-PCR ile indüksiyonun nicel değerlendirmesi
<ol><li>İstenilen aktivasyon süresinden sonra embriyoları aydınlatmadan çıkarın.</li>
	<li>Kitin talimatlarını takip eden bir RNA izolasyon kiti kullanarak 30-50 ışıkla aktive edilmiş ve 30-50 koyu embriyodan toplam RNA çıkarın.<ol>
<li>Embriyoları 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve fazla yumurta suyunu çıkarın. Lizis tamponu ekleyin ve embriyoları plastik bir pestle homojenize edin.</li>
		<li>Lisat'ı kit tarafından sağlanan bir sütuna aktarın ve kitin talimatlarına devam edin. Hemen 3.3 adımına geçin veya saflaştırılmış RNA'yı -20 °C ila -80 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kitin talimatlarını takip eden bir cDNA sentez kiti kullanarak cDNA sentezi için 1 μg toplam RNA kullanın.<ol>
<li>İnce duvarlı 0,2 mL PCR tüpü alın, 4 μL 5x cDNA reaksiyon ana karışımına (optimize edilmiş tampon, oligo-dT ve rastgele astarlar ve dNTP'ler içeren), 1 μL 20x ters transkriptaz çözeltisi ve toplam 20 μL hacme çekirdeksiz su ekleyin.</li>
		<li>Tüpü aşağıdaki gibi programlanmış bir termosiklete yerleştirin: 10 dakika için 22 °C, 30 dakika için 42 °C, 5 dakika için 85 °C ve ardından 4 °C'de tutun. Hemen 3.4 adımına geçin veya cDNA'yı -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SYBR yeşil enzim ana karışımı, 5 kat seyreltilmiş cDNA (adım 3.3) ve GFP için her astarın 325 nM'si içeren qPCR reaksiyonları hazırlayın. NOT: Bu protokolde kullanılan primerler aşağıdaki gibi. GFP ileri: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP ters: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a ileri 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a ters: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').</li>
	<li>QPCR reaksiyonlarını gerçek zamanlı bir PCR makinesinde gerçekleştirin. NOT: PCR programı: 10 dakika boyunca 95 °C'de ilk aktivasyon, ardından 95 °C'de 30 sn 40 döngü, 60 °C'de 30 sn ve 72 °C'de 1 dk.</li>
	<li>Reaksiyon özgüllüğünü belirlemek için PCR tamamlandığında bir eriyik eğrisi analizi gerçekleştirin. Her örnek için üç teknik çoğaltma gerçekleştirin.</li>
	<li>Işıkla aktive indüksiyonu, 2-ΔΔCt yöntemi11kullanılarak karanlıkta tutulan embriyolara göre kat değişimi olarak hesaplayın. İstatistiksel önemi bir istatistik yazılım paketi ile belirlenebilir.</li>
</ol>4. Floresan mikroskopi ile indüksiyonun nitel değerlendirilmesi
<ol><li>İstenilen aktivasyon süresinden sonra embriyoları aydınlatmadan çıkarın.</li>
	<li>Cam çökelti slaytlarında %0.01 trikain içeren %3 metilselülozda görüntüleme için embriyoları hareketsiz hale verin.</li>
	<li>Standart GFP filtre ayarlarını kullanarak dijital kameraya bağlı floresan stereomikroskopta floresan ve parlak alan görüntüleri elde edin. Tüm örnekler için aynı görüntü alma ayarlarını kullanın.</li>
	<li>Satın alma işleminden sonra brightfield ve floresan görüntüleri görüntü işleme yazılımıyla birleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).</li>
<li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL%3A+a+zebrafish-optimized+optogenetic+gene+expression+system+with+fine+spatial+and+temporal+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control.</a> Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).</li>
<li>LaBelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL+2.0%3A+An+improved+optogenetic+expression+system+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish.</a> Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).</li>
<li>Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+natural+and+artificial+DNA+substrates+for+light-activated+LOV-HTH+transcription+factor+EL222%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222.</a> Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).</li>
<li>Holder, N., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+into+the+Fertilized+Zebrafish+Egg+for+Analysis+of+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Embryology%22%5BJournal%5D)">Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function.</a> Molecular Embryology. , 487-490 (1999).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li>
<li>Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cell+ablation+in+zebrafish+using+optogenetic+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control.</a> Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).</li>
<li>Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+transcription+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of transcription in zebrafish.</a> PloS One. 7 (11), 50738(2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan edildi.

Bu protokol, mavi ışık indüklüze gen ekspresyasyonu elde etmek için optogenetik TAEL/C120 sisteminin kullanımını açıklar. Bu sistem, mavi ışıkla aydınlatıldıktan sonra küçülen ve bir C120 düzenleyici elemanının aşağı akışa giren bir ilgi geninin transkripsiyonunu etkinleştiren transkripsiyonel bir aktivatör olan TAEL'den oluşur. Bir GFP muhabirinin indüklenmiş ifadesi, 30 dakika kadar kısa bir ışık maruziyeti sonrasında tespit edilebilir, bu da bu yaklaşımın nispeten hızlı ve duyarlı kinetiklere sahip olduğunu düşündürme...

İndükleyici gen ekspresyon sistemleri gen ekspresyonunun miktarını, zamanlamasını ve yerini kontrol etmeye yardımcıdır. Bununla birlikte, çok hücreli organizmalarda tam olarak mekansal ve zamansal kontrole ulaşmak zor olmuştur. Zamansal kontrol en yaygın olarak küçük moleküllü bileşikler1 veya ısı şoku organizatörlerinin aktivasyonu ile elde edilir2. Yine de, her iki yaklaşım da zamanlama, indüksiyon gücü ve hedef dışı stres yanıtları sorunlarına karşı savunmasızdır. Mekansal kontrol esas olarak dokuya özgü promotörlerin kullanılmasıyla elde edilir3, ancak bu yaklaşım her zaman mevcut olmayan uygun bir promotör veya düzenleyici eleman gerektirir ve alt doku seviyesi indüksiyonu için elverişli değildir.
Bu tür geleneksel yaklaşımların aksine, ışıkla aktive edilmiş optogenetik transkripsiyonel aktivatörler gen ekspresyonunun daha ince uzamsal ve zamansal kontrolü potansiyeline sahiptir4. Mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemi zebra balığı embriyolarında kullanılmak üzere geliştirilmiş ve optimize edilmiştir5,6. Bu sistem, E. litoralis7,8bakterisinden endojen ışıkla aktive edilmiş bir transkripsiyon faktörüne dayanmaktadır. TAEL/C120 sistemi, Kal-TA4 transaktivasyon etki alanı, mavi ışığa duyarlı LOV (ışık-oksijen-voltaj algılama) etki alanı ve sarmal dönüş sarmal (HTH) DNA bağlayıcı etki alanı5içeren TAEL adlı transkripsiyonel bir aktivatörden oluşur. Aydınlatıldığında, LOV etki alanları, iki TAEL molekülünün küçültmesine, TAEL duyarlı bir C120 promotörüne bağlanmasına ve ilgi çekici bir aşağı akış geninin transkripsiyonunu başlatmasına izin veren konformasyonel bir değişikliğe uğrar5,8. TAEL/C120 sistemi minimum toksisite ile hızlı ve sağlam indüksiyon sergiler ve birkaç farklı ışık dağıtım yöntemi ile etkinleştirilebilir. Son zamanlarda, TAEL/C120 sisteminde iyileştirmeler, TAEL'e (TAEL-N) nükleer bir yerelleştirme sinyali eklenerek ve C120 düzenleyici elemanı bir cFos bazal promotörüne (C120F) kaptırarak yapılmıştır (Şekil 1A). Bu değişiklikler indüksiyon seviyelerini 15 kattan fazla artırdı6.
Bu protokolde, TAEL/C120 sistemini etkinleştirmek ve bir muhabir geni olan GFP'nin her yerde ifadesini teşvik etmek için basit bir LED panel kullanılır. Ekspresyon indüksiyonu, floresan yoğunluğu gözlemlenerek veya nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) kullanılarak transkript seviyeleri ölçülerek nitel olarak izlenebilir. Bu protokol, TAEL/C120 sistemini, genekspresyonunun in vivo olarak sağlam bir şekilde düzenlenmesini sağlayan çok yönlü, kullanımı kolay bir araç olarak gösterecektir.

<table><tbody><tr><td>BioRender web tabanlı bilim illüstrasyon aracı</td><td>BioRender</td><td></td><td>https://biorender.com/</td></tr> <tr><td>Renkli CCD dijital kamera</td><td>Lumenara</td><td>755-107</td><td></td></tr><tr><td>Kompakt Güç ve Enerji Ölçer Konsolu, Dijital 4" LCD</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Uyarma filtresi, 545 nm</td><td>Olympus</td><td>ET545/25x</td><td></td></tr><tr><td>illustra RNAspin Mini kiti</td><td>GE Sağlık</td><td>95017-491</td><td></td></tr><tr><td>Anında Okyanus Deniz Tuzu</td><td>Anında Okyanus</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>MARS AQUA Kısılabilir 165 W LED Akvaryum ışığı (mavi ve beyaz)</td><td>Amazon</td><td>B017GWDF7E</td><td></td></tr><tr><td>Metilselüloz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7140</td><td></td></tr><tr><td>NEARPOW Programlanabilir dijital zamanlayıcı anahtarı</td><td>Amazon</td><td>B01G6O28NA</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR yeşil hızlı karışım</td><td>Quantabio</td><td>101414-286</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop görüntü işleme yazılımı</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism grafik ve istatistik yazılımı</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qScript XLT cDNA SuperMix</td><td>Quantabio</td><td>10142-786</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>A28137</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Trikain (Etil 3-aminobenzoat metansülfonat)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120 Floresan LED ışık kaynağı</td><td>Excelitas</td><td>010-00326R</td><td>Durduruldu. X-Cite mini+ ile değiştirildi</td></tr></tbody></table>

optogenetik tael/c120 sistemini kullanan zebra balığı embriyolarında işık kaynaklı gfp İfadesi

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

İndüklenebilir gen ekspresyon sistemleri biyolojik süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araçtır. Optogenetik ekspresyon sistemleri, indükleyici madde olarak ışığı kullanarak gen ekspresyon zamanlaması, konumu ve genliği üzerinde hassas kontrol sağlayabilir. Bu protokolde zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyasyonu elde etmek için optogenetik bir ifade sistemi kullanılmaktadır. Bu sistem, E. litoralisbakterisinden doğal olarak meydana gelen ışıkla aktive edilmiş transkripsiyon faktörüne dayanan TAEL adı verilen tasarlanmış bir transkripsiyon faktörüne dayanır. Mavi ışıkla aydınlatıldığında TAEL küçültür, C120 adı verilen konyak düzenleyici elemanına bağlanır ve transkripsiyonu etkinleştirir. Bu protokol, her yerde bulunan ubb promotörünün kontrolü altında TAEL transkripsiyon faktörünü ifade eden transgenik zebra balığı embriyolarını kullanır. Aynı zamanda, C120 düzenleyici elemanı floresan bir muhabir geninin (GFP) ekspresyonunu yönlendirir. Mavi ışığı etkinleştirmek için basit bir LED panel kullanarak, GFP ekspresyonunun indüksiyonu ilk olarak 30 dakikalık aydınlatmadan sonra tespit edilebilir ve 3 saatlik ışık işleminden sonra 130 kat indüksiyondan daha yüksek bir tepeye ulaşır. Ekspresyon indüksiyonu nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve floresan mikroskopi ile değerlendirilebilir. Bu yöntem optogenetik gen ekspresyasyonu için çok yönlü ve kullanımı kolay bir yaklaşımdır.

Bu gösteri için, her iki elementi de içeren çift transgenik embriyo üretmek için her yerde bulunan b (ubb) promotöründen (Tg(ubb:TAEL-N) ucm113 )) TAEL-N'yi her yerde ifade eden transgenik bir çizgi ile C120 duyarlı bir GFP muhabir hattı (Tg (C120F:GFP)ucm107) geçildi. Döllenme sonrası 24 saat, embriyolar mavi ışığı aktive etmeye maruz kaldı, 1 saat açık/1 saat kapalı bir frekansta nabız attı. GFP ekspresyonunun indüksiyonu qRT-PCR ile 30 dk, 1 h, 3 h ve 6 h akti...

Optogenetik, geniş kapsamlı uygulamalara sahip güçlü bir araçtır. Bu protokol, mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemini kullanarak zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyonuna nasıl ulaşılacağını göstermektedir.

Optogenetik TAEL/C120 Sistemini Kullanan Zebra Balığı Embriyolarında Işık Kaynaklı GFP İfadesi

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

Bu protokol, sağlam bir organizmada gen ekspresyonünü teşvik etmek için optogenetik veya ışıkla aktive edilmiş bir yöntem olduğu için önemlidir. Bizim durumumuzda, zebra balığı embriyosu. Bu tekniğin avantajı, indüksiyonun çok hassas, spasiyal ve zamansal kontrolüne izin veren bir indükleyici ajan olarak ışığı kullanmasıdır.Bu protokol, indüklenebilir gen ekspresyonlarının yararlı olacağı her durum için yararlı olacaktır. Bu, soy izleme, işlev kazanım tahlilleri veya kurtarma deneyleri gibi şeyleri içerir. Led paneli, aynı anda birkaç embriyoya santimetrekare ışık gücü başına 1,5 miliwatt teslim etmek için embriyo içeren Petri tabaklarına göre konumlandırmak için.Kuyruk Transkripsiyonal Aktivatör'ün fotoğraf hasarı riskini azaltmak için, ışığı üç saatten fazla aydınlatıyorsa, bir zamanlayıcı rölesi kullanarak bir saat açık aralıklarla yayınlayın. Yoğuşmadaki hafif saçılmaları en aza indirmek için Petri kabı kapaklarını çıkarın. Kontrol embriyoları ve koyu kontroller için ışık geçirmez bir kutu içeren Petri tabakları yerleştirin.İstenilen aktivasyon süresinden sonra embriyoları aydınlatmadan çıkarın. Toplam RNA ekstraksiyonu için bir RNA çıkarma kiti kullanın. Embriyoları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve fazla yumurta suyunu çıkarın.Lizis tamponu ekledikten sonra, embriyoları plastik pestle ile homojenize edin. Lisat'ı sağlanan bir kit sütununa aktarın ve RNA'yı arındırmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Saflaştırılmış RNA'yı eksi 20 ila eksi 80 santigrat derecede saklayın, ta ki üreticinin talimatını izleyerek cDNA sentez kitini kullanarak bir mikrogramdan, toplam RNA'dan cDNA'yı kullanana veya hemen sentezleyene kadar.İnce bir duvara bir mikrogram RNA ekleyin 0.2 mililitre, PCR tüpü, dört mikrolitre içeren, beş kez cDNA reaksiyon ana karışımı, ardından bir mikrolitre ilavesi, 20 kez ters transkriptaz enzim çözeltisi. Daha sonra nükleoz içermeyen su ile 20 mikrolitrelik son bir hacim oluşturuyor. Tüpü cDNA sentezi için programlanmış bir Termo çevrim içine yerleştirin.Sentezlenen cDNA'yı kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın veya nicel değerlendirme için hemen kullanın. Siber yeşil enzim ana karışımını içeren nicel PCR reaksiyonlarını ayarlayın. Üç taraflı 325 nanomolar konsantrasyonda beş kat seyreltilmiş cDNA ve GFP astarları ve reaksiyonu programlanmış gerçek zamanlı bir PCR makinesinde gerçekleştirin.Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, reaksiyon özgüllüğünü belirlemek için erime eğrisini analiz edin. Çift Delta CT yöntemini kullanarak kontrol embriyolarına göre kat değişimi olarak ışıkla aktive indüksiyonu hesaplayın. Ve önemini belirlemek için istatistiksel yazılım kullanın.Embriyoları aydınlatmadan çıkardıktan sonra cam çökelti slaytlarında %0.01 Trikain içeren %3 metilselülozda görüntüleme için embriyoları hareketsiz hale verin. Standart GFP filtre ayarlarını kullanarak dijital kameraya bağlı floresan stereo mikroskopta floresan ve parlak alan görüntüleri elde edin. Satın alma işleminden sonra brightfield ve floresan görüntüleri görüntü işleme yazılımıyla birleştirin.GFP ekspresyonunun nicelleştirilmesi, mavi ışığa maruz kaldıktan 30 dakika sonra ifadenin indüksiyonunu gösterdi. GFP ifade düzeyleri daha sonra aktivasyon sonrası istikrarlı bir şekilde altı saate kadar artmaya devam etti. GFP indüksiyonu da aktivasyon sonrası aynı zamanda floresan yoğunluğu incelenerek niteliksel olarak değerlendirildi.Arka plan seviyelerinin üzerindeki GFP floresan ilk olarak aktivasyon sonrası üç saatte gözlendi ve aktivasyon sonrası altı saatte belirgin şekilde daha parlak hale geldi. Buna karşılık, karanlıkta tutulan tüm zaman noktaları için embriyoları kontrol eder, kayda değer bir GFP floresan sergilemedi. Etkinleştiren ışık, görünür ışık spektrumunun mavi aralığında olmalıdır.Hem oda ışığı hem de güneş ışığı biraz mavi ışık içerir. Bu nedenle, negatif kontrollerinizi ortam ışığı kaynaklarından korumaya özen göster. TAEL C120 sistemi, genetik olarak kodlanmış ve modülerdir ve herhangi bir ilgi geninin ekspresyonini yönlendirebilir.Bu nedenle, diğer tekniklerle birlikte, bir dizi biyolojik soruyu cevaplamak için kullanılabilir.

light-induced-gfp-expression-zebrafish-embryos-using-optogenetic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Multiphoton mikroskobu optik derin penetrasyon ve azaltılmış fototoksisite düşük enerjili fotonların kontrol sağlar. Biz zebrafish embriyolar canlı hücre etiketlenmesi için bu teknolojinin kullanımını anlatmayacağız. Bu protokol fotoğraf indüksiyonu için çeşitli ışık duyarlı moleküllerin kolayca adapte edilebilir.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Bu videoda, genetik olarak modifiye edilmiş somatosensoriyel nöronları aktive ederek ve ortaya çıkan davranışsal yanıtı yüksek hızlı bir video kamera ile kaydederek optogenetik teknikler açıklanmaktadır.

Zebra Balığı Optogenetiği: Larva Davranışsal Tepkilerini İncelemek için Genetik Olarak Değiştirilmiş Somatosensoriyel Nöronun Aktive Edilmesi

Bu videoda, floresan voltaj göstergesini kodlayan transpozaz mRNA'sı ve Tol2 transpozon yapısını içeren Tol2 transpozon sisteminin birlikte enjeksiyonunu takiben bir floresan voltaj gösterge proteinini yapısal olarak ifade eden kararlı bir zebra balığı transgenik hattı oluşturmak için bir prosedür gösteriyoruz.

Tol2 Transpozon Aracılı Zebra Balığı Transgenezi: Tol2 Sisteminin Döllenmiş Zebra Balığı Embriyolarına Koenjeksiyonunu Takiben Transgenik Zebra Balığı Oluşturma Prosedürü

Optogenetic teknikleri mümkün davranışına özgü nöronların katkısı çalışma yaptık. Biz bir diyot pompalı katı hal (DPSS) lazer ile channelrhodopsin varyant (şef) ifade ve yüksek hızlı video kamera ile ortaya çıkardı davranışların kaydedilmesi tek somatosensoriyel nöronlar aktive larva zebrafish bir yöntem açıklanmaktadır.

Chef-tdTomato kullanarak Zebrafish Somatosensoriyel Nöron Optogenetic Etkinleştirme

Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Preneoplastik hücre ilerlemesi ve doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşim erken olayları incelenmesi anlamak ve kanser tedavisinde çok önemlidir. Burada şartlı epitel hücre dönüşümleri ve HRAS G12V zebra balığı larvası deri hücreleri ile doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşiminin daha sonra canlı görüntüleme uyarılması için bir yöntem tarif eder.

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

TAR DNA bağlayıcı protein 43'ün (TDP-43) zebra balıklarını model olarak kullanarak spinal motor nöronlarda ışıkla faz geçişini teşvik eden bir protokol açıklıyoruz.

Zebra Balığı Larvalarının Spinal Motor Nöronlarında TDP-43'ün Optogenetik Faz Geçişi

Bu çalışma, zebra balığı embriyolarına transgenik yapılar oluşturmak ve enjekte etmek için ağ geçidi tabanlı bir klonlama yöntemi olan modüler Tol2 transgenez sistemi için bir protokolü açıklamaktadır.

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Sinyal yollarının optogenetik manipülasyonu, gelişim, rejenerasyon, homeostaz ve hastalıkta sinyalleşmenin nasıl çözüldüğünü araştırmak için güçlü bir strateji olabilir. Bu protokol, erken zebra balığı embriyosunda ışık-oksijen-voltaj algılama alanı tabanlı Nodal ve kemik morfojenik protein (BMP) sinyal aktivatörlerinin kullanılması için pratik yönergeler sağlar.

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Bu protokol, zebra balığı larvalarında kardiyak kasılma fonksiyonunu araştırmak ve hücre izleme ve etkileşimli analiz yoluyla kalp mekaniği hakkında bilgi edinmek için ışık tabakası görüntülemeyi kullanır.

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Keşfedin, optogenetik TAEL/C120 sistemiyle zebra balığı embriyolarında ışık kaynaklı GFP ifadesini. Bu yöntem, gen fonksiyonlarını in vivo çalışmak için uzamsal ve zamansal kontrol sağlar.

Optogenetik TAEL/C120 Sistemini Kullanan Zebra Balığı Embriyolarında Işık Kaynaklı GFP İfadesi

Daha fazla video keşfet