Optogenetik TAEL/C120 Sistemini Kullanan Zebra Balığı Embriyolarında Işık Kaynaklı GFP İfadesi
19 Ağustos 2021
Optogenetik, geniş kapsamlı uygulamalara sahip güçlü bir araçtır. Bu protokol, mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemini kullanarak zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyonuna nasıl ulaşılacağını göstermektedir.
Bu protokol, sağlam bir organizmada gen ekspresyonünü teşvik etmek için optogenetik veya ışıkla aktive edilmiş bir yöntem olduğu için önemlidir. Bizim durumumuzda, zebra balığı embriyosu. Bu tekniğin avantajı, indüksiyonun çok hassas, spasiyal ve zamansal kontrolüne izin veren bir indükleyici ajan olarak ışığı kullanmasıdır.
Bu protokol, indüklenebilir gen ekspresyonlarının yararlı olacağı her durum için yararlı olacaktır. Bu, soy izleme, işlev kazanım tahlilleri veya kurtarma deneyleri gibi şeyleri içerir. Led paneli, aynı anda birkaç embriyoya santimetrekare ışık gücü başına 1,5 miliwatt teslim etmek için embriyo içeren Petri tabaklarına göre konumlandırmak için.
Kuyruk Transkripsiyonal Aktivatör'ün fotoğraf hasarı riskini azaltmak için, ışığı üç saatten fazla aydınlatıyorsa, bir zamanlayıcı rölesi kullanarak bir saat açık aralıklarla yayınlayın. Yoğuşmadaki hafif saçılmaları en aza indirmek için Petri kabı kapaklarını çıkarın. Kontrol embriyoları ve koyu kontroller için ışık geçirmez bir kutu içeren Petri tabakları yerleştirin.
İstenilen aktivasyon süresinden sonra embriyoları aydınlatmadan çıkarın. Toplam RNA ekstraksiyonu için bir RNA çıkarma kiti kullanın. Embriyoları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve fazla yumurta suyunu çıkarın.
Lizis tamponu ekledikten sonra, embriyoları plastik pestle ile homojenize edin. Lisat'ı sağlanan bir kit sütununa aktarın ve RNA'yı arındırmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Saflaştırılmış RNA'yı eksi 20 ila eksi 80 santigrat derecede saklayın, ta ki üreticinin talimatını izleyerek cDNA sentez kitini kullanarak bir mikrogramdan, toplam RNA'dan cDNA'yı kullanana veya hemen sentezleyene kadar.
İnce bir duvara bir mikrogram RNA ekleyin 0.2 mililitre, PCR tüpü, dört mikrolitre içeren, beş kez cDNA reaksiyon ana karışımı, ardından bir mikrolitre ilavesi, 20 kez ters transkriptaz enzim çözeltisi. Daha sonra nükleoz içermeyen su ile 20 mikrolitrelik son bir hacim oluşturuyor. Tüpü cDNA sentezi için programlanmış bir Termo çevrim içine yerleştirin.
Sentezlenen cDNA'yı kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın veya nicel değerlendirme için hemen kullanın. Siber yeşil enzim ana karışımını içeren nicel PCR reaksiyonlarını ayarlayın. Üç taraflı 325 nanomolar konsantrasyonda beş kat seyreltilmiş cDNA ve GFP astarları ve reaksiyonu programlanmış gerçek zamanlı bir PCR makinesinde gerçekleştirin.
Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, reaksiyon özgüllüğünü belirlemek için erime eğrisini analiz edin. Çift Delta CT yöntemini kullanarak kontrol embriyolarına göre kat değişimi olarak ışıkla aktive indüksiyonu hesaplayın. Ve önemini belirlemek için istatistiksel yazılım kullanın.
Embriyoları aydınlatmadan çıkardıktan sonra cam çökelti slaytlarında %0.01 Trikain içeren %3 metilselülozda görüntüleme için embriyoları hareketsiz hale verin. Standart GFP filtre ayarlarını kullanarak dijital kameraya bağlı floresan stereo mikroskopta floresan ve parlak alan görüntüleri elde edin. Satın alma işleminden sonra brightfield ve floresan görüntüleri görüntü işleme yazılımıyla birleştirin.
GFP ekspresyonunun nicelleştirilmesi, mavi ışığa maruz kaldıktan 30 dakika sonra ifadenin indüksiyonunu gösterdi. GFP ifade düzeyleri daha sonra aktivasyon sonrası istikrarlı bir şekilde altı saate kadar artmaya devam etti. GFP indüksiyonu da aktivasyon sonrası aynı zamanda floresan yoğunluğu incelenerek niteliksel olarak değerlendirildi.
Arka plan seviyelerinin üzerindeki GFP floresan ilk olarak aktivasyon sonrası üç saatte gözlendi ve aktivasyon sonrası altı saatte belirgin şekilde daha parlak hale geldi. Buna karşılık, karanlıkta tutulan tüm zaman noktaları için embriyoları kontrol eder, kayda değer bir GFP floresan sergilemedi. Etkinleştiren ışık, görünür ışık spektrumunun mavi aralığında olmalıdır.
Hem oda ışığı hem de güneş ışığı biraz mavi ışık içerir. Bu nedenle, negatif kontrollerinizi ortam ışığı kaynaklarından korumaya özen göster. TAEL C120 sistemi, genetik olarak kodlanmış ve modülerdir ve herhangi bir ilgi geninin ekspresyonini yönlendirebilir.
Bu nedenle, diğer tekniklerle birlikte, bir dizi biyolojik soruyu cevaplamak için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, zebra balığı embriyolarında ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonu sağlamak için optogenetiğin kullanımını göstermektedir. Mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemi, bozulmamış bir organizmada gen ekspresyonunun hassas bir şekilde kontrol edilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Optogenetik
- Gen ekspresyonu
- Zebrafish modelleri
Arka Plan
- Optogenetik, gen ekspresyonunu indüklemek için kullanılan ışıkla aktive edilen bir yöntemdir.
- Bu teknik, indüksiyonun mekansal ve zamansal kontrolünü sağlar.
- Özellikle soy hattı takibi (lineage tracing) ve fonksiyon kazanım (gain-of-function) analizleri için kullanışlıdır.
- Zebrafish embriyoları, in vivo gen ekspresyonunu incelemek için bir model teşkil eder.
Çalışmanın Amacı
- Işıkla indüklenebilir gen ekspresyonu için bir yöntem göstermek.
- Optogenetik uygulamalarla ilgilenen araştırmacılar için bir protokol sağlamak.
- Gen ekspresyonu üzerinde kesin kontrol gerektiren deneyleri kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Embriyo içeren Petri kaplarına göre bir LED panelin konumlandırılması.
- Santimetrekare başına 1,5 milliwatt ışık uygulanması.
- Birden fazla embriyoda aynı anda gen ifadesinin indüklenmesi.
- Gen kontrolü için TAEL/C120 optogenetik sisteminin kullanılması.
Temel Sonuçlar
- Zebrafish embriyolarında gen ekspresyonunun başarılı bir şekilde indüklenmesi.
- Gen aktivasyonu üzerinde mekansal ve zamansal kontrolün gösterilmesi.
- Gelecekteki optogenetik çalışmalar için güvenilir bir protokol sağlanması.
- İndükleyici bir ajan olarak ışık kullanmanın avantajlarının vurgulanması.
Sonuçlar
- Optogenetik, gen fonksiyonlarının incelenmesi için güçlü bir araç sunar.
- TAEL/C120 sistemi, in vivo gen ekspresyonunu indüklemek için etkilidir.
- Bu yöntem, çeşitli biyolojik araştırma senaryolarına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Gen ekspresyonunun optogenetik kontrolü, biyolojik hedeflerin in vivo ortamda hassas spasyotemporal sorgulamasını sağlayarak erken keşif aşamasındaki mekanistik risklerin azaltılmasını destekler. TAEL/C120 sistemi, terapötik hipotezlerin kantitatif okumalarla doğrulanması için genetik olarak kodlanmış, ışıkla anahtarlanabilir bir platform sunar. Bu yaklaşım, zebra balığı embriyolarında gen ekspresyonunun tersine çevrilebilir ve doza bağımlı modülasyonuna izin vererek hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Bozulmamış bir omurgalı modelinde indüklenebilir ve geri döndürülebilir gen aktivasyonu aracılığıyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Işıkla tetiklenen ekspresyonu, GFP raporlayıcısı ve qRT-PCR kantifikasyonu yoluyla fenotipik çıktılarla ilişkilendirerek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Hastalıkla ilgili bağlamlarda hedef yeterliliğini ve yolak ilgisini değerlendirmek için fonksiyon kazanım (gain-of-function) ve kurtarma (rescue) deneylerini kolaylaştırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Bileşik veya koşul taraması için floresan mikroskobu ve qRT-PCR ile ölçülebilen, ışığa bağımlı kantitatif GFP ekspresyonu oluşturur.
- Tekrarlanabilirlik: Tekrarlar arasındaki değişkenliği en aza indirmek için tanımlanmış ışık şiddeti (1.5 mW/cm²) ve zamansal kontrol ile standardize edilmiş indüksiyon protokollerine olanak tanır.
- Ölçeklenebilirlik: Kontrollü aydınlatma altında birden fazla embriyoyu eş zamanlı olarak işlemek için LED paneller kullanan çok kuyucuklu formatlarla uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalık Modelleme: Gen ekspresyonunun zamansal kontrolünün indüklenebilir terapötik müdahaleleri taklit ettiği zebrafish tabanlı preklinik modelleri destekler.
- Biyobelirteç Uyumluluğu: GFP ve qRT-PCR çıktıları, yolak etkileşimi ve hedef modülasyonu için çevrilebilir farmakodinamik okumalar olarak hizmet eder.
- Risk Azaltma: Memeli çalışmalarından önce, indüklenebilir fonksiyon kazanımı ve kurtarma tasarımları aracılığıyla gereklilik ve yeterliliğin test edilmesiyle hedeflerin risklerinin azaltılmasını sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine uyum sağlayarak, moleküler hedeflerin bir omurgalı sistemde iteratif olarak doğrulanmasına olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: vivo ortamda zaman ayarlı, ışıkla tetiklenen ekspresyon yoluyla hedef yeterliliğini ve yolak aktivasyonunu test eder.
- Tarama: Genetik veya farmakolojik koşulları karşılaştırmak için kantitatif, normalize edilmiş çıktılar (GFP kat değişimi) sağlar.
- Analitik: İndüklenmiş gruplar ile karanlık kontroller arasındaki istatistiksel karşılaştırma için çift delta CT qRT-PCR ve floresan yoğunluğu kullanır.
- Translasyonel Araştırma: İndüklenebilir ekspresyonu zebrafish'lerdeki fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek preklinik etkinlik testlerine geçişte sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Modüler TAEL/C120 sistemi herhangi bir ilgi çekici geni yönlendirebilir, böylece birden fazla hedef ve proje genelinde yeniden kullanıma olanak tanır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Karmaşık bir organizmada gen ekspresyonu üzerinde hassas zamansal kontrol sağlayarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Çevresel değişkenlikleri hesaba katmak için standartlaştırılmış ışık iletimi ve dahili karanlık kontrolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Fenotipik sonuçları değerlendirmek için hızlı ve geri döndürülebilir hedef modülasyonuna olanak tanıyarak go/no-go (devam/durdur) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Kaynak yoğun ilerleme öncesinde, hedefleri fizyolojik olarak ilgili, indüklenebilir bir sistemde doğrulayarak riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Zebrafish bakımı, mikroenjeksiyon ve optogenetik donanım kurulumu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Hassas mavi ışık şiddeti ve zamanlama kontrolü sağlayabilen LED aydınlatma sistemlerine bağımlıdır.
- Verilerin karşılaştırılabilirliğini sağlamak için ışığa maruz kalma süresi ve karanlık kontrolleminin sürdürülmesine yönelik standart protokoller gerektirir.
- Farklı embriyonik evrelere veya genetik arka planlara ölçeklendirilirken adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Opak dokulardaki ışık penetrasyonu ile sınırlıdır, ancak zebrafish embriyolarındaki optik netlik sayesinde bu durum hafifletilmiştir.
