Optogenetik TAEL/C120 Sistemini Kullanan Zebra Balığı Embriyolarında Işık Kaynaklı GFP İfadesi
August 19th, 2021
Optogenetik, geniş kapsamlı uygulamalara sahip güçlü bir araçtır. Bu protokol, mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemini kullanarak zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyonuna nasıl ulaşılacağını göstermektedir.
Bu protokol, sağlam bir organizmada gen ekspresyonünü teşvik etmek için optogenetik veya ışıkla aktive edilmiş bir yöntem olduğu için önemlidir. Bizim durumumuzda, zebra balığı embriyosu. Bu tekniğin avantajı, indüksiyonun çok hassas, spasiyal ve zamansal kontrolüne izin veren bir indükleyici ajan olarak ışığı kullanmasıdır.
Bu protokol, indüklenebilir gen ekspresyonlarının yararlı olacağı her durum için yararlı olacaktır. Bu, soy izleme, işlev kazanım tahlilleri veya kurtarma deneyleri gibi şeyleri içerir. Led paneli, aynı anda birkaç embriyoya santimetrekare ışık gücü başına 1,5 miliwatt teslim etmek için embriyo içeren Petri tabaklarına göre konumlandırmak için.
Kuyruk Transkripsiyonal Aktivatör'ün fotoğraf hasarı riskini azaltmak için, ışığı üç saatten fazla aydınlatıyorsa, bir zamanlayıcı rölesi kullanarak bir saat açık aralıklarla yayınlayın. Yoğuşmadaki hafif saçılmaları en aza indirmek için Petri kabı kapaklarını çıkarın. Kontrol embriyoları ve koyu kontroller için ışık geçirmez bir kutu içeren Petri tabakları yerleştirin.
İstenilen aktivasyon süresinden sonra embriyoları aydınlatmadan çıkarın. Toplam RNA ekstraksiyonu için bir RNA çıkarma kiti kullanın. Embriyoları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve fazla yumurta suyunu çıkarın.
Lizis tamponu ekledikten sonra, embriyoları plastik pestle ile homojenize edin. Lisat'ı sağlanan bir kit sütununa aktarın ve RNA'yı arındırmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Saflaştırılmış RNA'yı eksi 20 ila eksi 80 santigrat derecede saklayın, ta ki üreticinin talimatını izleyerek cDNA sentez kitini kullanarak bir mikrogramdan, toplam RNA'dan cDNA'yı kullanana veya hemen sentezleyene kadar.
İnce bir duvara bir mikrogram RNA ekleyin 0.2 mililitre, PCR tüpü, dört mikrolitre içeren, beş kez cDNA reaksiyon ana karışımı, ardından bir mikrolitre ilavesi, 20 kez ters transkriptaz enzim çözeltisi. Daha sonra nükleoz içermeyen su ile 20 mikrolitrelik son bir hacim oluşturuyor. Tüpü cDNA sentezi için programlanmış bir Termo çevrim içine yerleştirin.
Sentezlenen cDNA'yı kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın veya nicel değerlendirme için hemen kullanın. Siber yeşil enzim ana karışımını içeren nicel PCR reaksiyonlarını ayarlayın. Üç taraflı 325 nanomolar konsantrasyonda beş kat seyreltilmiş cDNA ve GFP astarları ve reaksiyonu programlanmış gerçek zamanlı bir PCR makinesinde gerçekleştirin.
Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, reaksiyon özgüllüğünü belirlemek için erime eğrisini analiz edin. Çift Delta CT yöntemini kullanarak kontrol embriyolarına göre kat değişimi olarak ışıkla aktive indüksiyonu hesaplayın. Ve önemini belirlemek için istatistiksel yazılım kullanın.
Embriyoları aydınlatmadan çıkardıktan sonra cam çökelti slaytlarında %0.01 Trikain içeren %3 metilselülozda görüntüleme için embriyoları hareketsiz hale verin. Standart GFP filtre ayarlarını kullanarak dijital kameraya bağlı floresan stereo mikroskopta floresan ve parlak alan görüntüleri elde edin. Satın alma işleminden sonra brightfield ve floresan görüntüleri görüntü işleme yazılımıyla birleştirin.
GFP ekspresyonunun nicelleştirilmesi, mavi ışığa maruz kaldıktan 30 dakika sonra ifadenin indüksiyonunu gösterdi. GFP ifade düzeyleri daha sonra aktivasyon sonrası istikrarlı bir şekilde altı saate kadar artmaya devam etti. GFP indüksiyonu da aktivasyon sonrası aynı zamanda floresan yoğunluğu incelenerek niteliksel olarak değerlendirildi.
Arka plan seviyelerinin üzerindeki GFP floresan ilk olarak aktivasyon sonrası üç saatte gözlendi ve aktivasyon sonrası altı saatte belirgin şekilde daha parlak hale geldi. Buna karşılık, karanlıkta tutulan tüm zaman noktaları için embriyoları kontrol eder, kayda değer bir GFP floresan sergilemedi. Etkinleştiren ışık, görünür ışık spektrumunun mavi aralığında olmalıdır.
Hem oda ışığı hem de güneş ışığı biraz mavi ışık içerir. Bu nedenle, negatif kontrollerinizi ortam ışığı kaynaklarından korumaya özen göster. TAEL C120 sistemi, genetik olarak kodlanmış ve modülerdir ve herhangi bir ilgi geninin ekspresyonini yönlendirebilir.
Bu nedenle, diğer tekniklerle birlikte, bir dizi biyolojik soruyu cevaplamak için kullanılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, zebra balığı embriyolarında ışıkla indüklenen gen ekspresyonunu sağlamak için optogenetiğin kullanımını gösterir. Mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemi, tam bir organizmada gen ekspresyonunun hassas kontrolünü sağlar.
Ana Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Optogenetik
- Gen ekspresyonu
- Zebra balığı modelleri
Arka Plan
- Optogenetik, gen ekspresyonunu indüklemek için ışıkla aktive edilen bir yöntemdir.
- Bu teknik, indüksiyonun mekansal ve zamansal kontrolünü sağlar.
- Özellikle soy izleme ve işlev kazanımı analizleri için yararlıdır.
- Zebra balığı embriyoları, gen ekspresyonunu in vivo olarak incelemek için bir model olarak kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Işıkla indüklenen gen ekspresyonu için bir yöntem göstermek.
- Optogenetik uygulamalarıyla ilgilenen araştırmacılar için bir protokol sağlamak.
- Gen ekspresyonu üzerinde hassas kontrol gerektiren deneyleri kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Embriyoları içeren Petri kabına göre bir LED panelinin konumlandırılması.
- Karesantimetreye 1,5 miliwatt ışık verilmesi.
- Aynı anda birden fazla embriyoda gen ekspresyonunun indüklenmesi.
- Gen kontrolü için TAEL/C120 optogenetik sisteminin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Zebra balığı embriyolarında gen ekspresyonunun başarılı bir şekilde indüklenmesi.
- Gen aktivasyonu üzerinde mekansal ve zamansal kontrol gösterilmesi.
- Gelecekteki optogenetik çalışmalar için güvenilir bir protokol sağlanması.
- Işık kullanmanın avantajlarının vurgulanması.
Sonuçlar
- Optogenetik, gen işlevini incelemek için güçlü bir araç sunar.
- TAEL/C120 sistemi, in vivo gen ekspresyonunu indüklemek için etkilidir.
- Bu yöntem, çeşitli biyolojik araştırma senaryolarına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of gene expression enables precise spatiotemporal interrogation of biological targets in vivo, supporting mechanistic de-risking in early discovery. The TAEL/C120 system provides a genetically encoded, light-switchable platform for validating therapeutic hypotheses with quantitative readouts. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing reversible, dose-dependent modulation of gene expression in zebrafish embryos.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through inducible, reversible gene activation in an intact vertebrate model.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking light-induced expression to phenotypic readouts via GFP reporter and qRT-PCR quantification.
- Predictive Value: Facilitates gain-of-function and rescue experiments to assess target sufficiency and pathway relevance in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, light-dependent GFP expression measurable by fluorescence microscopy and qRT-PCR for compound or condition screening.
- Reproducibility: Enables standardized induction protocols with defined light intensity (1.5 mW/cm²) and temporal control to minimize variability across replicates.
- Scalability: Compatible with multi-well formats using LED panels to treat multiple embryos simultaneously under controlled illumination.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Supports zebrafish-based preclinical models where temporal control of gene expression mimics inducible therapeutic interventions.
- Biomarker Alignment: GFP and qRT-PCR outputs serve as translatable pharmacodynamic readouts for pathway engagement and target modulation.
- Risk Mitigation: Allows de-risking of targets by testing necessity and sufficiency through inducible gain-of-function and rescue designs prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling iterative validation of molecular targets in a vertebrate system.
- Discovery Biology: Tests target sufficiency and pathway activation through timed, light-induced expression in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, normalized outputs (fold-change GFP) for comparing genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs double delta CT qRT-PCR and fluorescence intensity for statistical comparison between induced and dark controls.
- Translational Research: Connects inducible expression to phenotypic outcomes in zebrafish, supporting continuity to preclinical efficacy testing.
- Enterprise Reuse: Modular TAEL/C120 system can drive any gene of interest, enabling reuse across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing precise temporal control over gene expression in a complex organism.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized light delivery and internal dark controls to account for environmental variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid, reversible target modulation to assess phenotypic consequences.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by validating targets in a physiologically relevant, inducible system before resource-intensive advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and optogenetic hardware setup.
- Depends on LED illumination systems capable of delivering precise blue light intensity and timing control.
- Necessitates standardized protocols for light exposure duration and dark control maintenance to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when scaling to different embryonic stages or genetic backgrounds.
- Limited by light penetration in opaque tissues, though mitigated in zebrafish embryos due to optical clarity.
