Name: Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Öğrenin, yetişkin fare damak dokusundan birincil oral keratinositlerin izolasyonu ve uzun süreli kültürü için bu protokolü. Kök hücre benzeri özelliklerini koruyarak oral hastalıkların anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibesi (B) (20H03266) (A.S.'ye), Erken Kariyer Bilim adamları için Yardım Hibesi (18K14709) (A'ya) tarafından desteklenmiştir. .S.), JP21gm6110016 ve 21bm0704067 (A.S.'ye) hibe numarası altında AMED ve Takeda Bilim Vakfı'ndan (A.S.'ye) araştırma hibeleri. Kumamoto Üniversitesi Hayvan Kaynakları ve Geliştirme Merkezi'ne ve Tsukuba Üniversitesi Hayvan Kaynakları Merkezi'ne mükemmel fare bakımları için teşekkür ederiz. Kumamoto Üniversitesi'ndeki IRCMS çekirdek tesisine konfokal görüntüleme konusundaki desteği için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneyleri Kumamoto Üniversitesi ve Tsukuba Üniversitesi Kurumsal Hayvan Deney Komitesi yönergelerine göre gerçekleştirildi.
1. Reaktiflerin ve kültür medyasının hazırlanması
<ol><li>60 μM kalsiyum ve 600 μL antibiyotik-antimykotik çözelti içeren 40 mL keratinosit kültür ortamı hazırlayın. 20 mL%0,025 tripsin ve 400 μL antibiyotik-antimycotic çözelti hazırlayın.<ol>
<li>Tripin inhibisyon çözeltisini oda sıcaklığında çözün ve 4.1 adımında kullanılana kadar 4 °C'de tutun. NOT: İzolasyon reaktifi beş farenin doku izolasyonu için hazırlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültür medyasını hazırlamak için, 500 mL orta alın ve 5 mL büyüme takviyesi çözeltisi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) (bundan böyle tam orta olarak anılacaktır) ve% 20 kalsiyum tükenmiş chelexed-fetal sığır serumu (FBS)33 (bundan böyle chelexed-FBS olarak anılacaktır).</li>
</ol>2. Damak dokusunun yetişkin fareden diseksiyonu
<ol><li>Yetişkin bir C57BL/6J fareyi (erkek veya dişi) tesisin hayvan refahı ile ilgili yönetmeliklerine uygun olarak servikal çıkık yoluyla kurban edin.<ol>
<li>Ağız çevresindeki saçları bir tıraş makinesi ile çıkarın. Makas kullanarak, yanaktan çeneye doğru, her iki taraftan kesin. NOT: Kurbandan önce farenin uyuşturulması gerekir. Metetomididin, midazolam ve butorphanolün anestezik karışımı kullanılır (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ağzı geniş açmak ve pamuklu çubuk kullanarak herhangi bir kanı emmek için kümesleri kullanın. Damağı dezenfekte etmek için ağzın içini% 10 povidone-iyot içeren bir pamuklu çubukla silin.</li>
	<li>Fare damağı toplamak için, önce, maksiller dişlerin damak tarafı boyunca tam kalınlıklı marjinal bir kesi yapmak için cerrahi bir neşter bıçağı kullanın. Daha sonra, bir raspatorium kullanarak tüm damağı dikkatlice parçalara ayırın. NOT: Raspatorium, mukoperiosteal bir flep yükseltmek için kullanılan bir araçtır (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1B).</li>
	<li>Damak dokusunu 4 mL tam orta + antibiyotik-antimykotik çözelti içeren 15 mL'lik bir tüpe hızlı bir şekilde aktarın. Dokuları inkübasyona hazır olana kadar buzda tutun. NOT: Birden fazla fareden toplanmak için damak dokuları 4 saate kadar buzda tutulabilir.</li>
</ol>3. Damak dokusunun ön işlemden önce
<ol><li>Laminer akış davlumbazında, dokuları 4 mL tam orta + antibiyotik-antimykotik çözelti içeren 60 mm'lik bir tabağa aktarın.</li>
	<li>Kısa, künt tokalar ve neşter bıçağı kullanarak, dokulardaki herhangi bir kanı nazikçe çıkarın. Dokuları tam ortamda 10 kez yıkayın.</li>
	<li>Dokuları, epitel yüzeyi aşağı bakacak şekilde 4 mL%0,025 tripsin + antibiyotik-antimycotic çözelti içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın. NOT: İçe doğru kıvrılan epitel yüzeyi tripsin çözeltisinde bekletilmelidir; lamina propria yüz yüze olmalıdır. Doku tamamen tripsin çözeltisinde inkübe edilecek şekilde mümkün olduğunca düzleştirilmelidir.</li>
	<li>Dokuları kültür kaputunda oda sıcaklığında ~16 saat boyunca % 0.025 trypsin içinde kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>4. Birincil hücrelerin toplanması ve kültürü
<ol><li>Bir çift künt forseps kullanarak, dokuyu tripsin çözeltisinden (35 mm'lik tabakta) çıkarın ve epitel yüzeyi yukarı bakacak şekilde 60 mm'lik bir tabakta (çanak başına 4 mL) tripsin inhibitörü çözeltisine aktarın.</li>
	<li>Damak kenarına tutunmak için epansları kullanarak, neşter bıçağı kullanarak alttaki lamina propria'daki epitel tabakasını hafifçe kazıyın. NOT: Bağ dokusu tripsin ile sindirilmez, bu nedenle kazıma sırasında soyulmaz.</li>
	<li>Dokulardan maksimum miktarda epitel hücresi toplamak için, dokuyu 4 mL tam orta ile başka bir 60 mm'lik çanağa aktarın ve kazıma adımını tekrarlayın. NOT: Bıçağın ucuyla dokuyu kazımaktan kaçındığından emin olun; bunun yerine bıçağın kenarını kullanın. Kazıma doku başına 5-10 dakika boyunca gerçekleştirilir.</li>
	<li>Steril bir 100 μm hücre süzgecini 50 mL konik tüpün üstüne yerleştirin.</li>
	<li>Steril bir pipet kullanarak, yüzeyini ıslatmak için 2 mL tripsin çözeltisini (adım 4.1'den) süzgeçe aktarın.</li>
	<li>Pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 60 mm'lik tabakta (4.2-4.3 adımlarından) birkaç kez karıştırın ve hücreleri 4.4-4.5 adımlarında hazırlanan 100 μm hücre süzgecinden filtreleyin.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın. 15 μL trippan mavisi çözelti hazırlayın ve 15 μL hücre süspansiyonu ekleyin (adım 4.6). Hücre-trippan mavi karışımının 10 μL'sini bir hemositometreye aktarın ve hücre sayısını sayın. NOT: Bir fare damak parçası 1 milyon hücreye kadar verim verebilir.</li>
	<li>Sayarken, tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 x g'da (adım 4.6'dan itibaren) santrifüj edin.</li>
	<li>Bir pipet ile süpernatant aspirat. Tüpe 2 mL komple orta + chelexed-FBS ekleyin. 5 mL pipet kullanarak birkaç kez tritüre ederek hücre peletini yeniden canlandırın.</li>
	<li>Plaka 2-5 x 105 hücre bir fareden kollajen tip I ile önceden kaplanmış 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Ortamı değiştirmeden hücreleri 2 gün boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tohumlamadan iki gün sonra, kültür ortamının yarısını tam orta + chelexed-FBS ile değiştirin. Mikroskop altındaki hücre morfolojisini kontrol et. Hücreleri her 2 günde bir tam orta + chelexed-FBS ile besleyin. NOT: Tohumlamadan sonra, farklı boyutlarda hücreler gözlenecektir. Tohumlamadan yaklaşık 3-5 gün sonra, parke taşı morfolojisi olan keratinositler (Şekil 2) gözlenebilir. İlk pasajın gerçekleştirilebilmesi için 1-2 hafta kültür gerekir ve hücreler ikinci ve üçüncü pasajlara hazır olmadan önce sonraki 1-2 hafta gereklidir. Bundan sonra, hücreler daha hızlı büyür ve kriyoprezervasyona hazırlanabilir. Hücreler sırasıyla birinci ve ikinci geçitte bir kuyuya (24 kuyu plakası) ve 6 kuyu plakasına yeniden kaplanabilir. Sonraki geçiş hücre büyümesine ve yoğunluğuna bağlı olacaktır. Üçüncü pasajdan sonra 1:2 veya 1:3 hücre bölünme oranı kullanılabilir.</li>
</ol>5. Keratinosit pasajı
<ol><li>Kültür çanaktan 2 mL süpernatant toplayın ve 15 mL konik bir tüpe (buz üzerinde) dağıtın. Hücreleri steril 1x PBS ile iki kez yıkayın. NOT: Hücreler yaklaşık %70-%80 izdiah süresine ulaştığında geçişe hazırdır.</li>
	<li>6 kuyulu bir tabağa yemeğe 1 mL% 0.05 trypsin-EDTA ekleyin.</li>
	<li>37 °C'de 5-15 dakika kuluçkaya yatır; hücrelerin tabaktan ayrılıp kopmadığını görmek için 5 dakika sonra kontrol edin.</li>
	<li>Hafif pipetleme ile 1 mL tripsin inhibisyon çözeltisi ve 2 mL tam kültür ortamı + chelexed-FBS kullanarak reaksiyonu nötralize edin. Ardından, hücre süspansiyonu 5.1 adımındakiyle aynı 15 mL konik tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu 100 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüj. Süpernatantı bir pipetle aspire edin ve hücre peletini 1 mL tam kültür ortamında yeniden dirilir.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, hücre süspansiyonunun 1 mL'lik plakasını yeni bir 24 veya 6 kuyu kültür plakasına koyun. NOT: Erken pasajlardan gelen hücrelerin bir kısmı %70 komple kültür ortamı + %20 chelexed-FBS + %10 DMSO karışımında dondurulabilir. Bir birleştiği kültür plakasından 1-2 hücre kriyovyalleri toplanabilir.</li>
</ol>6. Kriyoprezervasyon ve keratinositlerin geri kazanımı
<ol><li>Hücre dondurma<ol>
<li>Keratinositleri% 80-% 90 izdiah eder. NOT: Hücrelerin aşırı büyümesine izin vermeyin, çünkü bu onların çoğalma durumlarını ve canlılıklarını azaltabilir.</li>
		<li>Yemekteki keratinositleri 5.1-5.5 adımlarında açıklandığı gibi% 0.05 tripsin-EDTA ile tedavi edin.</li>
		<li>Hemositometre kullanarak keratinositleri sayın. Her şişeye 1 x 106 hücre/mL aktarımı için hesaplanan hücre numaralarına göre cryovials hazırlayın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu 100 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüj. Süpernatantı atın ve hücre peletini % 10 DMSO + % 20 chelexed-FBS + % 70 tam kültür ortamı (9 mL komple orta + chelexed-FBS ve 1 mL DMSO) 10 mL çözeltisinde yeniden kullanın.</li>
		<li>Hücreleri şişe başına 1 mL süspansiyonda cryovials içine dağıtın. Şişeleri -80 °C'de gece boyunca kriyojenik bir saklama kabına yerleştirin. Şişeleri ertesi gün sıvı bir azot tankına aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre kurtarma<ol>
<li>Sıvı nitrojen tankından bir cryovial çıkarın ve oda sıcaklığında kısmen çözün. 15 mL'lik bir tüpte, hücre süspansiyonunun 1 mL'lik kısmını 3 mL tam kültür ortamı + chelexed-FBS ile karıştırın.</li>
		<li>Karışımı 100 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve peletin 1 mL tam kültür ortamı + chelexed-FBS'de yeniden diriltin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonlarını yeni 60 mm Collagen I kaplamalı kültür yemeklerine dönüştürin. Kültür ortamını her 2-3 günde bir değiştirin ve bir kez birleştiğinde hücreleri geçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. İmmünofluoresan boyama
<ol><li>2 gün boyunca 6 kuyulu plakalarda (5 x 105 hücre/kuyu) kare kapaklarda (22 mm x 22 mm) kültür oral keratinositler.</li>
	<li>Keratinositleri 1x PBS ile üç kez yıkamadan önce oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ve PBS çözeltisinde sabitlayın.</li>
	<li>PBS'de %0,1 Triton çözeltisinde hücrelerin dengesini bozar. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca reaktifi bloke eden hücreleri (%2,5 keçi serumu, %2,5 eşek serumu) kuluçkaya yatırın, ardından 4 °C'de birincil antikorlarla gece boyunca inkübasyon (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Birincil antikorlar aşağıdaki seyreltmelerde kullanılmıştır: tavşan anti-K14 (1:1000), sıçan α6-integrin (1:100), tavşan anti-p63 (1:500), tavşan anti-K13 (1:100) ve keçi anti-PDGFRα (1:100).</li>
	<li>Örnekleri PBS'de% 0.1 Triton çözeltisinde yıkayın, ardından oda sıcaklığında 1 saat ikincil antikorlarla inkübasyon. NOT: İkincil antikorlar (Alexa 488 veya 555) 1:300 seyreltmede kullanıldı.</li>
	<li>Tüm numuneleri Hoechst çözeltisi ile 10 dakika boyunca karşı tutun ve hücreleri cam slaytlara monte edin. NOT: Hoechst çözeltisi hücrelerin çekirdeklerini lekelendirmek için kullanılır.</li>
	<li>Konfokal mikroskop kullanarak örnek görüntüleme gerçekleştirin. NOT: Parlaklık ve kontrast, görüntü düzenleme yazılımı kullanılarak eşit yoğunluğa ayarlanır.</li>
</ol>

<ol><li>Presland, R. B., Jurevic, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+of+the+epithelial+barrier%3A+what+molecular+biology+and+genetics+tell+us+about+the+functions+of+oral+mucosal+and+epidermal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Education%22%5BJournal%5D)">Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues.</a> Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).</li>
<li>Squier, C. A., Kremer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oral+mucosa+and+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Biology of oral mucosa and esophagus.</a> Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).</li>
<li>Jones, K. B., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+epithelial+stem+cells+in+tissue+maintenance+and+disease%3A+the+first+steps+in+a+long+journey%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey.</a> International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).</li>
<li>Winning, T. A., Townsend, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+embryology+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal embryology and histology.</a> Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).</li>
<li>Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+density+of+label-retaining+cells+in+gingival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium.</a> Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).</li>
<li>Bickenbach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+behavior+of+label-retaining+cells+in+oral+mucosa+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin.</a> Journal of Dental Research. 60, Spec No C 1611-1620 (1981).</li>
<li>Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+localization+of+label-retaining+cells+in+hamster+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia.</a> Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).</li>
<li>Byrd, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+within+stratified+epithelial+stem+cell+populations+maintains+the+oral+mucosa+in+response+to+physiological+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).</li>
<li>Jones, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+clonal+analysis+and+single-cell+transcriptomics+reveal+division+kinetics%2C+hierarchy%2C+and+fate+of+oral+epithelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).</li>
<li>Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+epithelium+in+rats+is+characterized+by+slow+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontology%22%5BJournal%5D)">Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation.</a> Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+that+maintain+and+regenerate+lingual+keratinized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).</li>
<li>Compton, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+regenerated+from+cultured+epithelial+autografts+on+full-thickness+burn+wounds+from+6+days+to+5+years+after+grafting.+A+light%2C+electron+microscopic+and+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study.</a> Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).</li>
<li>Gallico, G. G., O'Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+coverage+of+large+burn+wounds+with+autologous+cultured+human+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium.</a> New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 2(2013).</li>
<li>O'connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafting+of+burns+with+cultured+epithelium+prepared+from+autologous+epidermal-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells.</a> Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+murine+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of murine epidermal keratinocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Yano, S., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+adult+murine+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes.</a> British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).</li>
<li>Iglesias-Bartolome, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signature+primes+human+oral+mucosa+for+rapid+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing.</a> Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).</li>
<li>Papagerakis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+epithelial+stem+cells+-+implications+in+normal+development+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Oral epithelial stem cells - implications in normal development and cancer metastasis.</a> Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).</li>
<li>Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+injury+responses+in+oral+mucosal+and+cutaneous+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds.</a> Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+differences+in+the+wound+transcriptome+of+skin+and+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa.</a> BMC Genomics. 11, 471(2010).</li>
<li>Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+HIF-1alpha+in+skin+and+mucosal+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds.</a> Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).</li>
<li>Simoes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+microRNA+profile+underlies+the+divergent+healing+responses+in+skin+and+oral+mucosal+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7160(2019).</li>
<li>Turabelidze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+between+oral+and+skin+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes.</a> PLoS One. 9 (9), 101480(2014).</li>
<li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li>
<li>Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+oral+keratinocyte+progenitor%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells.</a> Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li>
<li>Hatakeyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+gingival+epithelial+cell+lines+from+transgenic+mice+harboring+temperature+sensitive+simian+virus+40+large+T-antigen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).</li>
<li>Ookura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+and+epidermal+growth+factors+modulate+proliferation+and+neural+cell+adhesion+molecule+expression+in+epithelial+cells+derived+from+the+adult+mouse+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (6), 365-372 (2002).</li>
<li>Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+an+immortalized+oral+keratinocyte+cell+line+of+mouse+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin.</a> Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).</li>
<li>Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+reducing+calcium+and+magnesium+concentrations+in+tissue+culture+medium%3A+application+to+studies+of+lymphoblast+proliferation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro.</a> In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).</li>
<li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfollicular+epidermal+stem+cells%3A+boosting+and+rescuing+from+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin.</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

İnsan veya fare derisi epidermisinden izole edilen primer keratinositler araştırma ve klinik uygulamalarda uzun yıllardır kullanılmaktadır12,13,15,18,27,28,29. Bunun aksine, birincil oral keratinositleri yetişkin farelerden izole etmek ve kültüre etmek için çok az protokol oluşturulmuştur30,31,32. Bu çalışmada keratinositleri proliferatif veya kök hücre benzeri bir durumda tutmak için ticari bir tam kültür ortamı ve chelexed-FBS kullanılmıştır. Bu kültür sistemi, oral epitel kök hücrelerinin özelliklerini ve ilgili hastalıklarını daha iyi anlamak için moleküler ve biyokimyasal tahlillerde kullanılabilir.
Bu protokolde birkaç kritik adım yer almaktadır. İlk olarak, tripin konsantrasyonu ve kuluçka süresi sonraki kültürler için uygulanabilir hücreler üretmek için gereklidir. Oda sıcaklığında oda başlığında sürekli olarak %0,025 tripsin solüsyonu ve 16 saat kuluçka periyodu kullandık. Yeterli süre inkübe edilmezse, keratinositler dokudan düzgün bir şekilde ayrışmaz ve bu da daha düşük bir nihai hücre verimi ile sonuçlanır. İkincisi, hücre süspansiyonunun ikinci günde hafifçe pipetlemesi özellikle hücre canlılığını etkiler. Kazıma epitel tarafından hafifçe başlamalı ve doku örneği başına 10 dakikayı geçmemelidir. Son olarak, ilk izole hücre süspansiyonu fibroblastlar ve diğer hücre tiplerini içerir; bu istenmeyen hücreler genellikle sonraki kültürlerde kaybolmaya başlayacaktır.
Hücre izolasyonu ve kültürü sırasında potansiyel sınırlamalar belirlendi. Nadir durumlarda, fibroblastlar izolasyon işlemi sırasında kontamine olabilir ve fibroblastlar sonraki pasajlarda keratinositlerin büyümesini engelleyebilir (Şekil 2H). Kültürdeki bu tür kirlenmeyi ortadan kaldırmak için fibroblast büyüme inhibitörü içeren ticari bir ortam seçmek gerekir. Fare damağı ve diğer oral mukoza nispeten küçük boyutlara sahip olduğundan, bir fareden ilk hücre verimi düşük olabilir. Bu nedenle, kriyoprezervasyon aşamasına kadar bu protokolün tüm kültür süresi birincil cilt keratinositleri için bundan daha uzundur. İzole oral keratinositler en iyi 10 pasajda kullanılır, çünkü daha uzun kültür süreleri hücre özelliklerini değiştirebilir ve kök hücre sayısını azaltabilir.
Mevcut yöntem, fare oral keratinositlerinin sıkıca paketlenmiş, parke taşı morfolojisi sergilediğini ve proliferatif koşullar altında monolayer koloniler oluşturduğunu göstermiştir. Ayrıca bazal belirteçler α6-integrin, K14 ve kök hücre işaretleyici p63'ün yüksek ekspresyonlarını gösterdiler. Gelecekteki çalışmalarda, immünofluoresans lekelemesine ek olarak, bu hücrelerin doğasını daha da iyi anlamamızı sağlayacak olan oral keratinositlerin hücresel heterojenliğini ve saflığını doğrulamak için RNA-dizileme, RT-PCR ve batı leke analizleri kullanılacaktır.
2-3 pasajdan sonra oral keratinositler daha sonraki fonksiyonel deneylerde kullanılabilecek kadar kararlıydı. Daha da önemlisi, bu kültür protokolü gen nakavt, Cre-loxP ve tet-indüklenebilir sistemler de dahil olmak üzere transgenik fare çizgileriyle birleştirilebilir ve hücresel ve moleküler testlerde de kullanılabilir. Bu nedenle, mevcut protokol araştırmacılara oral keratinosit kök hücre biyolojisini daha fazla anlamak için kullanılabilecek temel ve verimli bir yöntem sunmaktadır.

Oral epitel, vücudu kimyasal veya fiziksel hasar ve bakteriyel ve viral enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çevresel streslerden korumada ilk bariyer görevi görür1,2. Oral mukoza, esas olarak fibroblastlar ve hücre dışı matristen oluşan lamina propria adı verilen keratinositler ve alttaki bağ dokusundan oluşan tabakalı skuamöz epitelin dış tabakasından oluşur. Fare oral mukozası geniş ölçüde üç alt tipe ayrılabilir: mastikatör (sert damak ve diş eti), özel (dorsal dil) ve astar (bukkal mukoza, ventral dil, yumuşak damak, dudaklar) mukoza2,3 (Şekil 1A). Oral epitel, mastikatör ve özel mukozada keratinize edilir ve astar mukozasında keratinize değildir. Anatomik konumuna rağmen, oral epitel cilt epidermisine benzer, çünkü çeşitli derecelerde farklılaşma ile sıkıca paketlenmiş epitel hücrelerinden oluşur: farklılaşmamış hücreler içeren bazal tabakalar; keratinize epitel oluşturan dikenli, granül ve kornişli katmanlar veya keratinize edilmemiş epitel oluşturan orta ve yüzeysel katmanlar4. Transgenik fare modelleri oral epitel kök hücrelerinin damak, bukkal mukoza, dil ve diş eti hücresel ve moleküler özelliklerinin incelenmesini kolaylaştırdı5,6,7,8,9,10,11. Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu öncelikle vivo fare deneylerinde kullanılır. Hücre kültürü sistemleri genellikle yerleşik ve verimli protokollerin eksikliği nedeniyle kullanılmamıştır.
Kök hücre düzenleyicilerinin moleküler ve biyokimyasal analizi, hücre bazlı tahliller ve ilaç taraması için in vitro kültür sistemi kullanılabilir. Şu anda, bazal keratinositlerin klinik ve araştırma amacıyla başarılı bir şekilde izole edilebildiği ve kültürlenebildiği cilt epidermisinin primer keratinosit kültürü için protokoller geliştirilmiştir12,13,14,15. 1980'de Hennings ve arkadaşları, kültür ortamında düşük kalsiyum konsantrasyonu (< 0.09 mM Ca2+) çoğalma ve hücrelerin farklılaşmamış bir durumda tutulmasını kolaylaştırdığını gösterdi. Daha yüksek kalsiyum seviyesi hücre farklılaşmasına ve çoğalma azalmasına neden oldu16. Daha sonra, yenidoğan ve yetişkin murine epidermal keratinositler için kültür metodolojileri oluşturulmuş ve in vitro çalışmalar için farklı genetik geçmişlere sahip çok sayıda fare modeline yaygın olarak uygulanmıştır17,18,19. Cilt ve oral epitel ortak özellikleri paylaşmakla birlikte, keratinizasyon durumlarında, ciro oranında, gen ifadesinde ve yara iyileşme yeteneklerinde de içsel farklılıklar gösterirler3,11,20,21,22,23,24,25,26.
İnsan oral keratinosit kültürü başarıyla gerçekleştirilmesine rağmen 27.28,29, fare oral keratinosit kültürü üzerine yapılan yayınlar30,31,32 hedef dokunun küçüklüğü ve hücrelerin cilt epidermal keratinositlere göre farklı özellikleri nedeniyle sınırlıdır. Bu protokol, fare birincil oral keratinositlerinin yalıtımını ve uzun vadeli kültür tekniklerini açıklar.

<table><tbody><tr><td>% 0.025 Tripsin / EDTA</td><td>Gibco</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>% 0.05 Tripsin / EDTA, fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0.4w / h% Tripan Mavisi çözeltisi</td><td>Wako</td><td>207-17081</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serolojik pipet</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>100 & mikro; m Naylon hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 mL steril konik tüp</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Hava örneklemeli pipet</td><td>Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Hücre kültürü kabı</td><td>Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>50 mL steril konik tüp</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Hücre kültürü kabı</td><td>Corning</td><td>353802</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu Doku Kültürü plakası</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu Kültür plakası (U alt)</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik 100x</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biocoat Kollajen I cellware 60mm çanak</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>Künt Forseps</td><td>AS ONE</td><td>1-8187-03</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td></td><td>Vetorphale</td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Corning</td><td>432002</td><td>Kriyojenik depolama</td></tr><tr><td>Pamuk</td><td>AS ONE</td><td>63-1452-97</td><td></td></tr><tr><td>Kapak fişleri 22 x 22 & mu; m kare</td><td>Matsunami Cam San.</td><td></td><td></td>C022221</tr><tr><td>Kriyojenik Flakon 1.2 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000-0012</td><td></td></tr><tr><td>Tanımlanmış Tripsin İnhibitörü (DTI)</td><td>Gibco</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-Tavşan IgG (H + L), Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-sıçan IgG (H + L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Eşek serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>EpiLife Tanımlanmış Büyüme Takviyesi (EDGS)</td> <td>Gibco</td><td>S0120</td><td></td></tr><tr><td>EpiLife, 60 ve mikro ile; M kalsiyum</td><td>Gibco</td><td>MEPI500CA</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>BRC Biyo Araştırma Merkezi</td><td>PRI13-3374</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-PDGF Reseptörü ve alfa;</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>AF1062</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Yarım kavisli forseps</td><td>BRC Biyo Araştırma Merkezi</td><td>PRI13-3376</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te</td><td>8100204</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>İris Makas</td><td>Muromachi Kikai</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td></td><td>Domitor</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Astellas İlaç</td><td></td><td>Dormicum</td></tr><tr><td>No.15 Tek Kullanımlık Neşter</td><td>Tüyü</td><td>219AABZX00136000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Serum Fizyolojik 1x, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-iyot</td><td>Y'nin Kare</td><td>872612</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-Sitokeratin 13 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-K14</td><td>BioLegend</td><td>905301</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-p63 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Raspatorium #14</td><td>BİR OLARAK</td><td>8-4599-01</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan ve alfa; 6-integrin</td><td>BD Biosciences</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td>581-81705</td><td></td></tr><tr><td>Tip I Kollajen kaplı 24 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>354408</td><td></td></tr><tr><td>Tip I Kollajen kaplı 60mm çanak</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>Tip I Kollajen kaplı 6 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>355400</td><td></td></tr></tbody></table>

yetişkin fare damak tadından birincil oral keratinositlerin İzolasyonu ve kültürü

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

Yıllardır, keratinositleri içeren çoğu çalışma insan ve fare derisi epidermal keratinositler kullanılarak yapılmıştır. Son zamanlarda, oral keratinositler benzersiz işlevleri ve özellikleri nedeniyle dikkat çekmektedir. Oral epitelin homeostazını korurlar ve rejeneratif tedavilerdeki uygulamalar için kaynak görevi ederler. Bununla birlikte, yetişkin farelerden oral primer keratinositler kullanan in vitro çalışmalar, verimli ve köklü bir kültür protokolünün olmaması nedeniyle sınırlı olmuştur. Burada, oral primer keratinositler yetişkin farelerin damak dokularından izole edildi ve chelexed-serum ile desteklenmiş ticari bir düşük kalsiyum ortamında kültürlendi. Bu koşullar altında keratinositler proliferatif veya kök hücre benzeri bir durumda muhafaza edildi ve pasajlar arttıktan sonra bile farklılaşmaları inhibe edildi. İşaretleyici ekspresyon analizi, kültürlü oral keratinositlerin bazal hücre belirteçlerini p63, K14 ve α6-integrin olarak ifade ettiğini ve K13 farklılaşma işaretleyicisi ve fibroblast belirteci PDGFRα için negatif olduğunu göstermiştir. Bu yöntem in vitro oral epitel kök hücre fonksiyonlarının incelenmesinde aşağı akış uygulamalarına uygun uygulanabilir ve kültlenebilir hücreler üretti.

Diseksiyon sürecine ve oral keratinositlerin yetişkin fare damak tadından izolasyonuna genel bakış Dissositli oral keratinositler yetişkin fare damak tadından toplandı ve özelleştirilmiş% 20 chelexed-FBS'de kültürlendi. Fare damağı sert damak ve yumuşak damaktan oluşur (Şekil 1C). Fare oral keratinositlerin izolasyonu prosedürü Şekil 1D'de özetlenmiştir. Damak dokusu, bir gecede 4 °C'de % 0.025 tripsin çözeltisinde kuluçkaya yatırılmadan önce antibiyotik-antimycotic çözelti içeren bir ortama aktarılır. Ertesi gün, damak dokusu trypsin inhibitör çözeltisi ve tam kültür ortamı ile eşit hacimlerde tedavi edilir. Daha sonra, dokular oral keratinositleri toplamak için cerrahi bir neşter bıçağı kullanılarak kazınır. Hücre süspansiyonu 100 μm hücre süzgecinden süzülerek santrifüj edilir. Hücreler daha sonra 2 mL tam kültür ortamı + chelexed-FBS içeren Collagen I kaplamalı 24 kuyu plakalarında tohumlanır.
Fare oral keratinositlerin başarılı izolasyonunun temsili sonuçları Primer oral keratinositler monolayer olarak büyüdü ve parke taşı morfolojisi gösterdi (Şekil 2). Küçük keratinosit kolonileri 3-5 günde görülebilirdi (Şekil 2A,B); bunlar büyüdü ve 1 haftalık inkübasyonda sıkı koloniler oluşturdu (Şekil 2C). Keratinosit kolonileri bazal keratinositlerin tipik morfolojik özelliklerini göstererek sağlıklı durumlarını gösterdiler. İnsan oral keratinositleri, 0.06 mM Ca2+16,28 içeren tam kültür ortamında birkaç pasaj için farklılaşmadı. İlk pasaj ilk kaplamadan yaklaşık 2 hafta sonra gerçekleştirildi (Şekil 2D). Daha sonraki pasajlarda keratinositler daha kısa bir kültür süresi ile istikrarlı bir büyüme sergilediler (Şekil 2E-G). İzolasyon işlemi sırasında önemli fibroblast kontaminasyonu meydana gelirse keratinositler büyümeyi durdurmuştur (Şekil 2H).
İzole fare oral keratinositler ekspres bazal hücre işaretleyicileri Primer oral keratinositlerin durumunu doğrulamak için keratin 14 (K14) ve α6-integrin34 bazal hücre belirteçleri kullanılarak immünostaining yapıldı. K14 ve α6-integrin kültleme sonrası keratinositlerde eksprese edildi (Şekil 3A,B). Hücreler ayrıca köklüklerini doğrulamak için kök hücre işaretleyici p63 ile boyandı. Erken geçiş (pasaj 4) ve geç geçiş (pasaj 7) hücreleri p63'ün tek tip ifadesini göstermiştir (Şekil 3C, D). Buna karşılık, yüksek kalsiyumla tedavi edilen keratinositler (2 gün boyunca 1.2 mM indüksiyon) azalmış p63 ekspresyonu (Şekil 3E) sergiledi ve bu da yüksek kalsiyum tedavisinin primer keratinositlerde kök hücre ile ilgili genleri baskıladığını gösteriyor16. Keratin 13 (K13) farklılaşma belirteci hem erken hem de geç pasajlarda nadir veya hiç ifade göstermemiş ve yüksek kalsiyum tedavisi altında anlamlı ekspresyon göstermiştir (Şekil 3F-H). Keratinosit kültüründe fibroblast kontaminasyon olasılığını test etmek için, fibroblast işaretleyici PDGFRα kullanılarak boyama fare embriyonik fibroblast (MEF' ler) ile karşılaştırıldığında aynı keratinosit seti ile gerçekleştirildi. Mef hücrelerinde gözlenen yüksek ekspresyonla karşılaştırıldığında keratinosit kültüründe PDGFRα ifadesi yoktu (Şekil 3I-3L). Bu sonuçlar, bu protokolün bazal keratinositleri başarıyla izole edebileceğini ve bu hücreleri farklılaşmamış durumda tutabileceğini gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig01.jpg"> Şekil 1: Fare oral keratinositlerinin diseksiyon prosedürüne ve izolasyonuna genel bakış. (A) Fare ağız boşluğunun şematik gösterimi. (B) Damakları parçalamak ve fare oral keratinositlerini izole etmek için kullanılan aletler. (C) Fare damağı Brightfield görüntüsü. Ölçek çubuğu: 100 μm. (D) Protokolün özeti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig02.jpg"> Şekil 2: Fare oral keratinositlerinin başarılı izolasyonunun temsili sonuçları. (A-G) İzolasyondan sonra 3 gün (A), 5 gün (B), 1 hafta (C) ve 2 hafta (D) kültürde kültürlü primer oral keratinositlerin zaman kursu görüntüleri. Birinci (E), ikinci (F) ve üçüncü (G) pasajlardan sonra fare oral keratinositlerinin morfolojileri gösterilmiştir. (H) Fare oral keratinosit kültüründe fibroblast kontaminasyonu örneği. Ölçek çubuğu: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig03.jpg"> Şekil 3: İzole fare oral keratinositler bazal hücre işaretleyicilerini ifade eder. (A-B) 4. geçişte K14 (A; kırmızı) ve α6-integrin (B; yeşil) immünofluoresan boyamanın temsili görüntüleri. (C-E) 4 (C), pasaj 7 (D) ve yüksek kalsiyum tedavisinde (E) p63 (yeşil) immünoresan boyamanın temsili görüntüleri. (F-H) 4 (F), geçiş 7 (G) ve yüksek kalsiyum tedavisinde (H) K13 (yeşil) immünostaining görüntüleri. (I-L) PDGFRα (kırmızı) pasaj 4 (I), pasaj 7 (J), yüksek kalsiyum tedavisi (K) ve MEF'lerin (L) immün şok edici görüntüleri. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyanmıştır. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Mevcut protokol, yetişkin fare damak tadından elde edilen oral keratinositlerin izolasyonu ve kültürünü açıklar. İmmünasyon kullanılarak yapılan bir değerlendirme yöntemi de rapor edilir.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Son zamanlarda, oral keratinositler benzersiz özelliği nedeniyle dikkat çekmektedir. Fare oral keratinositlerin aşağı akış uygulamaları için uygun kök hücre benzeri bir durumda kült haline getirilmiş bir protokol sunuyoruz. Fare oral keratinosit kültürü ve cilt keratinositten farklı karakteristik.Bu protokolde primer fare oral keratinositini başarıyla izole ettik ve uzun vadeli bir kültür tekniği geliştirdik. Bu kültür sistemi, oral basilar kök hücrenin özelliğini ve ilgili hastalıklarını daha iyi anlamak için moleküler ve biyokimyasal tahlillerde kullanılabilir. Yetişkin bir C57BLK6J fareden ödün ettikten sonra, ağız çevresindeki saçları bir tıraş makinesiyle çıkarın ve makas kullanarak yanaklardan her iki taraftaki çeneye doğru kesin.Daha sonra, ağzı geniş açmak ve pamuklu çubuk kullanarak herhangi bir kanı emmek için tokaları kullanın, ardından ağzın içini% 10 povidon iyot içeren bir pamuklu çubukla silerek paleti dezenfekte edin. Fare paletini hasat etmek için, önce cerrahi bir neşter bıçağı kullanarak, maksiller dişlerin palet tarafı boyunca tam kalınlıklı marjinal bir kesi yapın. Daha sonra bir raspatorium kullanarak, tüm paleti dikkatlice parçalara ayırın.Palet dokusunu antibiyotik ve antimykotiklerle desteklenmiş dört mililitre tam ortam içeren 15 mililitrelik bir tüpe hızlı bir şekilde aktarın. Dokuları inkübasyona hazır olana kadar buzda tutun. Laminer akış davlumbazında, dokuları antibiyotikler ve antimykotiklerle dört mililitre tam ortam içeren 60 milimetrelik bir tabağa aktarın.Daha sonra kısa künt tokalar ve neşter bıçağı kullanarak, dokulardan herhangi bir kanı hafifçe çıkarın ve dokuları tam ortamla 10 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, dokuları antibiyotik ve antimycotics ile desteklenmiş dört mililitre% 0.025 tripsin içeren 35 milimetrelik bir tabağa aktarın. Epitel yüzeyi aşağı bakacak şekilde dokuları yerleştirin ve kültür davlumbazında oda sıcaklığında 16 saat kuluçkaya yatırın.Bir gecede tripsin sindiriminden sonra, dokuyu tripsin çözeltisinden çıkarmak ve epitel yüzeyi yukarı bakacak şekilde tripsin inhibitörü çözeltisi içeren 60 milimetrelik bir tabağa aktarmak için bir çift künt forseps kullanın. Daha sonra, paletin kenarınaps ile tutunarak, alttaki lamina propria'daki epitel tabakasını hafifçe kazımak için neşter bıçağını kullanın. Dokulardan maksimum miktarda epitel hücresi toplamak için, dokuyu dört mililitre tam orta ile 60 milimetrelik başka bir çanağa aktarın ve daha önce gösterildiği gibi kazımayı tekrarlayın.Daha sonra, 50 mililitrelik konik tüpün üzerine steril bir 100 mikron hücre süzgeci yerleştirin. Ve steril bir pipet kullanarak, yüzeyini ıslatmak için süzgeçe iki mililitre tripsin çözeltisi aktarın. Daha sonra bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 60 milimetrelik tabakta birkaç kez karıştırın ve hücreleri 100 mikron hücre süzgecinden filtreleyin.Hücre sayısını saymak için, 50 mikrolitre trippan mavisi çözeltisine hücre süspansiyonunun 15 mikrolitresini ekleyin, ardından hücre trippan mavisi karışımının 10 mikrolitresini bir hemositometreye aktarın ve hücre sayısını sayın. Daha sonra, hücre süspansiyonu santrifüj, süpernatan çıkarmak ve tüpe Chelex FBS içeren tam orta iki mililitre ekleyin. Beş mililitrelik pipet kullanarak birkaç kez titrat yaparak hücre peletini yeniden dirildi.Daha sonra bir fareden beşinci hücrelere iki ila beş kez kollajen tip bir ile önceden kaplanmış 24 kuyulu bir kuyuya plakalayın ve hücreleri ortamı değiştirmeden iki gün boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Primer oral keratinositler monolayer olarak büyüdü ve parke taşı morfolojisi gösterdi. Küçük keratinosit kolonileri üç ve beş gün sonra görülebilirdi.Bir haftalık kuluçkadan sonra, bu koloniler büyüdü ve sıkı koloniler oluşturdu. İlk pasaj ilk kaplamadan iki hafta sonra gerçekleştirildi ve daha sonraki pasajlarda keratinositler daha kısa bir kültür süresi ile istikrarlı bir büyüme sergiledi. İzolasyon işlemi sırasında önemli fibroblast kontaminasyonu meydana gelirse keratinositler büyümeyi durdurdu.Kültlemeden sonra keratinositler keratin 14 ve alfa6-integrin ifade etti. Erken ve geç geçiş hücreleri P63'ün saplarını doğrulayan tek tip ifadesini gösterdi. Bununla birlikte, yüksek kalsiyum ile tedavi edilen keratinositler, yüksek kalsiyum tedavisinin kök hücre ile ilgili genleri baskıladığını gösteren P63 ekspresyonda azalma gösterdi.Diferansiasyon belirteci keratin 13 erken ve geç pasajlarda nadir veya hiç ifade göstermedi, ancak yüksek kalsiyum tedavisinde anlamlı ifade gösterdi. Fibroblast belirteci PDGFR alfa, keratinosit kültüründe bu protokolün bazal keratinositleri başarıyla izole edebileceğini ve bu hücreleri farklılaşmamış durumda tutabileceğini gösteren ifade edilmemiştir. Bindirme epidural taraftan başlamalı ve doku örneği başına 10 dakika olmalıdır.Ayrıca genel olarak, hücrelerin pipetlenerek daha iyi hücre canlılığı için önemlidir. İki veya üç geçiş sonra, oral keratinosit daha fazla fonksiyonel deney için stabil hale gelir. Daha da önemlisi, bu protokol hücresel ve moleküler test in vitro için transgenik fare ömrü ile birleştirilebilir.Son çalışma oral basilar kök hücrenin dinamiklerini ve heterojenliğini bildirmektedir. Bu yöntem ağız kök hücre biyolojisinin çalışmasını kolaylaştıracak ve ağız hastalıklarının daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.

isolation-culture-primary-oral-keratinocytes-from-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, insan derisinin epidermal tabakasının en belirgin hücreleri olan keratinositlerin, enzimatik sindirim ve mekanik bozma yöntemlerinin bir kombinasyonu kullanılarak izolasyonu anlatılmaktadır. Bu yöntem, seçici bir büyüme ortamı kullanarak keratinositlerin diğer cilt hücresi tiplerine göre tercihli büyümesine yardımcı olur.

İnsan Derisi Keratinosit İzolasyonu: Deri Örneklerinden Primer Keratinositlerin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

Bu videoda, bir murin dilinden epitel hücrelerinin izolasyonunu anlatıyoruz. Bu hücreler, hücre kolonilerine yol açmak için daha fazla kültürlenebilir.

Murin Dil Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü: Dil Epitel Hücrelerini Fare Modelinden İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Bu video, bir fare modelinden damak dokusunu incelemek için cerrahi bir prosedürü göstermektedir.

Erişkin Murin Modelinden Damak Dokusu Diseksiyonu: Erişkin Farenin Ağız Boşluğundan Sert Damak ve Yumuşak Damak Elde Etmek İçin Cerrahi Bir İşlem

Bu videoda, bir murin dilinden circumvallate papilla (CVP) epitelinin izolasyonunu açıklıyoruz.

Fare Modelinden Circumvallate Papilla (CVP) Epitelinin İzolasyonu: CVP Epitelini Fare Dilinden Ayırmak İçin Enzimatik Bir İşlem

Sürekli büyüyen fare kesici diş epitel kök hücreler (DESCs) diş dokularının yenilenmesini eğitim için bir model sağlar. Sürekli ve güvenilir bir şekilde kesici bu hücrelerin elde edilmesi ve in vitro ile genişletilmesi için sağlam bir sistem burada bildirilmektedir.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Epidermal keratinositler fonksiyonel bir cilt bariyeri oluştururlar ve dış çevresel hakaretlere karşı ana savunmanın ön saflarında yer alırlar. Burada, neonatal ve erişkin fare derisinden epidermal keratinositlerin izolasyonu ve birincil kültürü için yöntemleri ve keratinositlerden gelen terminal farklılaşmayı ve UVB tetiklemeli enflamatuar yanıtın indüksiyonunu tarif ediyoruz.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Bu protokolün amacı, moleküler biyoloji, biyokimya, floresan aktif hücre ayrıştırma ve primer in vitro kullanımlar (örneğin, klojenojenik) gibi çeşitli downstream uygulamaları için yetişkin farelerin dorsal deriden epidermal keratinositleri izole etmektir. keratinositler).

Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

İki boyutlu (2D) büyüme ve yara onarım testlerinin hızlandırılmış görüntülemesi için primer fare embriyonik palatal mezenkimal hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca hücre akışı oluşumunu ve yönlü hareketliliği belirlemek için zaman atlamalı görüntüleme verilerinin analizi için metodoloji sağlıyoruz.

Kolektif Hareket Niteliklerini Analiz Etmek için Birincil Fare Embriyonik Palatal Mezenkim Hücrelerinin İzolasyonu ve Zaman Atlamalı Görüntülenmesi

Burada geleneksel yönteme Kaya inhibitörü Y-27632 eklenerek insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için değiştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem daha kolay, daha az zaman alıcıdır, kök hücre özelliklerini geliştirir ve hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için daha fazla sayıda yüksek potansiyelli epitel hücresi üretir.

Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Burada, fare stria vascularis'ten birincil marjinal hücrelerin izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için bir protokol sunuyoruz ve koklear yan duvar bozukluklarını incelemek için oksidatif stres ve hücresel yaşlanma için in vitro modeller oluşturulmuştur.

Stria vascularis'in Primer Marjinal Hücrelerinin Yenidoğan Farelerden İzolyasyonu ve Kültürü

Öğrenin, yetişkin fare damak dokusundan birincil oral keratinositlerin izolasyonu ve uzun süreli kültürü için bu protokolü. Kök hücre benzeri özelliklerini koruyarak oral hastalıkların anlaşılmasına katkı sağlar.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Daha fazla video keşfet