G-protein Bağlantılı Reseptörleri (GPCR) içeren Model Lipid Membranlarının yapımı

Bu protokol, farmakolojik olarak önemli G proteini bağlantılı reseptör sınıflarından biri olan insan 1A serotonin reseptör proteininin (5-HT1AR) yeniden uzlaştırılması için burada açıklandığı gibi, integral membran proteinlerini (IMP'ler) dev unilamellar lipid veziküllerine (GUVs) dahil etmek için güçlü ve genelleştirilebilir bir teknik olarak agarose şişmesini kullanır.

İntegral membran proteinlerinin kendi ortamlarında incelenmesi, plazma zarının karmaşıklığı nedeniyle zor olmuştur. Dev unilamellar lipid vezikülleri veya GUV'lar, biyomembran özelliklerini incelemek için en belirgin platformlardan biridir ve çeşitli fizyolojik durumları taklit etmek için tasarlanmıştır. Bu protokol, hidrojel şişmeden sonra, spontan bir bütünleşmeye dayalı protein dahil GUV'ler imal etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. GUV'leri imal etmek için geleneksel yöntemler integral membran proteini birleştirilmesi için genelleştirilemez. Bu yöntemler genellikle düşük verim, metodolojik olarak karmaşık ve geçicidir, geniş protein sınıfları için geçerli değildir. Öte yandan, bu protokol GUV'larda fonksiyonel integral membran proteinlerini dahil etmek için esnek, sağlam ve basit bir yöntemi temsil eder.Bunu, proteini içeren bir hidrojel iskele hazırlayarak ve üzerine ince bir lipit tabakası biriktirerek başardık. Burada sunulan örnekte, G protein bağlantılı reseptör veya GPCR'yi GUV'lara dahil ettik.Tüm sistemin yeniden sulanması üzerine, GUV'lar hidrojel yüzeyinden düzgün yönlendirilmiş GPCR'ler içeren membranla tomurcuklandı.Tüm reaktiflerin oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Bu süre zarfında, kapak kaymalarını metanol içine yerleştirerek ve 40'ta 30 dakika sonicating yaparak temizleyin