Laodelphax striatellus Tükürük Koleksiyonu için İki Katmanlı Membran Sandviç Yöntemi
27 Ağustos 2021
Mevcut protokol, yapay bir ortam kullanarak delici emen böceklerden yeterli tükürük toplama yöntemini açıklar. Bu, böcek tükürüğü toplamak ve böcek besleme davranışı ve vektör kaynaklı virüs iletimi üzerinde tükürük fonksiyonunu incelemek için uygun bir yöntemdir.
Yapay besleme ve tükürük toplama, böcek tükürüğündeki efektörleri tespit etmek için doğrudan bir yöntem sağlar. Ancak, bu daha önce ayrıntılı olarak açıklanmamıştır. Bu protokol saprofitik böceklerden tükürük toplanması için etkilidir.
Ek olarak, yapay bir diyet olarak sadece sakkaroz içeren ortam kullandığımız için basit bir tekniktir. Saprofitik böceklerin tükürüğü, beslenme davranışına fayda sağlamak ve patojenleri iletmek için konağın bağışıklık sistemine karşı etkileyebilir. Böcek davranışı ve böcek kemik yolu araştırması için kullanılabilecek bu ilaç.
Bu, gerçekleştirilmesi gereken basit bir yöntemdir. Bununla birlikte, bu, daha fazla araştırma için tükürük toplandığı için temiz deneysel ortamın montajını göstermektedir. Yapay diyet için% 5 sakkaroz çözeltisi hazırlayarak başlayın ve bakteriyel kontaminasyonu ve safsızlıkları gidermek için çözeltiyi 0.22 mikron filtreden filtreleyin.
Yaklaşık 200 küçük kahverengi bitki hunisi larvasını bir beslenme odasına sokmadan önce üç ila beş saat boyunca aç bırakın. Daha sonra, cam silindirleri besleme odaları olarak hazırlamak için, deneysel böcekleri tanıtmadan önce odanın bir açık ucunu bir parafin zarı ile örtün, ardından böcekleri cam silindire aktarın ve odanın diğer ucunu gerilmiş parafin zarı ile örtün. Membran üzerine 200 mikrolitre yapay diyet ekleyin, ardından sıvıyı başka bir gerilmiş parafin zarı tabakası ile örtün.
Son olarak, odayı alüminyum folyo ile örtün ve ucu ışığa maruz kalan yapay diyet cihazı ile bırakın. 24 saat sonra, böcekleri hareketsiz hale getirmek için silindiri dört santigrat derecede soğutarak SBPH tükürüğü toplayın, ardından dış filmi ortaya çıkarın ve yapay diyeti steril bir pipet kullanarak 1,5 mililitre steril tüpler halinde toplayın. Toplanan tükürüğü analize kadar eksi 80 santigrat derecede tutun.
Daha sonra, iç zarı 50 mikrolitre taze yapay diyetle üç kez yumuşak bir şekilde pipetle çalkalayarak durulayın ve yapay yıkama diyetini 1,5 mililitre steril tüpler halinde toplayın. Üç durulamadan sonra, iç zara taze yapay diyet ekleyin ve üzerine taze gerilmiş bir parafin zarı yerleştirin. Son olarak, toplanan örnekleri mikropları ve diğer kirleticileri gidermek için 0,22 mikron filtre ünitesinden filtreleyin.
Toplu tükürük örneklerini 500 mikrolitre, 10 kilodalton santrifüj filtreye aktarın. Örneği santrifüjle. Süpernatantı toplayın ve son hacmi 100 mikrolitreye getirin.
Toplanan tükürüğün konsantrasyonunu ölçmek için UV görünür spektrofotometreyi açın ve kaideleri çift damıtılmış suyla üç kez yıkayın. Ekrandaki seçenekleri aşağıdaki sırayla seçin, proteinler, protein A280. Mililitre başına bir miligrama eşit tip ve bir absorbans ünitesi seçin.
Ardından temel düzeltme, 340 nanometre için kutuyu işaretleyin. Ardından, %5 sakkaroz sulu çözeltiden oluşan iki mikrolitreyi boş olarak yükleyin, ardından ekranın altındaki Boş'a dokunun. Son olarak, standartları belirledikten sonra, toplanan tükürüğün iki mikrolitresini yükleyin ve protein konsantrasyonu kaydedin.
% 5 sakkarozla beslenirken, SBPH'nin% 80'inden fazlası ilk dört gün hayatta kaldı. Bununla birlikte, beşinci günden itibaren mortalite hızla% 40'a yükseldi ve yedinci günde SBPH'nin yarısından azı hayatta kaldı. Bir SDS sayfa analizi, RSV ile enfekte SBPH tükürüğünden alınan konsantre tükürük örneklerinin% 5 sakkaroz negatif kontrolünden çok daha fazla protein içerdiğini göstermiştir.
Enfekte olmayan ve virülifer böcekler olan RSV kapsid proteininin tespiti için batılı bir blot analizinde. RSV kapsid proteini virülifer numunesinde başarıyla tespit edildi, LssgMP gen ürününe karşı tasarlanmış bir antikor, enfekte olmayan ve virülifer örneklerde 78 kilodalton protein tespit etti ve LssgMP'nin tükürük proteini olduğunu gösterdi. Farklı dokulardaki LssgMP transkript seviyelerinin QRT PCR analizi, tükürük bezinde Lssg transkript seviyelerinin tüm vücuttan ve bağırsaktan 20 kat daha yüksek olduğunu ve tükürük bezinde LssgMP'nin spesifik ifadesini doğruladığını göstermiştir.
Deneysel böcekleri odaya sokmadan önce aç bırakmak, tükürük koleksiyonumuzun verimliliğini sağlamak için gereklidir. Ayrıca, toplanan numunedeki mikrobiyal kontaminasyonu azaltmak için her 24 saatte bir yapay bir ortam toplanmalı ve değiştirilmelidir. Bu teknik, patojenlerin iletiminde tükürüğün işlevini incelemek için doğrudan bir yöntem sağlar.
Ek olarak, böcek patojen konak etkileşimi çalışmaya yardımcı olabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, basit bir yapay ortam kullanarak delici-emici böceklerden tükürük toplamak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, böcek tükürük fonksiyonunun ve bunun beslenme davranışı ile virüs iletimindeki rolünün araştırılmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Böcek fizyolojisi
- Vektör biyolojisi
- Patojen transmisyonu
Arka Plan
- Böcek tükürüğünün beslenme ve bağışıklık üzerindeki rolünün anlaşılması
- Tükürük etkilerinin konakçı yanıtları üzerindeki araştırması
- Önceki yöntemlerin etkili tükürük toplama için yeterli detaya sahip olmaması
Kullanılan Yöntemler
- Tükürük toplama için yapay besleme teknikleri
- Model organizmalar olarak küçük kahverengi bitki cicada larvaları
- Sükroz çözeltisi ve steril tekniklerin kullanımı
Temel Sonuçlar
- Tükürük toplama, RSV ile enfekte örneklerde daha yüksek protein içeriği olduğunu göstermiştir
- Tükürük bezinde LssgMP'nin spesifik ekspresyonu doğrulanmıştır
- Yöntem verimliliği, toplama öncesinde böceklerin aç bırakılmasıyla artırılmıştır
Sonuçlar
- Protokol, patojen iletimini incelemek için böcek tükürüğünü etkili bir şekilde toplar
- Bulgular, biyoloji araştırmalarında böcek-konak etkileşimlerinin anlaşılmasını geliştirir
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Böcek tükürük bileşenlerini anlamak, erken keşif aşamasındaki vektör kaynaklı patojen iletim çalışmalarındaki risklerin azaltılması açısından kritik öneme sahiptir. Bu yöntem, delici-emici böceklerden tükürüğün doğrudan toplanmasına ve analiz edilmesine olanak tanıyarak antiviral ve vektör kontrol araştırmalarında hedef doğrulamasını ve mekanistik risk azaltma çalışmalarını destekler. Konak-patojen etkileşimlerini etkileyen tükürük efektörlerinin değerlendirilmesi için tekrarlanabilir bir sistem sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Patojen iletimini bozmaya yönelik potansiyel hedefler olarak tükürük proteinlerinin incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fonksiyonel tarama için böcek tükürüğü toplamaya yönelik standartlaştırılmış bir yaklaşım sunar.
- Bilimsel Değer: LssgMP gibi aday efektörlerin tükürük beziye özgü ekspresyonunu doğrulayarak biyolojik risk azaltmayı destekler.
Tarama & Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Altta yer alan biyokimyasal ve immünolojik analizler için uygun, saflaştırılmış tükürük örnekleri üretir.
- Operasyonel Değer: Örnek saflığını ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için filtrasyon ve konsantrasyon adımlarını içerir.
- Bilimsel Değer: Analiz geliştirme amacıyla, tükürükteki RSV kapsid proteini gibi patojen kaynaklı bileşenlerin tespit edilmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Tükürük proteinlerini vektör yetkinliği ile ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç keşfini kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Patojen edinimi sırasında tükürük kompozisyonundaki değişiklikleri izlemek için boylamsal örnekleme imkanı sağlar.
- Bilimsel Değer: İletim engelleyici stratejilerin risklerini azaltmak için böcek-konak-patojen arayüzlerinin preklinik modellemesini destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef belirlemeden preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürecine, özellikle vektör aracılı patojen yayılımını durdurmaya odaklanan projelere uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Beslenme ve patojen iletimindeki tükürük efektör fonksiyonlarına yönelik hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşik veya antikor tarama kampanyaları için standardize edilmiş, miktarlandırılabilir tükürük örnekleri sağlar.
- Analitikler: Karşılaştırmalı analiz için UV spektrofotometrisi ile protein miktarlandırmasını ve immunoblotting ile saptamayı mümkün kılar.
- Translasyonel Araştırma: Tükürük beziye özgü gen ekspresyonunu, patojen iletim modellerindeki fonksiyonel çıktılarla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla vektör türü ve patojen genelinde tükürük çalışmalarına yönelik yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: İlgili biyolojik bağlamda tükürük biyobelirteçlerini doğrulayarak hedef seçimindeki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Steril diyet hazırlığı, kontrollü besleme ve standartlaştırılmış örnek işleme yoluyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: İletim engelleyici müdahalelerin erken değerlendirilmesine olanak tanıyarak geç evre başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Tükürük mekanizması doğrulamasına dayalı olarak vektör kontrol hedeflerinin risk ayarlı önceliklendirilmesine bilgi sağlar.
Uygulama Hususları
- Doğrulama için böcek yetiştiriciliği, steril teknik ve tükürük bezi diseksiyonu konularında uzmanlık gerektirir.
- UV-Vis spektrofotometre, santrifüj ve immünoblotlama ekipmanlarına erişime bağlıdır.
- Tutarlı açlık protokolleri ve diyet değişim programları için ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Diğer böcek türlerine adaptasyon, yapay diyetin ve membran geçirgenliğinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik kısıtlama: Tükürük verimi böcek sağkalım oranlarına göre değişiklik gösterebilir, bu da yeterli numune hacmi için grup bazlı işlemeyi zorunlu kılar.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:02
Preparation of Feeding Chamber and Artificial Diet
2:00
Collection of Small Brown Planthopper (SBPH) Saliva
2:56
Concentration of the Collected Saliva
3:58
Results: Artificial Feeding and Saliva Collection from Laodelphax striatellus
5:21
Conclusion
