Tek parçacıklı Cryo-elektron Mikroskopisi için Kullanıcı Dostu, Yüksek Verimli ve Tam Otomatik Veri Toplama Yazılımı
July 29th, 2021
Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi, yüksek verimli otomatik veri toplama için uygun bir yazılım paketi ve kullanıcı dostu bir işlem hattı gerektirir. Burada, düşük doz koşullarında vitrifiye biyomoleküllerin veri toplanması için tam otomatik görüntü alma yazılım paketi, Latitude-S ve pratik bir boru hattı uygulamasını sunuyoruz.
Otomatik Veri Toplama Yazılımı, biyolojik makromoleculess'ın yapısal karakterizasyonu için büyük miktarda kriyo verisi toplamak için son derece gereklidir. Otomatik Veri Toplama Yazılımı paketi, patojen biyolojisi ile doğrudan ilişkili olan çeşitli biyolojik makromoleculess'in yapısını karakterize etmek için kullanılmıştır. Örneğin, mikobakteri, HIV ve SASCO 2.
Başlangıç olarak, başlat menüsünden DigitalMicrograph'a tıklayarak Latitude-S Otomatik Veri Toplama Yazılımı'nı başlatın. Ardından, Teknik Yöneticisi'ni ve ardından Tek Parçacıklı Otomatik Veri Toplama için Latitude-S simgesini seçin. Önceki oturum ayarlarını temel alan bir oturum oluşturmak için, paletteki önceki oturuma göre onay kutusunu işaretleyin ve sonra yeni düğmeyi seçin veya varolan bir oturuma devam etmek için devam düğmesine basın.
Tamamen yeni bir oturum başlatmak için paletteki yeni sekmeye tıklayın. Devam edilecek oturumu içeren klasörü seçin ve verileri kaydetmek için klasörü seçin. Ardından, ayar simgesine tıklayın ve görüntülenen yönetilen durum araştırma kutusunda, durum ekleyin, TEM koşulu, kamera koşulu ve görüntü veya stok seçeneğini ayarlayın.
Ardından, kaydetme ayarlarını açmak için durumu adlandırın veya durum kurulum özetini açın. Ardından, Atlas durum paletine tıklayarak Atlas durumunu yapılandırın ve büyütme, aydınlatma koşulları ve kamera pozlama süresi parametrelerini ayarlayın ve bir sonraki duruma geçmek için yanındakine tıklayın. Ardından ızgara durumu paletini tıklatarak ızgara durumunu yapılandırın, mikroskop görüntüleme optikleri, aydınlatma koşulları ve kamera pozlama süresi parametrelerini ayarlayın ve sonrakine tıklayın.
Delik paletini tıklayarak delik durumunu yapılandırın ve görüntüleme optiklerini, aydınlatma koşullarını, binning ve kamera pozlama süresi parametrelerini ayarlayın. İleri'ye tıklayıp odak paletini tıklayarak bir sonraki odak durumunu yapılandırın ve görüntüleme optikleri, aydınlatma koşulları, binning ve kamera pozlama süresi için mikroskop ayarlarını yapın. Ardından deliğin yakınındaki amorf karbon alanına odaklanın ve bir sonraki duruma geçmek için yanındakine tıklayın.
Veri paletini tıklatarak veri durumunu yapılandırın ve mikroskop ayarları için parametreleri ayarlayın, sonra İleri'ye tıklayın. Verilen sekmede netleme değerlerinin aralığını ve adım boyutunu belirten odak yapılandırma paletine tıklayın ve sonraki adıma geçmek için sonraki düğmeye basın. Izgaradaki gerekli özelliklere odaklanın ve yakalama düğmesine tıklayın.
Ardından kırmızı çapraz işareti farklı durumların her görüntüsünde aynı unsura yerleştirin. Odak, Veri ve Delik durumları ile başlayın, çünkü görüş alanı Atlas ve Grid durumlarından daha büyüktür. Ardından, kırmızı çapraz işareti aynı özelliğe konumlandırmak için Atlas ve Grid durumlarını yakınlaştırın.
Beş farklı durum arasındaki konumları ve uzaklığı hesaplamak ve pozisyonları ve uzaklıkları çıktı penceresine yansıtmak için hesapla düğmesini tıklatın. Yakalama paletine tıklayın ve gereksinime göre ızgaranın tamamını veya bir kısmını kapsayacak şekilde Atlas'ın boyutunu seçin. Atlas'ı yakalamak için Atlas'ta gezinin ve buz kalınlığına göre ızgara karesini seçin.
İstediğiniz ızgara kareleri seçildikten sonra, zamanlama düğmesine tıklayın ve her ızgara karesi yakalanırken ızgara karesindeki döşemelerin dolduğunu gözlemleyin. Zamanlama düğmesi tıklatıldıktan sonra, deliğin konumunu ekleyerek ızgara karesinde temsili bir delik seçin. Delik görüntüsü alındıktan sonra, veri ve odak konumlarını tanımlayın ve düzeni şablon olarak kaydedin.
Otomatik bul'a tıklayın, delik boyutunu girin ve çapına göre delikleri otomatik olarak bulmak için programdaki bul düğmesine tıklayın. Izgara karesinden delikleri ve buz kirlenmesini gidermek için yoğunluğu ayarlayın. Otomatik bul aracılığıyla seçilen ve sarı işaret araçlarını ekledikten sonra enlem görevlerinde zamanlama düğmesine tıklayın.
CISTEM yazılımı kullanılarak hareket düzeltilmiş mikrografların ilk manuel taramasına göre, verilerin çoğunun istenen sinyal aralığında olduğu bulunmuştur. Ayrıca, defocus aralıklarında toplanan görüntüler de cisTEM tarafından manuel olarak kontrol edildi. Başak parçacıkları, yapısal görselleştirme için 2D sınıf ortalamalarını hesaplamak için manuel olarak seçildi, bu da şiddetle önerildi, ancak ilgili veri kümesi kullanılarak yüksek çözünürlüklü yapısal karakterizasyon mümkün oldu.
3D sınıflandırması, Spike Protein'in yukarı açık onayda 1RBD'ye ve aşağı yakın onayda diğer tüm RBD'ye sahip olduğunu gösterdi. Spike Proteininin 1RBD açık onayları C1 simetrisi kullanılarak yeniden inşa edildi. Spike Protein haritası yan üst ve alt görünümlerde temsil edilir.
Ve EM haritası, yan zincirlerin daha iyi görselleştirilmesi için atomik yapı ile donatılmıştır. RBD aşağı yakın onayları C3 simetrisi ve gösterildiği gibi atomik yapı ile donatılmış çivi 3D rafine model ve EM haritası ile rafine edilmiştir. Ve S2 alt alanı olarak tanımlanan Spike Proteininin ara onayı, bireysel amino asit kalıntılarının yan zincirlerini gösteriyordu.
Sonuçlar, Latitude-S'in biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü cryo EM verilerini toplayabileceğini öne sürdü. Bu Otomatik Veri Toplama Yazılımı, verileri otomatik olarak toplamak için başka herhangi bir elektron mikroskopi sistemi için kullanılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, kriyo-elektron mikroskobu için otomatik veri toplama yazılımı olan Latitude-S'in uygulamasını ele almaktadır. Biyomoleküllerin yüksek verimli veri toplaması için kullanıcı dostu bir yöntemin önemini vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kriyo-elektron mikroskobu
- Yapısal biyoloji
- Otomatik veri toplama
Arka Plan
- Tek partikül kriyo-elektron mikroskobu, yapısal karakterizasyon için kritik öneme sahiptir.
- Verimli veri toplaması için otomatik yazılım gereklidir.
- Vitrifiye biyomoleküller, düşük doz görüntüleme koşullarını gerektirir.
- Patojen biyolojisi önemli bir uygulama alanıdır.
Çalışmanın Amacı
- Görüntü toplama için tamamen otomatik bir yazılım paketi sunmak.
- Veri toplama için pratik bir yöntem oluşturmak.
- Kriyo-elektron mikroskobu iş akışlarının verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Otomatik veri toplama için Latitude-S yazılımının kullanılması.
- Önceki ayarlara dayalı oturumların yapılandırılması.
- Biyomoleküller için düşük doz görüntüleme teknikleri.
- Çeşitli biyolojik makromoleküllerin karakterizasyonu.
Ana Sonuçlar
- Yüksek verimli veri toplama için Latitude-S'in başarılı uygulanması.
- Miykobakteriyum ve HIV gibi patojenlerle ilgili yapıların etkili karakterizasyonu.
- Otomatik veri toplama için düzenli bir iş akışı.
- Yazılımın düşük doz koşullarında yeteneğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Latitude-S, kriyo-elektron mikroskobunun verimliliğini önemli ölçüde artırır.
- Otomatik veri toplama, yapısal biyoloji araştırmaları için esastır.
- Yazılım, önemli biyolojik makromoleküllerin çalışmasını kolaylaştırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Automated data acquisition in cryo-EM enables high-throughput structural characterization of pathogen-associated macromolecules, supporting target validation and lead identification in early discovery. The Latitude-S software streamlines workflow efficiency, reducing manual intervention and increasing data reproducibility for structural biology teams. This capability enhances predictive confidence in mechanistic de-risking by providing reliable, quantitative structural data for infectious disease targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution structural visualization of pathogen proteins like SARS-CoV-2 spike.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying conformational states and functional mechanisms of macromolecular targets.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by delivering atomic-resolution data that informs target druggability and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating consistent, high-quality cryo-EM datasets.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through fully automated imaging under controlled low-dose conditions.
- Scalability: Enables screening readiness and platform reuse, as demonstrated by acquisition of ~3,000 movie images in a single 48-hour session.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery through preclinical validation by providing structural insights into pathogen biology.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by identifying conformational states (e.g., 1-RBD up/open and all RBD down/closed) that inform functional assays.
- Risk-Adjusted Advancement: Connects structural data to decision-making for target prioritization in antiviral development programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, where structural data informs hit-to-lead progression and mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling structural characterization of macromolecular complexes involved in pathogen entry and replication.
- Screening: Describes assay readiness through automated, high-throughput data collection that yields quantitative, reproducible outputs for downstream analysis.
- Analytics: Highlights measurements such as defocus values, image quality metrics, and 3D classification outputs that enable comparison of structural states and conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via structural models that inform functional assays and biomarker alignment for pathogen targets.
- Enterprise Reuse: Frames the software as a reusable capability across multiple targets and projects, reducing redundancy in data acquisition setup.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in structural studies of pathogenic macromolecules.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data acquisition across sessions and users.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early structural insights.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on high-confidence structural data.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in cryo-EM operation, software configuration, and structural data interpretation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including 200 keV cryo-TEM, direct electron detector, and computing resources for image processing.
- Cross-team standardization requirements for session templates, parameter settings, and data naming conventions.
- Adaptation considerations across model systems, including vitrified samples of varying size, symmetry, and stability.
- Practical limitations include dependency on sample quality, ice thickness, and initial manual screening for motion correction and particle picking.
