Name: İskemik Kalpte Gen Tedavisinin Etkinliğini Değerlendirmek İçin Büyük Hayvan Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Öğrenin iskemik kalp hastalığında gen tedavisinin güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmek için büyük hayvan modeli kullanımını. Bu yöntem klinik öncesi araştırmalar için güvenilir bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Maria Hedman, Tiina Laitinen, Tomi Laitinen, Pekka Poutiainen, Annika Viren ve Severi Sormunen'e Kuopio Üniversitesi Hastanesi'nde 15O-PET görüntülemeye yardım ettikleri ve izin verdikleri için teşekkür eder; ve Ulusal Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden Heikki Karhunen, Minna Törrönen ve Riikka Venäläinen, hayvan çalışmalarındaki yardımlarından dolayı.
Bu çalışma Finlandiya Akademisi, ERC ve CardioReGenix EU Horizon 2020 hibesinden gelen hibelerle desteklenmektedir.

Burada sunulan deneyler yaklaşık 10 haftalık dişi evcil domuzlar kullanılarak gerçekleştirilmekte ve Finlandiya'daki Hayvan Deneyi Kurulu tarafından onaylanmaktadır. Protokolün başında 30-40 kg ağırlığındaki hayvanlar, insanlar için mümkün olduğunca aynı prosedürel ekipman ve görüntüleme yöntemlerine izin verir. Kronik iskemi, gen transferinden 14 gün önce indüklenir ve gen transferinden sonraki takip süresi, kullanılan viral vektöre bağlıdır. Çalışma protokolü Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokol, adenoviral veya AAV aracılı gen terapisi enjeksiyonlarını gerçekleştirmek için kullanılabilir. Örnek toplama zamanı, kullanılan viral vektöre bağlı olarak transgen ekspresyon zirvesine ayarlanmalıdır. Örneğin, adenoviral gen transferleri yapılırken, örnek toplama zamanı gen transferinden 6 gün sonrasına ayarlanır.
1. İlaç tedavisi
<ol><li>Ölümcül ventriküler aritmileri önlemek için günlük 200 mg amiodaron ve 2.5 mg bisoprolol dozu uygulayın. İlaç iskemi operasyonundan 1 hafta önce başlar ve takibe kadar günlük olarak devam edilir.</li>
	<li>Ek olarak, stent yerleştirildikten sonra akut stent içi trombozu önlemek için iskemi operasyonundan 1 gün önce hayvanlara peroral dozlarda klopidogrel (300 mg) ve asetilsalisilik asit (300 mg) uygulayın.</li>
	<li>Ventriküler aritmileri önlemek için iskemi operasyonunun başlangıcında hayvanlara intravenöz olarak 100 mg lidokain ve 2.5 mL (246 mg / mL) MgSO4 uygulayın.</li>
	<li>Enfeksiyon profilaksisi için her ameliyatın başında kas içi sefuroksim enjeksiyonu (500 mg) uygulayın.</li>
	<li>30 mg enoksaparin, iskemi operasyonlarının başlangıcında intravenöz olarak ve trombozun önlenmesi için operasyon prosedüründen sonra deri altından uygulanır.</li>
	<li>Anestezi ve analjezi için, 15 mg / kg / s oranında 1.5 mL atropin, 6 mL azaperon (40 mg / mL), propofol 20 mg / mL ve 10 μg / kg / s oranında fentanil 50 μg / mL uygulayın. İlaç dozajları her domuz için aynıydı. Doz uygulaması için yerel hayvan kullanım kılavuzlarına bakın.</li>
	<li>Tüm operasyonlar sırasında hayvanları uyuşturun. Tüm operasyonlar steril bir teknik kullanılarak steril bir ortamda yapılmalıdır.</li>
</ol>2. Transtorasik ekokardiyografi
<ol><li>Saptanabilir herhangi bir perikardiyal sıvıyı değerlendirmek ve miyokard suşunu belirlemek için iskemi operasyonu, gen transferi ve ötenaziden önce transtorasik ekokardiyografi yapın.</li>
	<li>Mitral kapak seviyesinde, papiller kas ve apikal seviyelerde parasternal kısa eksenli görünümlere erişmek için dönüştürücüyü domuzun koltuk altındaki üçüncü veya dördüncü interkostal boşluğa yerleştirin (Video 1). Dönüştürücünün işaretleyicisi, domuzun sternumuna işaret etmelidir. Bir klibi kaydetmek için, Al tuşuna basın.</li>
</ol>3. Floroskopik kılavuzluk altında endovasküler operasyonlar
<ol><li>İskemi operasyonu, gen transferi ve doku toplama işlemlerinden önce koroner anjiyografi sonrası sol ventrikül sinüs görüntülemesi yapılır.</li>
	<li>Operasyonun hazırlanması
	<ol><li>Domuzları 1.5 mL atropin ve 6 mL azaperon intramüsküler enjeksiyonu ile sakinleştirerek operasyonlara hazırlanın.</li>
		<li>Sedasyondan sonra, sırasıyla 15 mg / kg / s ve 10 μg / kg / s dozlarında domuzlara anjiyografik prosedürler için genel propofol ve fentanil anestezisi indükleyin. NOT: Domuzlar tüm prosedür boyunca uyuşturulur.</li>
		<li>Entübasyon ve ventilatör ile ventilasyonu destekleyin ve EKG ve solunum parametreleri gibi hayati fizyolojik parametreleri izleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Tanıtıcı kılıf yerleşimi
	<ol><li>Kardiyolojide standart uygulama olarak tüm ameliyatlar için sağ femoral artere tanıtıcı kılıf yerleştirin. Femoral arteri izlemek için ultrason kullanın ve bir giriş iğnesi (18 G) ile delin. NOT: İntramyokardiyal gen transferleri için 8F tanıtıcı kılıf ve diğer tüm işlemler için 6F kılıf kullanın. Arteri iplik haline getirmek için kılıfın kılavuz telini iğneden geçirin ve iğneyi çıkarırken kılavuz teli sabit tutun.</li>
		<li>Giriş kılıfını kılavuz tel boyunca yerleştirin ve yerleştirildiğinde, kılavuz teli çıkarın ve koroner vazodilatasyonu indüklemek için domuza 1.25 mg dil altı dinitrat uygulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Koroner anjiyografi
	<ol><li>İskemi operasyonu, gen transferi ve doku toplanmasından hemen önce koroner anjiyografi yapın. Anjiyogramlar için gerekli makineler Şekil 2'de gösterilmiştir.</li>
		<li>Sağ koroner arteri ve sol yükselen koroner arteri görüntülemek için iyot kontrast madde ile floroskopik kılavuzluk altında 6F kateter kullanın (Video 2).</li>
	</ol></li>
	<li>İstirahat ve dobutamin stres altında sol ventrikül sinüs görüntüleme
	<ol><li>Bir oto-enjektör kullanarak 5F pigtail kateteri aracılığıyla sol ventriküle 21 mL'lik bir iyot kontrast madde bolusu uygulayın. İlk olarak, bolus süresini 3 s ve toplam hacmi 21 mL olarak ayarlayın. Ardından, Tek ve Evet tuşlarına basın.</li>
		<li>Anjiyografik iş istasyonunun ölçüm yazılımı ile ejeksiyon fraksiyonunu hesaplayın. Hesaplamayı gerçekleştirmek için, söz konusu görüntünün Ventriküler Analizi'ni seçin. Biri diyastol, diğeri sistol olmak üzere bir zaman dilimi seçmek için görüntüyü kaydırın. Her zaman diliminin ventriküler ana hatlarını çizmek için bir araç seçin. NOT: Yazılım şimdi Simpson'ın yöntemiyle ejeksiyon fraksiyonunu ve strok hacmini hesaplamaktadır. Ejeksiyon fraksiyonu ölçümü dinlenme sırasında ve dobutamin kaynaklı stres altında gerçekleştirilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Stres görüntüleme
	<ol><li>Dobutamin kaynaklı stres görüntüleme için 10 μg / kg / dak'dan 20 μg / kg / dak'ya yükselen dozlarda, 160 bpm hedef kalp atış hızına ulaşılana kadar intravenöz olarak doz dobutamin. Ardından, sinema görüntülemeyi gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>İskemi operasyonu
	<ol><li>Kronik miyokard iskemisini indüklemek için gen transferinden 14 gün önce sol koroner artere (LAD) bir darboğaz stenti yerleştirin. Darboğaz stenti yerleştirildikten sonra, darboğaz stentinin doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol ederek koroner kan akışını kısıtlayın. NOT: Darboğaz stent, bir dilatasyon kateteri üzerine yerleştirilir ve koroner kan akışını azaltmak için darboğaz şeklinde oluşturulmuş bir politetrafloroetilen tüp ile kaplanmış çıplak metal bir stentten oluşur9.</li>
	</ol></li>
	<li>Stent boyutunun tanımlanması
	<ol><li>Anjiyografik iş istasyonundaki otomatik ölçüm yazılımını kullanarak anjiyogramdaki sol çıkan koroner arterin boyutuna göre stent boyutunu 3.0/3.5/4.0 x 8 mm olarak seçin (Video 3)12.</li>
	</ol></li>
	<li>Stent yerleştirme
	<ol><li>Sol koroner artere bir bobin yerleştirin ve darboğaz stentini LAD'ye kaydırın ve distal olarak ilk diyagonale yerleştirin.</li>
		<li>Stent-lümen oranı 1.3 olan bir in-deflatör kullanarak stentin arterdeki nominal basınca şişirin ve darboğazı yerine sabitleyin. Ek 15 saniye sonra, stenti söndürün ve ekipmanı arterden geri çekin. NOT: Darboğaz stentinin anjiyogram ile doğru yerleştirildiğini onaylayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. PET görüntüleme
NOT: Gen transferinden bir gün önce, dinlenme ve stres 15O etiketli radyosu PET / BT taramaları yapın (hastane ortamı ve radyolojik teknisyenler gerektirir).
<ol><li>Referans görüntüleme
	<ol><li>Dinlenme ve stres görüntülemeden önce bilgisayarlı tomografi (BT) taramaları yapın. Zayıflama düzeltmesi için BT bilgilerini kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>15O-etiketli radyosu görüntüleme
	<ol><li>800 MBq 15H2O bolus kullanarak dinlenme ve stres görüntülemesi gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Stres görüntüleme
	<ol><li>12 dakikalık uygun bir radyoaktif bozunmadan sonra 800 MBq 15O-su bolusu ile stres görüntülemesi yapın. NOT: Hiperemi, daha önce tarif edildiği gibi adenozin (200 μg / kg / dak intravenöz) ile indüklenir12.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Gen transferi
<ol><li>Elektroanatomik haritalama
	<ol><li>Koroner anjiyografi ve fonksiyonel ölçümlerden (ekokardiyografi, LV sinesi görüntüleme) sonra elektroanatomik haritalamaya geçilir.</li>
		<li>Floroskopik kılavuzlukta femoral kılıf yoluyla sol ventriküle bir haritalama kateteri verin. NOT: Elektroanatomik haritayı oluşturmak için haritalama kateteri ile sol ventrikülün etrafında yaklaşık 100-150 nokta kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>Elektroanatomik haritanın bitirilmesi
	<ol><li>Sol ventrikülün daha güvenilir bir elektroanatomik haritasını sağlamak için aykırı değerleri silin.</li>
		<li>Bunu, haritanın Klip Düzlemleri'ni seçerek yapın ve ventrikül şeklini oluşturan noktalardan farklı noktaları silin. Ardından, harita görünümü için Yörüngeler'i seçin ve nokta kaydı sırasında yatay olarak hareket eden noktaları silin. NOT: Kalan noktaların sol ventrikülü kapladığından emin olun ve gerekirse daha fazla nokta kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>Gen transferi enjeksiyonları
	<ol><li>Floroskopik kılavuzluk altında femoral kılıf yoluyla sol ventriküle intramiyokardiyal enjeksiyon kateteri sokulmalıdır. Enjeksiyon iğnesi uzunluğunu 3 mm'ye ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>İntramiyokardiyal enjeksiyonlar için kriterler
	<ol><li>Elektroanatomik haritalama sistemi ile gen transferlerini yönlendirin ve enjeksiyonları sol ventrikülün canlı fakat hipokinetik bölgelerine hedefleyin. NOT: Uygulanabilirlik için, kriter olarak 5 mV'un üzerinde tek kutuplu bir voltaj kullanın. Hipokinezi için, mümkün olduğunca düşük, en az% 12'nin altında ancak tercihen% 6'nın altında13 yerel doğrusal kısaltma (LLS) seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>İntramyokard enjeksiyonları
	<ol><li>30 s boyunca, vektör materyalini seçim noktasına enjekte edin (adım 5.4) ve sol ventriküle geri akışı önlemek için geri çekilmeden önce enjeksiyon iğnesini miyokardın içinde 5 saniye daha tutun.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Ötenazi ve örnek toplama
NOT: Sırasıyla 3.4.1 ve 3.5.2 adımlarında açıklanan koroner anjiyografi ve ejeksiyon fraksiyonu ölçümlerinden sonra, anestezi uygulanan domuza intravenöz olarak 50 mL doymuş potasyum klorür uygulayın.
<ol><li>Kalbin perfüzyon fiksasyonu
	<ol><li>Kalbi göğüs boşluğundan toplayın. Su ile durulayın. Aort kapağının üzerine 18 G'lik bir iğne yerleştirin ve iğneyi bir perfüzyon pompasına takın. Kalbi 750 mL% 1 paraformaldehit (PFA) ile perfüze edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Örnek toplama
	<ol><li>Keskin bir mutfak bıçağı kullanarak kalbi 1 cm kalınlığında dilimler halinde dilimleyin. Gen transfer alanından alınan örnekleri %4 PFA ve sıvı azot halinde toplayın. NOT: Negatif kontrolleri toplamak için, sol ventrikülün arka duvarından bir kontrol örneği toplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Güvenli doku toplama
	<ol><li>Akciğer, karaciğer, böbrek, dalak ve yumurtalıklar gibi uzak dokulardan örnekler toplayın. Numuneleri %4 PFA ve sıvı azot içine alın.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Örnek depolama
<ol><li>Numuneleri boyamak üzere 4 °C'de 48 saat boyunca %4 PFA'da saklayın. NOT: PFA'yı günlük olarak taze bir sıvı ile değiştirin.<ol><li>48 saat sonra, PFA'yı deiyonize suda% 15 sakkaroz ile değiştirin. Numuneleri parafin bloklara gömmeden önce en az 24 saat saklayın. Çıtçıtlı dondurulmuş numuneler -70 °C'de saklanır.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+age-sex+specifc+mortality+for+264+causes+of+death%2C+1980-2016%3A+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national age-sex specifc mortality for 264 causes of death, 1980-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).</li>
<li>Knuuti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2019+ESC+Guidelines+for+the+diagnosis+and+management+of+chronic+coronary+syndromes%3A+The+Task+Force+for+the+diagnosis+and+management+of+chronic+coronary+syndromes+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes: The Task Force for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 41 (3), 407-477 (2020).</li>
<li>Davies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+refractory+angina%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Management of refractory angina: An update.</a> European Heart Journal. 42 (3), 269-283 (2021).</li>
<li>Ylä-Herttuala, S., Baker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+gene+therapy%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular gene therapy: Past, present, and future.</a> Molecular Therapy. 25 (5), 1095-1106 (2017).</li>
<li>Lähteenvuo, J., Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+cardiovascular+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in cardiovascular gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 28 (11), 1024-1032 (2017).</li>
<li>Hammond, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+gene+transfer+of+adenylyl+cyclase+6+in+patients+with+heart+failure%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Intracoronary gene transfer of adenylyl cyclase 6 in patients with heart failure: A randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 1 (2), 163-171 (2016).</li>
<li>Hartikainen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+intramyocardial+VEGF-DDNDC+gene+transfer+increasesmyocardial+perfusion+reserve+in+refractory+angina+patients%3A+A+phase+I%2FIIa+study+with+1-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Adenoviral intramyocardial VEGF-DDNDC gene transfer increasesmyocardial perfusion reserve in refractory angina patients: A phase I/IIa study with 1-year follow-up.</a> European Heart Journal. 38 (33), 2547-2555 (2017).</li>
<li>Laakkonen, J. P., Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+cardiovascular+gene+therapy+and+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in cardiovascular gene therapy and vascular biology.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 518-524 (2015).</li>
<li>Roth, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+left+circumflex+Ameroid+constrictor+placement+on+adrenergic+innervation+of+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of left circumflex Ameroid constrictor placement on adrenergic innervation of myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 253 (6), Pt 2 1425-1434 (1987).</li>
<li>White, F. C., Carroll, S. M., Magnet, A., Bloor, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+collateral+development+in+swine+after+coronary+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Coronary collateral development in swine after coronary artery occlusion.</a> Circulation Research. 71 (6), 1490-1500 (1992).</li>
<li>Liu, C. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord-derived+mesenchymal+stromal+cells+improve+left+ventricular+function%2C+perfusion%2C+and+remodeling+in+a+porcine+model+of+chronic+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells improve left ventricular function, perfusion, and remodeling in a porcine model of chronic myocardial ischemia.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (8), 1004-1013 (2016).</li>
<li>Rissanen, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bottleneck+stent+model+for+chronic+myocardial+ischemia+and+heart+failure+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">The bottleneck stent model for chronic myocardial ischemia and heart failure in pigs.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1297-1308 (2013).</li>
<li>Greenberg, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doppler-derived+myocardial+systolic+strain+rate+is+a+strong+index+of+left+ventricular+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Doppler-derived myocardial systolic strain rate is a strong index of left ventricular contractility.</a> Circulation. 105 (1), 99-105 (2002).</li>
<li>Grönman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+myocardial+viability+with+%5B15O%5Dwater+PET%3A+A+validation+study+in+experimental+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Assessment of myocardial viability with [15O]water PET: A validation study in experimental myocardial infarction.</a> Journal of Nuclear Cardiology. , 1-10 (2019).</li>
<li>Tarkia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+68Ga-labeled+tracers+for+PET+imaging+of+myocardial+perfusion+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 68Ga-labeled tracers for PET imaging of myocardial perfusion in pigs.</a> Nuclear Medicine and Biology. 39 (5), 715-723 (2012).</li>
<li>Gyöngyösi, M., Dib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+value+of+3D+NOGA+mapping+in+ischemic+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic value of 3D NOGA mapping in ischemic heart disease.</a> Nature Reviews. Cardiology. 8 (7), 393-404 (2011).</li>
<li>Shim, J., Al-Mashhadi, R. H., Sørensen, C. B., Bentzon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+of+atherosclerosis+-+New+tools+for+persistent+problems+in+cardiovascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Large animal models of atherosclerosis - New tools for persistent problems in cardiovascular medicine.</a> Journal of Pathology. 238 (2), 257-266 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu protokolün zaman noktaları, kullanılan viral vektöre göre değiştirilebilir. Ayrıca immünohistolojik analizler terapötik gene göre seçilebilir. Gerekirse protokole daha fazla zaman noktası ve uç nokta eklemek de mümkündür.
Bu protokol, başarılı olmak için gerekli olan ve daha sonra düzeltilmesi imkansız olan aşamalardan oluşur. İlk olarak, eğer uygun iskemi indüklenemezse, hayvan diğer prosedürlerden ve analizlerden dışlanmalıdır. Yöntemlerin ve görüntülemenin standardizasyonu, sonuçların za...

Koroner arter hastalığı, dünya çapında mortalite ve hastalık yükünün büyük bir kısmından sorumludur1. Güncel tedavi stratejileri perkütan girişimler, farmakolojik tedavi ve bypass cerrahisidir2. Bununla birlikte, bu mevcut terapötiklerin ilerlemesine rağmen, birçok hasta refrakter anjinadan muzdariptir ve bu da yeni tedavi yaklaşımlarına olan karşılanmamış ihtiyacın altını çizmektedir3. Gen tedavisi aracılı terapötik anjiyogenez bu hasta grubunu hedefleyebilir.
Miyokard gen tedavisi çoğunlukla farklı viral vektörler, en yaygın olarak replikasyon eksikliği olan adenovirüs4 kullanılarak verilir. Terapötik genler olarak, çeşitli anjiyojenik büyüme faktörleri kullanılır. En çok çalışılan anjiyojenik büyüme faktörleri, vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörleri (VEGFR'ler) ve bunların ko-reseptörleri 5 yoluyla anjiyojenik sinyalleşmelerine aracılık eden vasküler endotelyal büyüme faktörleridir(VEGF'ler). Birkaç klinik çalışma, kardiyak gen tedavisinin yararını ve güvenliğini kanıtlamış ve bu yeni tedavi yöntemini iskemik kalp hastalıklarının tedavisinde gerçekçi bir seçenek haline getirmiştir 6,7. Bununla birlikte, bu kavramın kliniklere girmeden önce büyük hayvan modellerinde test edilen terapötik genlerin ve viral vektörlerin geliştirilmesine hala ihtiyacı vardır. Domuz, kalbi insan kalbine çok benzediği için sıklıkla laboratuvar hayvanı olarak kullanılmıştır. Bir domuzun kardiyovasküler sisteminin büyüklüğü, insanlarda kullanılana benzer kateter icatlarının kullanılmasına izin verir. İnsanlar için mevcut tüm görüntüleme yöntemleri domuzlarda kullanılabilir8.
Kronik iskemi için birkaç büyük hayvan modeli vardır. En sık kullanılanı ameroid konstriktör modeli 9,10,11'dir. Bu yöntemin dezavantajı, koroner vaskülatüre erişmek için torakotomi gerektiğinden invazivliktir. Daha önce grubumuzda kronik miyokard iskemisi için mini invaziv darboğaz stent modeli geliştirilmiştir12. Bu yöntem bu makalede miyokard iskemisini indüklemek için de kullanılmıştır.
Ultrasonografinin kullanılabilirliği, görüntüleme yönteminin yaşına rağmen önemli ölçüde gelişmiştir. Örneğin, miyokard suşu hala yeniliği nedeniyle araştırma kullanımındadır. Miyokard suşu, kalbin kasılma fonksiyonundaki değişiklikleri geleneksel M-modu ejeksiyon fraksiyonu ölçümünden daha iyi yansıtır13. Böylece, burada büyük hayvan modelinde, miyokard suşu ölçümü kullanılır. Kalbin fonksiyonunu değerlendirmek için, anjiyografi sırasında sol ventrikülün sineksi görüntülemesi ile kalp debisi de ölçülür. Kardiyak debi, stres altında miyokard fonksiyonunu değerlendirmek için hem istirahatte hem de dobutamin kaynaklı stres altında ölçülür.
Kalp fonksiyonunun ölçümlerine ek olarak, miyokard perfüzyonu hakkında bilgi, terapötik anjiyogenezi amaçlayan gen terapisi çalışmalarında esastır. Bu hayvan modelinde, miyokard perfüzyonunu ölçmek için altın standart olduğu için hayvanlar 15 O etiketli radyosu pozitron emisyon tomografisi (15H2O-PET) ile görüntülenmektedir. 15H2O-PET daha önce iskemik domuz kalbi14'ün perfüzyonunu ölçmek için doğrulanmıştır.
Bu nedenle, yukarıda belirtilen yöntem ve modaliteler, iskemik kalpte gen tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için mükemmel bir bakış açısı oluşturmaktadır.

<table><tbody><tr><td>% 1 PFA</td><td>VWR</td><td>VWRC28794.295</td><td>Paraformaldehit tozundan hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>%15 sükroz</td><td>VWR</td><td>VWRC27480.294</td><td>Katı sükrozdan hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>%4 PFA</td><td>VWR</td><td>VWRC28794.295</td><td>Paraformaldehit tozundan hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>5 F pigtail kateter</td><td>Cordis</td><td>534-550S</td><td></td></tr><tr><td>6 F kateter AR2</td><td>Cordis</td><td>670-112-00</td><td></td></tr><tr><td>6 F giriş kılıfı</td><td>Cordis</td><td>504-606X</td><td></td></tr><tr><td>8 F giriş kılıfı</td><td>Cordis</td><td>504-608X</td><td></td></tr><tr><td>Asetilsalisilik asit</td><td></td><td></td><td>Değişen üretici</td></tr><tr><td>Amiodaron</td><td></td><td></td><td>Değişen üretici</td></tr><tr><td>Anjiyografik istasyon</td><td>GE Healthcare Anjiyolaboratuvar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>seti</td><td>M&ouml; Anjiyo laboratuvarımızın ihtiyaçları için tasarlanmış lnlycke</td><td></td><td>, steril örtüler, kaplar ve swablar içerir</td></tr><tr><td>Bisoprolol</td><td></td><td></td><td>Değişken üretici</td></tr><tr><td>Sefuroksim</td><td></td><td></td><td>Değişken üretici</td></tr><tr><td>Clopidogrel</td><td></td><td></td><td>Değişken üretici</td></tr><tr><td>Coroflex Mavi stent</td><td>B.Braun Medical</td><td>5029012</td><td>Katalog numarası stent boyutuna bağlıdır</td></tr><tr><td>Kırışık forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siklotron</td><td>GE Sağlık</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dobutamin</td><td></td><td></td><td>Değişken üretici</td></tr><tr><td>Elektroanatomik haritalama sistemi</td><td>Biyolojik Dağıtım Sistemleri, Johnson & Johnson şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enoksaparin</td><td></td><td></td><td>Değişen üretici</td></tr><tr><td>Fentanil</td><td></td><td></td><td>Değişen üretici</td></tr><tr><td>İntramiyokardiyal enjeksiyon kateteri</td><td>Johnson & Johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İyot kontrast madde</td><td>Iomeron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mutfak bıçağı</td><td></td><td></td><td>Değişen üretici</td></tr><tr><td>Lidokain</td><td></td><td></td><td>Değişen üretici</td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td></td><td></td><td>Değişken üretici</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>Değişen üretici</td></tr><tr><td>İğne 18 G</td><td>Cordis</td><td>12-004943</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon pompası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PET-CT tarayıcı</td><td>Siemens Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Politetrafloroetilen tüp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td></td><td></td><td>Değişen üretici</td></tr><tr><td>Neşter no 11</td><td>VWR</td><td>SWAN0503</td><td></td></tr><tr><td>Dil altı dinitrat</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrason makinesi</td><td>Philips</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İskemik kalpte gen tedavisinin etkinliğini değerlendirmek İçin büyük hayvan modeli

Large Animal Model for Evaluating the Efficacy of the Gene Therapy in Ischemic Heart

Koroner arter hastalığı tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önemli nedenlerinden biridir. Mevcut tedavilerin ilerlemesine rağmen, koroner arter hastalığı hastalarının önemli bir kısmı semptomatik kalmaktadır. Gen terapisi aracılı terapötik anjiyogenez, miyokard perfüzyonunu iyileştirmek ve semptomları hafifletmek için yeni bir terapötik yöntem sunmaktadır. Farklı anjiyojenik faktörlerle gen tedavisi az sayıda klinik çalışmada incelenmiştir. Yöntemin yeniliği nedeniyle, miyokard gen tedavisinin ilerlemesi tezgahtan başucuna kadar sürekli bir yoldur. Bu nedenle, güvenlik ve etkinliği değerlendirmek için büyük hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Büyük hayvan modeli orijinal hastalığı ve kliniklerde kullanılan son noktaları ne kadar çok tanımlarsa, klinik çalışmalardan elde edilen sonuçlar o kadar öngörülebilir olur. Burada, iskemik domuz kalbindeki gen tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için büyük bir hayvan modeli sunuyoruz. Ultrason görüntüleme ve 15H2O-PET gibi klinik olarak ilgili görüntüleme yöntemlerini kullanıyoruz. İstenilen bölgeye gen transferlerini hedeflemek için elektroanatomik haritalama kullanılır. Bu yöntemin amacı: (1) kronik koroner arter hastalığını taklit etmek, (2) kalbin hipoksik bölgelerinde terapötik anjiyogenezi indüklemek ve (3) ilgili sonlanım noktalarını kullanarak gen tedavisinin güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmektir.

İskemi operasyonunun başarısı bu protokol ile koroner anjiyogram ile ve gen doğumuna geçmeden önce transtorasik ultrason ile hipokinetik alanın belirlenmesi ile doğrulanabilir (Şekil 1). Koroner oklüzyonun durumu koroner anjiyogram ile değerlendirilebilir ve elektroanatomik haritalama iskemik ve kış uykusuna yatan alanları sağlar.
Gen tedavisinin etkinliği, çevresel suş, ejeksiyon fraksiyonu ve miyokard perfüzyonu 15H2O-PET ile ölçülerek anal...

İskemik kalp hastalığı için miyokard gen tedavisi, gelecekteki terapötikler için büyük umut vaat etmektedir. Burada, iskemik kalpte gen tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için büyük bir hayvan modeli sunuyoruz.

İskemik Kalpte Gen Tedavisinin Etkinliğini Değerlendirmek İçin Büyük Hayvan Modeli

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a ...

Bu protokolde kullanılan yöntemler ve görüntüleme modaliteleri, klinik çalışmalara geçmeden önce iskemik kalpte gen tedavisinin güvenilirliği ve etkinliğinin mükemmel bir görüntüsünü oluşturmaktadır. Bu tekniğin temel avantajları, iskemi modelinin düşük invazivliği, aynı zamanda gen terapisinin kalbin hipokinetik ancak hala uygulanabilir bölgelerine kesin olarak hedeflenmesidir. Saptanabilir herhangi bir perikardiyal sıvıyı değerlendirmek ve miyokard suşunu belirlemek için iskemi operasyonu, gen transferi ve ötenaziden önce transtorasik ekokardiyografi yaparak başlayın.Dönüştürücüyü, mitral kapak seviyesinde, papiller kas ve apikal seviyelerde parasternal kısa eksen görünümlerine erişmek için domuzun sternumuna işaret eden bir işaretleyici ile domuzun koltuk altının altındaki üçüncü veya dördüncü interkostal boşluğa yerleştirin. Ardından bir klibi kaydetmek için acquire tuşuna basın. İskemi ameliyatından hemen önce koroner anjiyografinin yapılması için, sağ koroner arteri, sol yükselen koroner arteri ve sol ön inen arteri görüntülemek için iyot kontrast madde ile floroskopik kılavuzluk altında 6-F kateter kullanın.Otoenjektörde sinema görüntülemesi için, bolus süresini üç saniyeye ve toplam hacmi 21 mililitreye ayarlayın ve ardından 5-F pigtail kateteri aracılığıyla sol ventriküle iyot kontrast madde uygulamak için tek ve evet tuşlarına basın. İstirahatte hayvanın sine-görüntülemesini yapın ve daha sonra stres indüksiyonu için intravenöz olarak dobutamin ve artan dozlar uygulayın. Dakikada 160 atımlık hedef kalp atış hızına ulaşıldığında, sine, görüntüleme yapar ve pigtail kateterini çıkarır.Ejeksiyon fraksiyonunu hesaplamak için ölçüm yazılımını açın, söz konusu görüntünün ventriküler analizini seçin. Biri diyastolde, diğeri sistolde olmak üzere bir zaman dilimi seçmek için görüntüyü kaydırın ve ardından her zaman diliminin ventriküler ana hatlarını çizmek için bir araç seçin. Kronik miyokard iskemisini indüklemek için, gen transferinden 14 gün önce, sol koroner artere bir bobin yerleştirin ve darboğaz stentini sol koroner artere kaydırın ve stentleri distal olarak ilk diyagonale yerleştirin.Darboğazı yerine sabitlemek için stent-lümen oranı 1.3 olan bir indeflatör kullanarak stentleri arterdeki nominal basınca kadar şişirin. Ek bir 15 saniye sonra, stentin söndürülmesi, ekipmanın arterden geri çekilmesi ve anjiyografi ile darboğaz stentinin doğru yerleştirilmesini sağlayın. Floroskopik kılavuzluk altında anjiyografi ve fonksiyonel ölçümlerden sonra, elektro anatomik haritalama için femoral kılıf aracılığıyla sol ventriküle bir haritalama kateteri sokunur ve sol ventrikülden en az 100 puan toplanır ve bir noktayı onaylamak için kabul et'e tıklayın.Son haritada, uygulanabilirlik için, kriter olarak beş milivoltun üzerinde tek kutuplu bir voltaj kullanın. Hipokinezi için, mümkün olduğunca düşük, en az% 12 kadar düşük, ancak tercihen% 6'nın altında yerel bir doğrusal kısaltma seçinHayvanı ötenazi yaptıktan sonra, kalbi göğüs boşluğundan toplayın. Hasat edilen kalp durulandıktan sonra, aort kapağının üzerine 18 gauge'lik bir iğne yerleştirin ve iğneyi bir perfüzyon pompasına takın.Kalbi 750 mililitre% 1 paraformaldehit ile perfüze edin. Kalbi bir santimetre kalınlığında dilimlemek için keskin bir bıçak kullanın ve gen transfer alanından örnekleri% 4 paraformaldehit ve sıvı azot halinde toplayın. Numuneleri% 4 paraformaldehit içinde dört santigrat derecede 48 saat boyunca boyamak üzere saklayın.Gen tedavisinin etkinliği, 15O-su PET taraması ile çevresel suş, ejeksiyon fraksiyonu ve miyokard perfüzyonu ölçülerek analiz edildi. Doku örnekleri, kalbi elektro anatomik haritayla karşılaştırarak doğrudan gen transfer alanından toplanabilir. Transgen ekspresyonu ve terapötik anjiyogenez, Beta-galaktosidaz boyaması sonrası pozitif hücre sayısı analiz edilerek immün histolojik analiz ile ve trombosit/endotel hücre adezyon molekülü-1 boyaması sonrası miyokard kılcal bölgesi analiz edilerek değerlendirildi.Darboğaz stentinin anjiyogram yoluyla yerleştirildiğini doğrulamak ve gen transfer alanından örnek almak önemlidir, bu da kalbi elektroanatomik haritayla karşılaştırarak doğrulanabilir. Genel olarak, tüm ölçümleri en tekrarlanabilir şekilde yapmak çok önemlidir.

large-animal-model-for-evaluating-efficacy-gene-therapy-ischemic

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Iskemik kalp yetmezliği tedavisi için gen transferi yöntemi miyokard infarktüsü domuz modeli kullanılarak açıklanmıştır. Basit ve tekrarlanabilir bir yöntem bize kolayca çeşitli gen transferlerinin etkinliğini değerlendirmek için çok basit ve tekrarlanabilir bir yol sağlar.

Klinik öncesi Model İskemik Kalp Yetmezliği Gen Transferi

Bu protokol reperfüzyon ile sol ön inen arter (LAD) bir 90 dakika kapalı göğüs koroner balon oklüzyon kullanarak domuz miyokard infarktüsü (Mİ) modeli anlatılmaktadır. Ayrıca, bu tür kalp fonksiyonu, hemodinamikler, mikrovasküler direnci ve enfarkt boyutu gibi birçok parametrelerde için protokol de sunulmaktadır.

Domuzlar miyokard enfarktüsü ve Fonksiyonel Sonuç Değerlendirmesi

Bu iletişim kuralının amacı bir domuz modelinde bir koroner arter etrafında gecikmeli kısıtlayıcı aygıtı (bir ameroid yılanı) yerleşimini göstermektir. Bu cihaz yeni tanı görüntüleme teknikleri ve yeni tedavi yöntemleri eğitimi için yararlıdır kalp iskemik bir bölümünü oluşturur.

Bir Ameroid yılanı kullanarak domuz kronik kalp iskemi modelinde

Burada insan IPS-hücre cardiomyocytes eskiden şiling şimdi domuz modelinde türetilmiş bir kalp kası yama implantasyonu ve ardından sol ventrikül cryoinjury indüksiyon için bir iletişim kuralı mevcut.

HiPSC elde edilen kalp kası yamalar implantasyonu eskiden şiling şimdi domuz modelinde miyokardiyal yaralanma sonra

Burada, yeni kardiyokoruyucu stratejileri araştırmak için sıkı bir şekilde kurulan ve kullanılan ortootopik kalp transplantasyonunun klinik öncesi büyük hayvan (porcine) modelini tarif ediyoruz.

Ortootopik kalp transplantasyonunun klinik öncesi porcine modeli

Biz hücre tabanlı tedaviler için kök hücrelerin intramiyokardiyal uygulama etkisini ve güvenliğini test etmek için sol circumflex arter tıkanıklığı ve hızlı pacing tarafından indüklenen kalp yetmezliği bir domuz modeli kurmak için çalıştı.

Kök Hücre Tedavisi Için Post-miyokard Enfarktüsü Kalp Yetmezliği Domuz Modeli Oluşturma

Bu protokol, kalp yetmezliği ni modelleyen enfarktan farelerin epikardiyumuna 3Boyutlu biyobaskılı bir yama naklini amaçlamaktadır. Anestezi, cerrahi göğüs açıklığı, sol anterior inen kalıcı ligasyon (LAD) koroner arter ve kalbin enfarktüs bölgesine biyobbaskılı bir yama uygulaması ile ilgili ayrıntıları içerir.

Miyokard Enfarktüsü'nün Murine Modelinde 3Boyutlu Biyobaskılı Yama Transplantasyonu

Bu protokol, ekokardiyografi rehberliğinde virüsün doğrudan intramiyokard enjeksiyonu ile sıçan ve fare kalplerinde transgen ekspresyonu yöntemlerini açıklamaktadır. İzole, Langendorff perfüze edilmiş kalplerin programlanmış elektriksel stimülasyonu ile kalplerin ventriküler aritmilere duyarlılığının değerlendirilmesi için yöntemler de burada açıklanmaktadır.

Kemirgen Kalplerde Viral Transgen Ekspresyonu ve Kardiyak Aritmi Riskinin Değerlendirilmesi

Bu protokol, bir domuz modelinde kardiyoaktif terapötik ajanların uygulanmasının üç yöntemini açıklamaktadır. Dişi kara ırkı domuzları, (1) torakotomi ve transepikardiyal enjeksiyon, (2) kateter bazlı transendokardiyal enjeksiyon veya (3) juguler ven ozmotik mini pompa yoluyla intravenöz infüzyon yoluyla tedavi gördü.

Domuz Miyokard Enfarktüsü Modelinde Kardiyoaktif Terapötiklerin Verilmesi

Bu çalışma, sağkalım vakaları için sol mini torakotomi veya sağkalım dışı vakalar için orta hat sternotomi kullanan tavşanlarda akut bölgesel miyokardiyal iskemi ve reperfüzyon hasarının yüksek oranda tekrarlanabilir bir hayvan modelini göstermektedir.

Tavşanlarda İskemi ve Reperfüzyon Hasarı Modeli

Öğrenin iskemik kalp hastalığında gen tedavisinin güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmek için büyük hayvan modeli kullanımını. Bu yöntem klinik öncesi araştırmalar için güvenilir bir çerçeve sunar.

İskemik Kalpte Gen Tedavisinin Etkinliğini Değerlendirmek İçin Büyük Hayvan Modeli

Daha fazla video keşfet