Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Veziklin Alımı Analizi

Bu protokol, EV'leri hücresel düzeyde analiz etmek için sağlam bir metodoloji ve verimli EV alımı ve EV izleme analizi için pratik bir yaklaşım sağlar. Bu EV etiketleme yöntemi, EV'lerin ve boyaların birlikte çökeltilmesini ortadan kaldırır, böylece EV sinyallerini geliştirir. EV alımı, içselleştirilmiş EV'leri yüzeysel EV'lerden ayırt etmek için hacimsel analizle ölçülür.

EV'ler aktif kargodur, bu nedenle alımları biyokimyasal moleküllerin transferine izin verir. EV tabanlı ilaç dağıtımı ve kanser tedavisi üzerine araştırmalar için bu teknik bir değerlendirme aracı olabilir. EV alımı hücreler arası iletişimde rol oynar ve kanser biyolojisi, sinirbilim ve ilaç dağıtımı gibi çeşitli araştırma alanlarında araştırılır.

Bu protokol potansiyel olarak verimli EV alım testlerini kolaylaştırır. Hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin izolasyonu için, nanofiltrasyon bazlı mikroakışkan cihazın örnek odasına bir mililitre önceden işlenmiş hücre kültürü ortamı enjekte edin. Cihazı çalıştırmak için, cihazı tezgah üstü iplik makinesinde 3000 RPM'de 10 dakika döndürün.

Döndükten sonra, sıvıyı pipetleme veya aspirasyon yaparak atık odasından çıkarın, ardından hücre kültürü medyasının ek iki mililitresini işlemek için bu prosedürü iki kez tekrarlayın. Daha sonra, izole edilmiş EV'leri yıkamak için, numune odasına bir mililitre PBS enjekte edin ve cihazı tezgah üstü iplik makinesinde döndürün. EV'lerin immünofluoresan etiketlemesi için, 100 mikrolitre izole EV içeren cihazın elüsyon deliğine EV'ye özgü antikorun mililitresi başına bir mikrogram enjekte edin.

Daha sonra antikorun numune boyunca eşit dağılımını sağlamak için bir plaka çalkalayıcı üzerinde karanlıkta bir saat kuluçkaya yatırın. Ardından, elution deliğine yapışkan bir bant takın. Kalan antikorları yıkamak için numune odasına bir mililitre PBS enjekte edin, ardından numune odası boşalana kadar cihazı döndürün.

Numune odasına başka bir mililitre PBS enjekte ederek ve cihazı daha önce gösterildiği gibi döndürerek yıkamayı tekrarlayın. Artık sıvıyı odadan çıkardıktan sonra, floresan etiketli EV'leri membran odasından bir kehribar tüpüne veya mikro tüpe pipetle atın. Kullanıma kadar tüpü ışıktan koruyun.

Dördüncü PC3 hücrelerine dört kez 10 kez bir mililitre ortam ile 35 mililitrelik bir tabağa tohumlayın. Hücrelerin en uygun hücre kültürü koşullarında gece boyunca yapışmasını sağlar. Ertesi gün, yapışkan hücreleri ekzozom tükenmiş ortamla iki kez yıkayın.

Floresan etiketli EV'leri ekzozom tükenmiş ortam kullanarak uygun konsantrasyona seyreltdikten sonra, seyreltilmiş EV'leri yapışık hedef hücrelere ekleyin ve istenen deneysel süre boyunca kuluçkaya yatırın. Hücrelerin ekzozom içermeyen ortamla üç kez yıkanarak içselleştirilmemiş EV'leri çıkardıktan sonra, yapışık hücrelerin sitoplazmını mililitre başına bir mikrogram CMTMR ile etiketlenin ve optimal hücre kültürü koşullarında kuluçkaya yatırın. Canlı hücre görüntüleme için, hazırlanan hücreleri sahnedeki inkübatöre yerleştirin.

Görüntüleme parametrelerini kontrol örneklerine göre ayarladıktan sonra, 3D konfokal görüntüler elde etmek için hedef hücrelerin derinliğini ve Z yönünde istifleme boyutu aralığını belirleyin, ardından görüntü alımını aynı anda hem hücreye özgü boyanın hem de EV'ye özgü boyanın birden fazla Z yığılmış görüntüsüne ayarlayın. Görüntü işleme için otomatik görüntü işleme yazılımı kullanın. Hücrelerin sanal yüzeylerini oluşturmak için Yeni Yüzeyler Ekle'yi tıklatın.

Sanal hücre yüzeylerini yapılandırmak için Ekle düğmesini tıklatın ve filtre türü olarak Kalite'yi seçin. Görsel inceleme ile düşük sınır için uygun değeri eşikleyin, üst sınır için maksimum değeri ayarlayın ve SON düğmesini tıklatın sonra, EV'lerin sanal noktalarını oluşturmak için Yeni Noktalar Ekle düğmesini tıklatın. Algoritma Ayarları'nın altında Farklı Spot Boyutları ve En Kısa Mesafe Hesaplaması'nı seçin, ardından İleri'yi tıklatın ve kaynak kanal olarak Kanal 1 Alexa Fluor 488'i seçin.

Spot Algılama'nın altına tahmini XY çapı için uygun değeri girin ve İleri'yi tıklatın. Sanal EV noktalarını yapılandırmak için Ekle düğmesini tıklatın ve filtre türü olarak Kalite'yi seçin. Görsel bir incelemeyle alt eşiği ayarlayın ve Spot Bölgeler Türü için İleri'yi tıklatın, Mutlak Yoğunluk'u seçin ve İleri'yi tıklatın.

EV noktalarının bölgesini eşik için, görsel incelemeyle Bölge Eşiği için uygun değeri girin. Bölge Birimi altında çap'ı seçin ve Son'u tıklatın. Gruplanmış noktaları yerleşik yüzeyin içine bölmek için Yapı Noktaları'nı tıklatın ve Filtreler'e gidin.

Ardından Ekle düğmesini tıklatın ve filtre türü olarak Yüzeylere En Kısa Mesafe, Yüzeyler Yüzey 1'i seçin. Alt sınır için en düşük eşiği ve üst sınır için uygun değeri ayarladıktan sonra, Bölümü yeni Noktalara Çoğalt düğmesini tıklatın. Hücrelerin içindeki EV'lerin otomatik sayımı için Yerleşik Noktalar 1 seçimini tıklatın, İstatistikler'e gidin ve değeri Toplam Nokta Sayısı'ndan dışa aktarın.

Hücre sayısını elde etmek için, Yerleşik Yüzeyler 1'i tıklatın, sonra İstatistikler'e gidin ve Toplam Yüzey Sayısı değerini Genel'den dışa aktarın. Son olarak, birimi vermek için İstatistikler altındaki Ayrıntılı sekmesine gidin. Nanofiltrasyon tabanlı mikroakışkan bir cihaz kullanılarak PC3 hücre kültürü medyasından izole edilen EV'ler floro-4 konjuge EV'ye özgü antikor ile etiketlendi ve 3D konfokal mikroskopi kullanılarak görselleştirildi.

İçselleştirilmiş EV'ler puncta olarak görselleştirildi ve bu görüntülerin bireysel EV.Post işlenmesi, EV içselleştirmesinin hücrelere görselleştirilmesini ve nicelleştirilmesini sağlar. EV alma tahlil sonuçları, EV alım seviyesinin kuluçka süresinin uzunluğuna bağlı olduğunu gösterir. İçselleştirilmiş EV sayısı, belirtilen hücre için GERÇEK EV alma oranını belirlemek için alıcı hücre hacmine normalleştirilebilir.

Bu prosedür, içselleştirilmemiş EV'lerin sistematik olarak dışlanmasını ve içselleştirilmiş EV sayısının tam olarak ölçülmesine olanak tanır. İçselleştirilmiş EV noktalarının boyut dağılımı burada gösterilmiştir. Bu nedenle, temel adımlar EV etiketlemesi için mikroakışkan cihazın kullanılması, floresan EV'leri görselleştirirken arka plan floresanlarının en aza indirilmesi ve ardından içselleştirilmiş ve yüzeysel EV'leri belirlemek için görüntüleme sonrası analizdir.

Böylece hücre içi EV takibi 3D düzlemde gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilebilir ve ayrıca mekansal/zamansal çözünürlüklerde EV kaçakçılığı analizi ve evlerin hücre altı organellerle birlikte lokalizasyonu sağlanabilir. Bu nedenle, bu tekniğin EV'ler için hücresel iletişim alanındaki araştırmacılar için hücre içi ve hücre dışı matrislerdeki EV'leri araştırmak için daha kolay ve daha verimli bir yol sağladığına inanıyoruz.